The purpose of research is to study the ability of spring rapeseed genotypes of domestic and foreign selection to induce embryoids in anther culture in vitro, as well as the regeneration potential of formed embryoids and the fertility of androclinic plants obtained from them. Objectives: to introduce isolated anthers into in vitro culture, to determine the frequency of induction of embryoidogenesis of the studied genotypes and their regenerative capacity. Anthers were cultivated on B5 nutrient medium supplemented with 2,4-D at a concentration of 0.1 mg/l and NAA at a concentration of 0.1 mg/l. The content of iron chelate in the medium was increased to 12.5 mg/L. Embryoid induction was obtained in all studied genotypes. According to the ability to embryoidogenesis, the studied samples differed significantly. The maximum number of embryoids (9.26 %) was obtained from the Topas variety. Seven varieties – Avangard, Bulat, Visit, Lira, Lipetsky, Ratnik, Rubezh induced embryoids with a frequency of less than 1.0 %. With the development and accumulation of chlorophyll, the embryoids were transplanted onto a nutrient medium that did not contain growth regulators, where they were incubated until the development of shoots and roots. Seedlings with a well-developed root system and 3 true leaves were transplanted into the soil. During the flowering period of plants, the inflorescences were covered with insulators for the purpose of self-pollination and to exclude the ingress of foreign pollen. Many androclinic plants obtained from primary embryoids had reduced (underdeveloped) anthers. The bulk of these plants were haploids. Some plants had wrinkled or thickened parts of the anther. Cytological analysis showed that anthers with various deviations produce little pollen, most of which is sterile. Pollen diversity is one of the main factors of low seed set under the isolator. Androclinic plants with the presence of sterile pollen are promising for use in hybridization after their genetic analysis.
spring rapeseed, plants, anthers, embryoids, regeneration
Введение. В современной селекции особое внимание уделяется созданию генетического разнообразия сельскохозяйственных культур. Для этого используют отдаленную гибридизацию, мутагенез и трансформацию растений. В дополнение к этим методам в последние годы широко изучается изменчивость растений и клеток в условиях in vitro.
На сегодняшний день гаплоидные технологии являются неотъемлемой частью селекционных программ по созданию высокопродуктивных гибридов и сортов многих сельскохозяйственных культур, так как позволяют существенно сократить сроки получения исходного гомозиготного материала [1]. Гаплоиды ярового рапса получают с использованием культуры пыльников и микроспор на искусственных питательных средах.
Удвоенные гаплоиды, полученные на основе гибридов F1, обеспечивают возможность ускоренного получения гомозигот и сокращения объемов селекционной работы. Получение растений из микроспор в культуре пыльников является распространенным методом создания гомозиготных линий у многих видов Brassica [2, 3].
На получение андроклинных линий оказывают влияние условия выращивания донорных растений, предварительная обработка бутонов пониженной положительной температурой, состав питательной среды и условия культивирования пыльников [4–7]. Правильный подбор условий культивирования позволяет максимально реализовать андрогенетический потенциал растения. Но лимитирующим фактором остается влияние генотипа донорного растения, которое проявляется в частоте эмбриоидогенеза, качестве эмбриоидов и их регенерационной способности.
Цель исследований: изучить способность генотипов ярового рапса отечественной и зарубежной селекции к индукции эмбриоидов в культуре пыльников in vitro, а также регенерационный потенциал сформировавшихся эмбриоидов и фертильность полученных из них андроклинных растений.
Задачи: ввести в культуру in vitro изолированные пыльники, определить частоту индукции эмбриоидогенеза изучаемых генотипов и их регенерационную способность.
Материалы и методы. В качестве донорного материала использовались сорта ярового рапса отечественной (Авангард, Аккорд, Булат, Визит, Лира, Липецкий, Ратник, Рубеж) и зарубежной (Topas и гибрид Salsa) селекции. Предварительная оценка андрогенетического потенциала образцов с ценными признаками необходима для массового получения дигаплоидов, которые могут быть включены в селекционные программы. Также это является обязательным этапом при выполнении некоторых биотехнологических программ, например таких, как физический и химический мутагенез in vitro [8].
Сбор соцветий, определение стадии развития микроспор в пыльниках проводили согласно общепринятой методике, использующейся в лаборатории биотехнологии ЛНИИР [9]. Срезанные соцветия помещали в стакан с водным раствором гиббериллиновой кислоты в концентрации 0,1 мг/л на 48 ч в холодильник при температуре 4 °С. Далее соцветия стерилизовали в 7 % водном растворе «Domestos» в течение 10 мин последующим 3-кратным промыванием стерильной дистиллированной водой. Изолирование пыльников проводили в асептических условиях. Пыльники культивировали в темноте на питательной среде В5 с добавлением 2,4-Д и НУК в концентрациях 0,1 мг/л. На первом этапе инкубировали в течение 48 ч при температуре 35 °С в условиях термостата, на втором этапе – при 26 °С до формирования эмбриоидов. Сформировавшиеся эмбриоиды выдерживали при непрерывном освещении до появления хлорофилла. Зеленые эмбриоиды пересаживали на регенерационную питательную среду с концентрацией сахарозы, уменьшенной до 1 %, и без добавления регуляторов роста. Образовавшиеся проростки с хорошо развитой корневой системой и 3 настоящими листочками пересаживали в смесь почвы и песка в соотношении 3 : 1 и накрывали пластиковыми стаканами для акклиматизации в условиях теплицы.
В фазу цветения фертильные растения закрывали изоляторами, а стерильные (гаплоидные) подвергали воздействию колхицина с целью удвоения числа хромосом. Оценку жизнеспособности пыльцы проводили с помощью флуоресцеиндиацетата (FDA) [10].
Результаты и их обсуждение. Отзывчивые пыльники всех изучаемых сортов при культивировании на инициальной питательной среде формировали эмбриоиды следующих типов: семядольные (котиледольные), торпедовидные, сердцевидные, глобулярные и полиэмбриоиды. По способности к эмбриоидогенезу донорные сорта отличались между собой (табл.). Минимальная частота эмбриоидогенеза наблюдалась у сорта Ратник – 0,07 %, а максимальная индукция эмбриоидов составила 9,26 % – у сорта Topas. Различия с другими изучаемыми сортами достоверны.
Изучаемые генотипы отличались также и по способности к регенерации растений из первичных эмбриоидов (табл.). У сортов Авангард и Рубеж растения получить не удалось. Максимальное количество растений формировали эмбриоиды сортов Аккорд (20 растений) и Ермак (22 растения). В то же время эмбриоиды сортов Лира и Ратник имели 100 % регенерацию растений. Значительная часть (56,6 %) первичных эмбриоидов хорошо прорастала в нормальные растения на регенерационной питательной среде без содержания регуляторов роста.
У сорта Topas только сердцевидные и торпедовидные эмбриоиды прорастали на среде без содержания гормонов. Котиледольные эмбриоиды имели сросшиеся семядольные листочки, которые способствовали сдерживанию развития настоящих листьев. Стебель у таких эмбриоидов утолщался и на поверхности проростков формировались вторичные эмбриоиды. Регенерационная способность растений сорта Topas составила 23,5 %.
Андрогенез пыльников in vitro сортов ярового рапса
|
Сорт |
Количество, шт. |
Частота эмбриоидогенеза, % |
Получено растений, шт. (%) |
|
|
культивируемых пыльников |
эмбриоидов |
|||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Авангард |
1248 |
1 |
0,08 |
0 |
|
Аккорд |
1933 |
21 |
1,09 |
20 (95,3) |
|
Булат |
1585 |
3 |
0,19 |
2 (66,7) |
|
Визит |
3785 |
31 |
0,82 |
5 (16,1) |
|
Ермак |
2448 |
26 |
1,06 |
22 (84,6) |
Окончание табл.
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Лира |
2315 |
11 |
0,48 |
11 (100) |
|
Липецкий |
2171 |
10 |
0,46 |
9 (90,0) |
|
Ратник |
1514 |
1 |
0,07 |
1 (100) |
|
Рубеж |
832 |
1 |
0,12 |
0 |
|
Topas |
367 |
34 |
9,26 |
8 (23,5) |
|
Salsa |
214 |
4 |
1,87 |
2 (50,0) |
|
Всего |
18422 |
143 |
0,77 |
81 (56,6) |
|
НСР0,05 |
– |
– |
0,52 |
– |
Наблюдения за развитием андроклинных растений, полученных из первичных эмбриоидов, показали, что многие из них имели в цветках редуцированные пыльники. Основная масса таких растений представляла собой гаплоиды. На рисунке 1, а, показано растение с рыхлым цветком, лепестки широко раскрыты, маленькие редуцированные пыльники хорошо видны (классический вид гаплоидного цветка рапса). Помимо классических гаплоидных были выявлены растения с морфологическими изменениями в строении цветка. На рисунке 1, б, представлено соцветие андроклинного растения гибрида Salsa, у которого отсутствовали пыльники и тычиночные нити. Можно предположить, что данные растения являются стерильным компонентом, использованным при создании гибрида.
а б
Рис. 1. Соцветия цветущих андроклинных растений ярового рапса:
а – соцветие гаплоидного растения сорта Аккорд;
б – соцветие стерильного растения гибрида Salsa
Также были обнаружены растения с отклонениями в развитии пыльников (недоразвитые и утолщенные части пыльника). Цитологический анализ показал, что такие недоразвитые пыльники продуцируют очень малое количество пыльцы, большая часть которой является стерильной (рис. 2). Cтерильная пыльца на препарате не окрашивалась, а фертильная приобретала окраску от сиреневого до светло-бордового цвета.
Рис. 2. Пыльца в недоразвитых пыльниках (× 250)
Все полученные андроклинные растения во время цветения были закрыты изоляторами. Часть изолированных соцветий характеризовалась нормальным развитием цветков и пыльников, но при этом показала очень низкую завязываемость семян (1–3 шт.) (рис. 3, а). Анализ пыльцы этих растений выявил наличие большого числа стерильных пыльцевых зерен (рис. 3, б), что и стало причиной низкой завязываемости семян при проведении самоопыления.
а 
б 
Рис. 3. Пыльники и пыльцевые зерна андроклинного растения сорта Ратник:
а – цветок с нормальными пыльниками; б – смесь стерильной и фертильной пыльцы (× 250)
Можно предположить, что в процессе культивирования на искусственной питательной среде у некоторых эмбриоидов произошли генетические изменения, что привело к нарушениям развития во время микроспорогенеза.
В дальнейших исследованиях планируется выявлять андроклинные растения с наличием стерильной пыльцы для использования их в гибридизации.
Заключение. Проведенное исследование позволило выделить генотипы, отзывчивые к эмбриоидогенезу в культуре пыльников in vitro. Наибольшее количество эмбриоидов (9,26 %) было получено у сорта Topas. Также были выделены 4 донорных образца, обладающие высокой регенерационной способностью первичных эмбриоидов. Это сорта Аккорд (95,3 %), Ермак (84,6), Лира (100) и Ратник (100 %). Максимальное количество андроклинных растений получили у сортов Аккорд (20 шт.) и Ермак (22 шт.). Перечисленные выше сорта являются перспективными донорами для получения дигаплоидов в культуре пыльников in vitro и дальнейшего их использования в селекционных программах.
Часть андроклинных растений имела нарушения в развитии пыльников, продуцировавших очень малое количество пыльцы, большая часть которой была стерильной. Также были получены регенеранты с нормальным развитием пыльников, содержащие разнокачественную пыльцу (стерильную и фертильную). Андроклинные растения с наличием стерильной пыльцы перспективны для использования их в гибридизации.
1. Urazaliev K.R. Gaploidnye tehnologii v selekcii rasteniy // Biotehnologiya. Teoriya i praktika. 2015. № 3. S. 33–43.
2. Metod kul'tury pyl'nikov in vitro dlya sozdaniya udvoennyh gaploidov kapusty belokochannoy / E.G. Savenko [i dr.] // Ovoschevodstvo. 2017. № 1 (34). S. 44–47.
3. Sozdanie novogo ishodnogo materiala ozimogo rapsa s ispol'zovaniem mezhvidovoy gibridizacii, mutageneza i kul'tury in vitro / Ya.E. Pilyuk [i dr.] // Zemledelie i selekciya v Belarusi. 2021. № 57. S. 378–386.
4. Sozdanie gibridov kapusty belokochannoy (Brassica oleracea L. convar. capitata var. alba DC) novogo pokoleniya s ispol'zovaniem liniy udvoennyh gaploidov / V.F. Pivovarov [i dr.] // Sel'skohozyaystvennaya biologiya. 2017. T. 52, № 1. S. 143–151.
5. Kozar' E.V., Domblides E.A., Soldatenko A.V. Faktory, vliyayuschie na poluchenie DH-rasteniy v kul'ture mikrospor in vitro redisa evropeyskogo // Vavilovskiy zhurnal genetiki i selekcii. 2020. № 1 (24). S. 31–39.
6. Vliyanie inicial'nyh sred i dlitel'nosti holodovoy predobrabotki na effektivnost' androgeneza v kul'ture izolirovannyh pyl'nikov ozimoy pshenicy sorta Irkutskaya / I.V. Lyubushkina [i dr.] // Izvestiya IGU. Ser. Biologiya. Ekologiya. 2020. T. 34. S. 20–32.
7. Razumkova G.M. Poluchenie gaploidov v kul'ture pyl'nikov (ili mikrospor) // Razvitie zemledeliya v Nechernozem'e: problemy i ih reshenie: sb. tr. po itogam mezhdunar. nauch.-prakt. konf. SPb.; Pushkin, 2016. S. 98–103.
8. Mutagenez v kul'ture izolirovannyh mikrospor rapsa / K.Zh. Zhambakin [i dr.] // Biotehnologiya. Teoriya i praktika. 2015. № 3. S. 20–32.
9. Muravlev A.A., Artamonov A.A. Tehnologiya polucheniya udvoennyh gaploidov yarovogo rapsa: tehnolog. rekomendacii. M., 2009. 24 s.
10. Monahos S.G. Sozdanie chistyh liniy – udvoennyh gaploidov kapusty v kul'ture izolirovannyh mikrospor i selekciya F1-gibridov na osnove sovremennyh metodov biotehnologii: metod. rekomendacii. M.: Izd-vo RGAU – MSHA im. K.A. Timiryazeva, 2014. 42 s.
