Astrakhan, Astrakhan, Russian Federation
UDK 579.64 Сельскохозяйственная микробиология
UDK 58.071 Влияние микроорганизмов
The purpose of research is to study the enzymatic activity and degree of darkening of potato tubers grown using a biological product based on Bacillus atrophaeus VKPM V-11474, developed at the Department of Applied Biology and Microbiology of the Astrakhan State Technical University. The object of study is early potatoes of the Red Scarlett genus. The field experiment was carried out on agricultural fields in the Kamyzyak District of the Astrakhan Region. Potato cultivation was carried out using the following options: control – growing potatoes without treatment with biological products; Vitaplan SP (biological fungicide based on Bacillus subtilis) – a commercial biological product was selected for comparison and used in accordance with the recommendations for use; VP1 is a liquid form of a biological product based on B. atrophaeus VKPM V-11474. All studies were carried out using standard methods. During the work, studies were carried out on enzymatic activity (catalase, peroxidase, polyphenol oxidase, total amylases, α-amylase, β-amylase) and the degree of darkening of the pulp of potato tubers during the post-harvest period and at the end of 4 months of storage. As a result of studies of potato tubers grown using a biological product based on B. atrophaeus, it was established that there was no negative effect on the enzymatic activities occurring in the tubers both during cultivation and during storage. The advantage of a biological product based on B. atrophaeus is the ability to reduce the activity of amylases both in freshly harvested potatoes and during storage, which has a prolonged effect, reducing the likelihood of accumulation of reducing sugars and cold saccharification in tubers. It was found that the degree of darkening of the test samples using the biological product was less pronounced than in the control version. The research results allow us to recommend the use of a biological product based on B. atrophaeus VKPM V-11474 for the biological protection of early varieties of ware potatoes from Alternaria blight.
potato, biological product, enzymatic activity, catalase, peroxidase, polyphenol oxidase, amylase, degree of darkening of potato tuber pulp
Введение. Обеспечение населения страны безопасной, качественной и доступной сельскохозяйственной продукцией в настоящее время является основной стратегической целью достижения продовольственной безопасности в России [1].
Внедрение инновационных технологий и развитие экологически безопасных производств получения сырья и продукции – важные задачи «Стратегии национальной безопасности» [2].
Одним из приоритетных направлений в растениеводстве в настоящее время является переход на технологии выращивания, предусматривающие снижение или отказ от применения химических пестицидов с использованием интегрированных систем и биотехнологических подходов, одним из которых является применение различных биопрепаратов, биоудобрений, стимуляторов роста на основе микроорганизмов [3, 4].
Для обработки посевного материала, в процессе выращивания и при закладке на хранение сельскохозяйственного сырья и продукции, в настоящее время применяют микробные биопрепараты, разработанные на основе бактериальных штаммов Pseudomonas и Bacillus, которые способствуют максимальной сохранности качества и пищевой ценности продуктов, снижая микробиальную порчу и увеличивая продолжительность хранения продукции [5–7].
Однако очень мало исследований относительно аспектов, раскрывающих вопросы способности Bacillus проявлять антиоксидантные свойства, приводящих к их толерантности в неблагоприятных условиях окружающей среды как при выращивании сельскохозяйственной продукции, так и при хранении [8].
Применение микробных препаратов при выращивании и хранении в комплексе с повышенными температурами при выращивании и пониженными при хранении являются стрессовыми факторами для многих видов растительной продукции, оказывающими влияние на активность ферментов и, как следствие, на формирование качества продукции [6, 7].
Цель исследования – изучение ферментативной активности и степени потемнения клубней картофеля, выращенного с применением биопрепарата на основе Bаcillus atrophaeus ВКПМ В-11474, разрабатываемого на кафедре «Прикладная биология и микробиология» Астраханского государственного технического университета.
Задачи: провести анализ ферментативной активности и степени потемнения клубней раннего картофеля сорта Ред Скарлетт в полевом опыте и при последующем хранении.
Объекты и методы. Полевой эксперимент проводили на сельскохозяйственных полях в Камызякском районе Астраханской области. Объект исследований – ранний картофель сорта Ред Скарлетт. Исследования проводили согласно Методике полевого опыта [9, 10].
Определение активности ферментов и технологических свойств картофеля проводили на базе кафедры «Прикладная биология и микробиология» АГТУ.
Биопрепарат на основе штамма B. Atrophaeus ВКПМ В-11474 применялся в виде суспензии (ВП). Суспензию получали при непрерывном жидкофазном культивировании в промышленном ферментере на картофельно-глюкозной среде с титром жизнеспособных клеток не менее 109 КОЕ/мл.
Выращивание картофеля осуществляли с применением следующих вариантов: контроль – выращивание картофеля без обработки биопрепаратами; Витаплан СП (биологический фунгицид на основе Bacillus subtilis) – коммерческий биопрепарат выбран для сравнения, использован в соответствие с рекомендациями по применению (опрыскивание дна борозды перед посадкой, норма расхода 80 г/га); ВП1 – жидкая форма биопрепарата на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474, способ применения – опрыскивание дна борозды перед посадкой (1 %-й раствор. 300 л/га)+2 пролива под корень растений (100 мл/растение) в фазах бутонизации и массового цветения; ВП2 – двукратное опрыскивание растений (1 %-й раствор, 300 л/га) в фазах единичного цветения и в конце вегетации.
На хранение картофель закладывали после сбора урожая по окончании лечебного периода (14 суток при температуре 13–18 °С) насыпью при оптимальной температуре хранения для картофеля 1–4 °С в течение 4 месяцев.
Определение степени потемнения мякоти клубней картофеля в сыром и вареном виде проводилось визуальным методом. При визуальном определении степени потемнения картофеля были взяты образцы разных вариантов, разрезанные пополам. Одна половинка картофеля была сварена на пару для определения изменения цвета в вареном виде, вторая – оставлена на сутки на свету для определения степени потемнения мякоти в сыром виде. Учет потемнения проводился по следующей шкале, в баллах: 9 баллов – цвет не изменился; 7 баллов – слабое изменение цвета; 5 баллов – среднее окрашивание; 3 балла – сильное окрашивание; 1 балл – очень сильное окрашивание [11].
Активность ферментов (пероксидазы, каталазы, полифенолоксидазы, амилазы) определяли в клубнях до закладки на хранение (по окончании лечебного периода) и по окончании периода хранения.
Определение активности пероксидазы (ПО) проводили ферментативной реакцией окисления пирогаллола пероксидом водорода с образованием окрашенного соединения пурпурогаллина, количество которого оценивали фотоколориметрически (Фотометр КФК-3) и выражали в единицах оптической плотности раствора пурпурогаллина, образовавшегося под действием пероксидаз в расчете на 1 г растительной массы (далее ед. акт) [12].
Активность полифенолоксидазы (ПФО) на спектрофотометре ПромЭкоЛаб ПЭ-5300В определяли измерением оптической плотности продуктов реакции, образовавшихся при окислении пирокахетина за определенный промежуток времени, и выражали в относительных единицах на 1 г сырой ткани (далее ед. акт) [13].
Определение активности амилаз и каталазы проводили фотоколориметрически (Фотометр КФК-3) и выражали в мг гидролизованного крахмала на единицу времени в расчете на 1 г растительной массы (мг/ед. акт.) [12, 14].
Опыты проводили в 3 биологических и 3 аналитических повторностях. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью стандартных методов описательной статистики с использованием программ MS Excel [15]. Дисперсионный анализ цифровых данных полевого опыта осуществляли по Б.А. Доспехову [9], достоверность различий между вариантами определяли, сравнивая их с показателями наименьшей существенной разницы (НСР0,05).
Результаты и их обсуждение. Определение активности ферментов в клубнях картофеля до закладки на хранение показало (табл. 1), что в клубнях, выращенных при использовании биопрепарата на основе B. аtrophaeus, активность пероксидазы и каталазы находится практически на том же уровне, что и в контрольном варианте (табл. 1).
При закладке на хранение для всех образцов картофеля отмечена максимальная активность для полифенолоксидазы (ПФО) (табл. 1), при этом следует отметить повышенные значения в клубнях картофеля в вариантах, где применялась суспензия биопрепарата (ВП2), в сравнении с контролем (670,98 и 533,41 ед. акт. соответственно), практически незначительно уступая по активности ПФО в клубнях, выращенных при использовании коммерческого препарата Витаплан СП (677,25 ед. акт.).
Определение активности амилазы (суммарной, ɑ-амилазы и β-амилазы) показало (табл. 1), что применение биопрепарата на основе B. Atrophaeus ВКПМ В-11474 способствует значительному снижению активности данных ферментов в клубнях картофеля при закладке на хранение (в 6,45–7,8 раза), не уступая коммерческому препарату Витапалан СП (в 7,2 раза).
Таблица 1
Ферментативная активность в клубнях картофеля*, ед. акт.
|
Вариант опыта |
Пероксидаза |
Каталаза |
Полифенолоксидаза |
Амилаза суммарная |
α-амилаза |
β –амилаза |
|
Контроль |
0,02±0,0002 |
7,6±0,3 |
533,41±40,94 |
25,89±1,3 |
14,51±0,73 |
11,39±0,57 |
|
1,09±0,01 |
25±1,25 |
36,82±1,84 |
13,19±0,66 |
8,47±0,2 |
4,72±0,19 |
|
|
Витаплан, СП |
0,17±0,002 |
7,05±0,31 |
677,25±74,5 |
3,55±0,14 |
2,4±0,07 |
1,15±0,04 |
|
1,95±0,08 |
25,4±0,22 |
21,52±0,076 |
6,83±0,3 |
3,57±0,1 |
3,3±0,1 |
|
|
ВП1 |
0,07±0,007 |
8,0±0,32 |
592,98±65,23 |
4,01±0,04 |
2,71±0,1 |
1,3±0,04 |
|
1,24±0,037 |
22,45±1,12 |
32,93±1,55 |
8,1±0,3 |
2,86±0,1 |
5,25±0,16 |
|
|
ВП2 |
0,03±0,003 |
8,2±0,32 |
670,98±74,2 |
3,3±0,13 |
2,22±0,02 |
1,07±0,02 |
|
1,37±0,04 |
24,6±0,99 |
42,24±2,53 |
8,57±0,32 |
5,56±0,2 |
3,03±0,12 |
* – в числителе – до закладки на хранение; в знаменателе – по окончании хранения.
Учитывая то, что повышение уровней антиоксидантных ферментов каталазы, пероксидазы и полифенолоксидазы в ответ на воздействие стрессовых факторов окружающей среды является ключевым в защитных механизмах картофеля от проявления внешних агрессивных воздействий [16], можно предположить, что в целом применение суспензии биопрепарата на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474 способствует повышению иммунной системы клубней картофеля. Данное предположение подтверждается тем, что в полевом опыте перед уборкой урожая отмечена эффективность биопрепарата на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474 против развития такого заболевания, как альтернариоз, вызываемого Alternaria solani (табл. 2).
Кроме этого, присутствие бациллярных клеток и их экзометаболитов оказывает, вероятно, влияние на формирование химического состава ризосферы и ризопланы картофеля, что выражается в препятствовании всасывания присутствующих в почвах хлорид-ионов, имеющих функции активаторов амилаз. Данное предположение подтверждается тем, что в клубнях картофеля, выращенных с применением B. Atrophaeus ВКПМ В-11474, активность суммарной амилазы находится на минимальном уровне (3,3–4,01 ед. акт.) в сравнении с контролем (25,89 ед. акт.).
Таблица 2
Действие биопрепарата на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474 на развитие альтернариоза (Alternaria solani) на картофеле сорта Ред Скарлетт
|
Вариант |
Показатель развития, % |
||
|
Р* |
R** |
БЭ*** |
|
|
Контроль |
100,0 |
91,4 |
- |
|
Витаплан, СП (стандарт) |
96,9 |
65,2 |
28,7 |
|
ВП1 |
99,4 |
64,9 |
28,9 |
|
ВП2 |
99,8 |
67,1 |
26,6 |
|
НСР0,05 |
1,6 |
4,1 |
- |
* Р – распространение болезни, ** R – развитие болезни, *** БЭ – биологическая эффективность изучаемого препарата против заболевания.
Оценивая общие изменения работы ферментативных систем, утилизирующих активные формы кислорода (каталаза/пероксидаза), следует отметить, что за время хранения (4 месяца) отмечена некоторая перестройка ферментативных систем. Так, произошла перестройка оксидазных процессов: во всех образцах наблюдается увеличение активности как каталазы, так и пероксидазы, однако в разной степени. При определении активности пероксидазы (ПО) в клубнях картофеля во всех исследуемых вариантах наблюдается повышение активности ПО от 0,02–0,17 ед. акт. (до закладки на хранение) до 1,09–1,95 ед. акт. (по окончании хранения). В целом следует отметить, что активность ПО возросла в минимальной степени в клубнях, выращенных с применением биопрепарата B. atrophaeus ВКПМ В-11474 (17,7–45,7), в сравнении с контролем (в 54,5 раза). Рост активности пероксидазы показывает минимальные значения (в 11,5 раза) в варианте Витаплан СП, немногим больше (в 17,7 раза) в образце картофеля варианта ВП1, что является положительным фактором в формировании качества клубней в части снижения риска развития болезней при хранении.
Для каталазы в клубнях картофеля по окончании хранения также отмечено повышение данного показателя во всех исследуемых вариантах, но это повышение не такое существенное (2,8–3,6) в отличие от повышения активности ПО, что, вероятно, обусловлено тем, что чувствительность каталаз к низкой концентрации пероксида водорода ниже, чем у пероксидаз [16, 17].
Для ПФО по окончании периода хранения отмечается существенное снижение показателей (в 14,5–31,5 раза). Наибольшее снижение активности ПФО показали образцы Витаплан СП и ВП1, где снижение произошло в 31,5 и 18,0 раза соответсвенно, в варианте ВП2 – в 15,9 раза, что несколько выше, чем в контрольном варианте (в 14,5 раза).
В целом следует отметить, что при рассмотрении изменения активности ферментов в системе «полифенолоксидаза-каталаза-пероксидаза» образцы картофеля варианта ВП2 показали максимальные адаптационные изменения к окислительному стрессу в условиях хранения посредством перестройки ферментативных процессов.
Определение активности амилазы (суммарной, ɑ-амилазы и β-амилазы) показало (см. табл. 1), что по окончании периода хранения также происходит перестройка ферментативных процессов в клубнях картофеля, сопровождающаяся повышением активности данных ферментов в клубнях, которые выращивались при использовании биопрепаратов (Витаплан СП и на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474), тогда как в контроле активность данных ферментов снижается в среднем в 2 раза.
Следует отметить, что особенности изменения активности β-амилаз в образцах после хранения вполне коррелируют с данными по ɑ-амилазе, за исключением образца ВП1, в котором активность β-амилазы практически остается на первоначальном уровне.
Несмотря на то что при хранении картофеля, выращенного с применением биопрепарата на основе B. atrophaeus, отмечено увеличение активности амилаз в сравнении с контрольным вариантом, активность данной группы ферментов в обработанных биопрепаратами клубнях остается по окончании хранения значительно ниже активности в клубнях контрольного варианта.
В целом данная особенность свидетельствует о том, что применение биопрепарата на основе B. atrophaeus при выращивании раннего картофеля не только оказывает влияние на снижение активности амилаз в свежесобранном урожае картофеля, но и обладает пролонгированным действием.
Одним из основных технологических свойств, влияющих на качество картофеля, является степень потемнения мякоти клубней, влияние на данный показатель оказывают различные факторы, в том числе активность ферментов, содержащихся в картофеле [18–20].
Полученные данные (табл. 3) свидетельствуют о том, что потемнение мякоти клубней сырого и вареного картофеля, выращенного с применением биопрепарата на основе B. Atrophaeus, менее выражено, чем в контрольном варианте, что является важным условием при получении как столовых, так и технических сортов картофеля.
Таблица 3
Степень потемнения мякоти исследуемых образцов картофеля
|
Вариант |
Окраска |
Потемнение мякоти сырого картофеля, балл |
Потемнение мякоти вареного картофеля, балл |
|||
|
кожуры |
сырой мякоти |
после-уборочный период |
по окончании хранения |
после-уборочный период |
по окончании хранения |
|
|
Контроль |
Красный |
Светло-желтый |
5 |
3 |
7 |
6 |
|
Витаплан, СП (контроль) |
7 |
6 |
7 |
7 |
||
|
ВП1 |
8 |
7 |
8 |
8 |
||
|
ВП2 |
8 |
7 |
8 |
8 |
||
Заключение. В результате проведенных исследований установлено, что применение биопрепарата на основе B. atrophaeus не оказывает негативного влияния на формирование ферментативных активностей, происходящих в клубнях картофеля как при выращивании, так и при хранении, а также на степень потемнения мякоти клубней картофеля. Преимуществом биопрепарата на основе B. atrophaeus является способность снижения активности амилаз как в свежесобранном урожае картофеля, так и при хранении, что оказывает пролонгированное действие, снижая вероятность накопления в клубнях редуцирующих сахаров и холодового осахаривания.
Установлено, что степень потемнения опытных образцов с применением биопрепарата менее выражена, чем в контрольном варианте.
Результаты исследований позволяют рекомендовать применение биопрепарата на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474 для биологической защиты ранних сортов продовольственного картофеля от альтернариоза.
1. Ob utverzhdenii Doktriny prodovol'stvennoj bezopasnosti Rossijskoj Federacii: Ukaz Prezi¬denta RF ot 21 yanvarya 2020 g. № 20. URL: https://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_343386.
2. O strategii nacional'noj bezopasnosti v Rossij-skoj Federacii: Ukaz Prezidenta Rossijskoj Federacii ot 02.07.2021 g. № 400. URL: http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_389271.
3. Rubanov N.I., Fomin A.A. Rynok bioproduktov v rastenievodstve // Moskovskij `ekonomiches¬kij zhurnal. 2018. № 3. S. 2. EDN YHKJYD.
4. Fedorenko V.F., Mishurov N.P., Konovalen-ko L.Yu. Sovremennye tehnologii proizvodstva pesticidov i agrohimikatov biologicheskogo proishozhdeniya. M.: Rosinformagroteh, 2018. 124 s. EDN XXPNML.
5. Kiprushkina E.I., Kolodyaznaya V.S. `Eksperi-mental'noe obosnovanie biotehnologicheskih osnov hraneniya rastitel'nogo syr'ya // Doklady RASHN. 2003. № 3. S. 47–49.
6. Kiprushkina E.I., Kolodyaznaya V.S. Dinamika soderzhaniya fenol'nyh soedinenij pri hranenii klubnej kartofelya, obrabotannyh bioprepa-ratami // Nauchnyj zhurnal NIU ITMO. Ser. «Processy i apparaty pischevyh proizvodstv». 2013. № 2. S. 8–9.
7. Gorshkov V.V., Savina O.V. Vliyanie osennej obrabotki preparatom «Biopag» na pischevuyu cennost' i tehnologicheskie svojstva klubnej kartofelya pri dlitel'nom hranenii // Vestnik RGATU. 2016. № 1 (29). S. 18–22.
8. Bacillus: A Biological Tool for Crop Improvement through Bio-Molecular Changes in Adverse Environments / R. Ramalingam [et al.] // Front Physiol. 2017; 8: 667. Published online 2017 Sep 6. DOI:https://doi.org/10.3389/fphys.2017.00667.
9. Dospehov B.A. Metodika polevogo opyta (s osnovami statisticheskoj obrabotki rezul'tatov issledovanij). M.: Agropromizdat, 1985. 351 s.
10. Dolzhenko V.I. Metodicheskie ukazaniya po registracionnym ispytaniyam fungicidov v sel'skom hozyajstve. SPb.: VIZR, 2009. 378 s.
11. Agrosbornik.Ru. https://agrosbornik.ru 2011-2017. https://agrosbornik.ru/drygoe/377-2011-10-27-17-37-19.html
12. Novikov N.N., Tarazanova T.V. Laboratornyj praktikum po biohimii rastenij: ucheb. posobie. M.: Izd-vo RGAU-MSHA im. K.A. Timiryazeva, 2012. 97 s.
13. Fiziologicheskie i biohimicheskie metody ana-liza rastenij: praktikum / avt.-sost. G.N. Chupa¬hina; Kaliningr. un-t. Kaliningrad, 2000. 59 s.
14. Pat. RF 2027171. Sposob opredeleniya aktiv-nosti katalazy v biologicheskih ob`ektah / Shi-manov V.G., Mukimov T.H., Kuchinskij S.Yu., Aslidinov S.D., Halikov R.A.; patentoobladatel' Uzbekskij NII karakulevodstva. № 5000829/25; zayavl. 05.07.1991; opubl. 20.01.1995
15. Lyalin V.S., Zvereva I.G., Nikiforova N.G. Statistika: teoriya i praktika v Excel: ucheb. posobie. M.: Finansy i statistika, 2010. 448 s.
16. Kirgizova I.V., Gadzhimuradova A.M., Oma-rov R.T. Osobennosti nakopleniya antioksi-dantnyh fermentov u rastenij kartofelya v usloviyah bioticheskogo i abioticheskogo stressov // Izvestiya vuzov. Prikladnaya himiya i biotehnologiya. 2018. T. 8, № 4. S. 42–54. DOI:https://doi.org/10.21285/2227-2925-2018-8-4-42-54.
17. Vliyanie obrabotki klubneplodov biopreparatami na intensivnost' dyhaniya i aktivnost' oksidaz pri ih hranenii / V.S. Kolodyaznaya [i dr.] // Nauchnyj zhurnal NIU ITMO. Ser. «Processy i apparaty pischevyh proizvodstv». 2015. № 3. S. 64–70.
18. Bolieva Z.A., Basiev S.S., Kozaeva D.P. Ocenka potemneniya myakoti syrogo i vareno-go klubnya kartofelya gibridov selekcii FGBOU VO «Gorskij gosudarstvennyj agrarnyj univer-sitet» // Izvestiya Gorskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2016. T. 53, № 2. S. 27–31. EDN WCFZKZ.
19. Vershinina Yu.A., Anoshkina L.S. Ishodnyj material dlya selekcii kartofelya na prigodnost' k promyshlennoj pererabotke na hrustyaschij kartofel', krahmal i spirt // Dostizheniya nauki i tehniki APK. 2009. № 9. S. 15–17. EDN MEGJRB.
20. Gordeeva A.V., Udalova E.Yu. Ocenka kuli-narnyh kachestv gibridov kartofelya po priznaku potemneniya myakoti syryh i varenyh klubnej // Vestnik Marijskogo gosudarstven-nogo universiteta. Ser. «Sel'skohozyajst-vennye nauki. `Ekonomicheskie nauki». 2017. T. 3, № 3 (11). S. 7–12. EDN ZSIUUX.
