Russian Federation
UDK 637.045 Содержание белка
UDK 637.043 Содержание жира
UDK 637.3.04 Состав, компоненты сыра и других продуктов сыроделия
Cel' issledovaniya – izuchit' uroven' molochnoy produktivnosti i kachestva moloka korov altayskoy populyacii golshtinizirovannoy cherno-pestroy porody v svyazi s razlichnymi variantami gena kappa-kazeina (CSN3). Proizvodstvennoy bazoy dlya geneticheskih issledovaniy posluzhil plemennoy zavod AO «Uchhoz «Prigorodnoe», raspolozhennyy v g. Barnaule. Dlya izucheniya odnonukleotidnogo polimorfizma (SNP) gena CSN3 nami byli otobrany obrazcy krovi ot 100 korov plemennogo yadra v vozraste 2–3-y laktacii. Detekciya CSN3 SNP rs 43703017 (g.87390632A>G; Ser176Gly) provodilas' metodom PCR v real'nom vremeni. Ustanovleno, chto chasto vstrechayuschimsya genotipom kappa-kazeina v stade altayskoy populyacii krupnogo rogatogo skota cherno-pestroy porody yavlyaetsya CSN3AA – (57,1 ± 5,92) %, a naibolee chastoy allel'yu CSN3A – (74,3 ± 3,69) %. Allel' CSN3B i genotip CSN3BB vstrechaetsya u (25,7 ± 3,69) i (8,6 ± 0,34) % sootvetstvenno. Analiz produktivnyh pokazateley zhivotnyh v zavisimosti ot strukturnyh razlichiy v gene CSN3 pokazal, chto nesmotrya na tendenciyu k uvelicheniyu udoya u korov-nositel'nic geterozigotnogo genotipa CSNAB luchshimi syrodel'cheskimi kachestvami obladaet moloko, poluchennoe ot zhivotnyh s genotipom CSNBB, v kotorom soderzhitsya bol'she zhira na 0,01; 0,04 % i belka na 0,19; 0,11 % po sravneniyu s analogichnymi pokazatelyami u nositeley genotipov CSN3AA i CSN3AV. Naibol'shee soderzhanie suhogo veschestva v moloke i SOMO takzhe otmecheno u zhivotnyh nositeley genotipa CSN3BB – 13,24 i 8,72 %. Skorost' enzimaticheskogo (sychuzhnogo) svertyvaniya moloka byla vyshe u zhivotnyh s genotipom CSNVV na 6,6 i 15,8 % sootvetstvenno, chem u korov-nositeley genotipov CSNAA i CSNAV. Eto delaet moloko, poluchennoe ot zhivotnyh s genotipom CSNVV, naibolee vygodnym dlya proizvodstva syra.
kappa casein, CSN3, milk, milk fat content, milk protein content, cheese suitability
Введение. В Алтайском крае на долю молочного скотоводства приходится более половины от всего имеющегося поголовья крупного рогатого скота, поэтому оно служит основным фактором роста производства продуктов животноводства. В связи с этим развитие молочной отрасли является ключевым направлением для экономики края и невозможно без улучшения качества сырья, которое зависит от содержания белка в молоке. Белковомолочность во многом детерминирована генетическими факторами. Поэтому для ее повышения необходимо применение методов, позволяющих точно идентифицировать животных с желаемыми наследственными характеристиками, что в настоящее время возможно благодаря маркерной селекции [1–3].
До 80 % белков молока приходится на каппа-казеин. По химической структуре являясь фосфопротеином, он участвует в образовании мицелл молока, поэтому напрямую влияет на его сычужную свертываемость и термоустойчивость. Степень и сила этого влияния определяется полиморфизмом гена CSN3, кодирующего структуру каппа-казеина.
Из десяти идентифицированных на настоящий момент аллелей гена CSN3 у голштинизированного скота чаще всего встречаются два: А и В. Согласно данным отечественных и зарубежных исследователей, такие характеристики, как больший выход твердых и полутвердых сыров, лучшая свертываемость и более высокий процент белка в молоке, как правило, ассоциируются с В-аллелью [4–9].
Однако ряд исследований по выявлению ассоциативных связей между генетическими вариантами каппа-казеина и составом молока имеют несколько противоречивые результаты [10, 11]. Так, в некоторых популяциях не установлено достоверных и статистически значимых связей между химическим составом молока, его технологическими свойствами и полиморфизмом гена каппа-казеина [12]. Обусловлено это тем, что показатели молочной продуктивности кодируются множеством генов, и у различных популяций крупного рогатого скота фланирующие гены, с неизвестной функцией, могут быть несцепленными с генами QTL, специфическими аллелями или гаплотипами в маркерном локусе.
В связи с этим определение и анализ ассоциативных связей между полиморфизмом генов и продуктивными показателями в конкретной популяции животных, характеризующейся генетическими особенностями, является важным шагом для внедрения маркера вспомогательной селекции в практику селекционно-племенной работы.
Поэтому проведение генетического мониторинга алтайской популяции черно-пестрого скота является важным условием для улучшения технологических свойств молока. Особенно важна идентификация полиморфизма гена каппа-казеина. На настоящий момент на территории Алтайского края такой мониторинг в отношении маточного поголовья не проводился.
Материал и методы. Производственной базой для генетических исследований послужил племенной завод АО «Учхоз «Пригородное», расположенный в г. Барнауле. Из числа животных племенного ядра были отобраны 100 коров в период 2-3-й лактации. ДНК для генетических исследований была получена из образцов цельной крови с использованием набора реагентов «ДНК-экстран-2».
Генетические исследования проведены в «Лаборатории ДНК-диагностики животных» ФГБОУ ВО Алтайского ГАУ. Детекция SNP rs43703017 (g.87390632A>G; Ser176Gly) проводилась методом ПЦР в реальном времени с использованием реактивов для молекулярно-биологических исследований производства ООО «ДНК-синтез» (Россия).
Данные по уровню молочной продуктивности получены из базы данных ИАС «Селекс». Для оценки технологических свойств молока в период контрольной дойки в соответствии с ГОСТ 13928-84, ГОСТ 26809-86, ГОСТ 3622-68 были отобраны пробы молока.
Химический состав молока был определен с помощью автоматизированного измерительного комплекса «Лактан-700». Анализ массовой доли жира, массовой доли белка, массовой доли сухого обезжиренного молочного остатка (СОМО) и плотности в молоке проведен в соответствии с ГОСТ Р 8.563-96. Термоустойчивость молока определяли согласно ГОСТ 25228-82. Сычужная свертываемость молока была установлена по прописи З.Х. Диланяна [13]; активную кислотность молока определяли по ГОСТ 32892-2014. Определение титруемой кислотности молока проводили по ГОСТ 3624-92 при помощи потенциометрического анализатора.
Пересчет удоя с учетом базисной жирности проводили по ГОСТ Р 52054-2003 по базисной общероссийской норме массовой доле жира (3,4 %) и белка (3,0 %). Применялась следующая формула:
,
где Мжб – условное значение массы нетто молока, кг; Мф – фактическое значение массы нетто молока, кг; Жф – фактическое значение массовой доли жира, %; Бф – фактическое значение массовой доли белка, %; Жб – базисная общероссийская норма массовой доли жира, %; Бб – базисная общероссийская норма массовой доли белка, %.
Генетический и биостатистический анализ первичных экспериментальных данных осуществлен с помощью пакета программ MS Exсel 2010. Установление достоверности межгрупповой разницы проведено согласно критерию Стьюдента.
Результаты и их обсуждение. Использование для отбора и подбора животных информации о структуре гена каппа-казеина (CSN3) в процессе селекционно-племенной работы является вспомогательным методом, не отрицающим традиционные подходы.
Первый этап для внедрения этого метода – оценка генетического полиморфизма, которая позволяет проследить направление селекции, определить степень генетического равновесия стада, а главное, понять, достаточен ли уровень полиморфизма изучаемого гена для проведения отбора.
Проведенное генетическое тестирование коров исследуемой популяции позволило установить наличие двух аллелей изучаемого гена: CSN3 А и CSN3 В (рис. 1).
Рис. 1. Распространенность аллелей и генотипов гена CSN3 у коров голштинизированной
черно-пестрой породы (АО Учхоз «Пригородное»), %
Наиболее часто встречающимся генотипом каппа-казеина в стаде алтайской популяции черно-пестрого скота является CSN3AA – (57,1 ± 5,92) %, а наиболее частотой аллелью CSN3A – (74,3 ± 3,69) %. В то время как аллель CSN3B и генотип CSN3BB встречается у (25,7 ± 3,69) и (8,6 ± 3,35) % соответственно. Гетерозиготный генотип CSN3AB занимает промежуточное положение и встречается с частотой (34,3 ± 5,67) %.
Значение критерия χ2 для генотипов СSN3 – 0,7499, что указывает на стабильную генетическую структуру и отсутствие статистически значимых сдвигов в изучаемой популяции.
Эти данные соответствуют результатам целого ряда исследований [14–16], указывающих на то, что аллель CSNВ, отвечающего за сыропригодность молока, в генотипе отечественных популяций голштинской и черно-пестрой породы крайне низка.
Установленные нами генетические особенности изучаемой популяции по гену каппа-казеина могут быть обусловлены прилитием крови голштинского скота в нескольких поколениях.
Результатом голштинизации внутрипородных типов черно-пестрого скота стало появление животных с новыми хозяйственно-биологическими и продуктивными свойствами. Таким образом, следующим этапом настоящих исследований было изучение продуктивных показателей коров голштинизированной черно-пестрой породы в зависимости от структурных различий в гене CSN3 (рис. 2).
Анализ продуктивных показателей коров в зависимости от структурных различий в гене CSN3 показал, что наиболее эффективно проявили себя животные носители В аллеля СSN3. Так, наибольший удой за первые 305 дней лактации отмечен у коров носителей гетерозиготного генотипа CSN3АB, что на 0,6 и 1,9 % соответственно выше в сравнении с аналогичным показателем у животных с генотипами CSN3 АА и ВВ. В то же время большим содержанием жира (на 0,01 и 0,04 %) и белка (на 0,19 (Р ≤ 0,05) и 0,11 %) характеризовалось молоко, полученное от коров-носителей гомозиготного генотипа CSN3ВВ соответственно в сравнении с аналогичными показателями носителей генотипов CSN3АА и CSN3АВ (рис. 2).
Мы провели расчет молока в соответствии с базисной общероссийской нормой массовой доли жира (3,4 %) и белка (3,0 %), чтобы была возможность более детально сравнить молочную продуктивность животных с разными показателями жира и белка в молоке. Наибольшее количество молока базисной жирности получено от коров с генотипом CSN3ВВ, что на 4,8 и 2,3 % выше, чем у животных с генотипами CSN3АА и CSN3АВ. Полученные нами результаты согласуются с данными, представленными рядом отечественных и зарубежных исследователей [17–21], которые указали на более высокий процент белка, казеина и жира в молоке, полученного от коров с аллелем каппа-казеина B. Это происходит потому, что изменение нуклеотидной последовательности в аллели CSN3B усиливает экспрессию каппа-казеинового белка.
Питательные и технологические свойства молока напрямую зависят от содержания в нем сухого вещества (табл. 1).
а
б
*Р ≤ 0,05; **Р ≤ 0,01; ***Р ≤ 0,001 – разница статистически достоверна в сравнении
с генотипом СSN3АА
Рис. 2. Оценка взаимосвязи между генотипами каппа-казеина (CSN3)
и молочной продуктивностью коров: а – удой, кг; б – процентное содержание жира
и белка в молоке, %
Таблица 1
Взаимосвязь между генотипами каппа-казеина (CSN3)
и химико-физическими свойствами молока
|
Показатель |
Генотип |
||
|
СSN3АА |
СSN3АВ |
СSN3ВВ |
|
|
Сухое вещество, % |
13,18±0,097 |
13,14 ±0,076 |
13,24±0,083 |
|
СОМО, % |
8,69±0,029 |
8,65±0,018 |
8,72±0,043 |
|
Плотность, кг/м |
30,1±0,193 |
30,1±0,142 |
30,49±0,259 |
|
Лактоза, % |
4,78±0,016 |
4,76±0,012 |
4,79±0,022 |
|
Точка замерзания, °С |
–0,529 |
–0,529 |
–0,529 |
Установлено, что у исследуемых животных с генотипом CSN3BB доля сухого вещества в молоке выше на 0,4 и 0,7 % , а СОМО – на 0,03 и 0,07 % соответственно с аналогичными показателями в молоке, полученном от коров-носителей генотипов CSN3АА и CSN3АВ.
Более высокое содержание лактозы, сухого вещества и СОМО в молоке коров с генотипом CSN3BB также способствует повышению его плотности на 0,39 кг/м, в сравнении с другими генотипами.
Двумя наиболее важными технологическими характеристиками молока являются термоустойчивость, т. е. способность выдерживать пастеризацию без коагуляции белков, и сычужная свертываемость (сыропригодность), т. е. способность казеина молока под действием сычужного фермента образовывать достаточно плотные белковые сгустки [22, 23]. Результаты анализа по этим показателям приведены в таблице 2.
Таблица 2
Характеристика сычужной свертываемости и термоустойчивости молока
в зависимости от генотипа CSN3
|
Показатель |
Генотип |
||
|
СSN3АА |
СSN3АВ |
СSN3ВВ |
|
|
33,7 ± 0,77 |
31,4 ± 0,74 |
27,1 ± 0,52*** |
|
|
Термоустойчивость, класс |
I |
I |
I |
*Р ≤ 0,05; **Р ≤ 0,01; ***Р ≤ 0,001 – разница статистически достоверна в сравнении с генотипом СSN3АА.
Термоустойчивость молока в зависимости от генотипа CSN3 не отличалась. В то же время в исследованиях некоторых авторов показаны противоречивые результаты. Bruno Garcia Botaro с соавторами [24] предположили, что молоко у коров с генотипом каппа-казеина AA более стабильно в тесте на этанол, вместе с тем, согласно данным R.T. Paterson [25], молоко коров с каппа-казеином, экспрессируемым геном CSNВВ, более устойчиво к пастеризации.
Сычужная (энзиматическая) свертываемость молока у животных носителей генотипа CSNВВ происходит быстрее, чем у коров с генотипами CSNАА и CSNАВ, на 6,6 и 15,8 % соответственно. Это делает молоко, полученное от животных с генотипом CSNВВ, наиболее выгодным для производства сыра и переработки. Полученные нами данные соответствуют результатам исследований [4], которые также указывают на то, что молоко коров-носителей генотипа ВВ лучше
подходит для производства сыра. Молоко с
ВВ-вариантом каппа-казеина, по разным данным, имеет меньшее время свертывания (на 10–40 %) и более высокую плотность сгустка (до 140 %), чем молоко, полученное от животных, в генотипе которых присутствует аллель А гена CSN3 [26]. Установленные нами закономерности состава и свойств молока у животных с генотипом CSN3ВВ, вероятно, связаны с более стабильной структурой мицелл за счет уменьшения их размера и увеличением содержания в них каппа-казеина, обладающего переменной степенью гликозилирования. Увеличение соотношения каппа-казенина к общему казеину способствует более активному связыванию белков кальцием, что приводит к ускорению коагуляции и образованию более плотного белкового сгустка [27].
Важным показателем, влияющим на плотность и эластичность сгустка, а также на процесс созревания сыра, является кислотность молока. В связи с этим нами проведена оценка кислотности молока, а полученные результаты были переведены в градусы Тернера (табл. 3).
Таблица 3
Проверка кислотности молока у коров с разным генотипом CSN3
|
Показатель, °Т |
Генотип |
||
|
CSN3AA |
CSN3AB |
CSN3BB |
|
|
Активная кислотность |
7,1 |
7 |
7 |
|
Титруемая кислотность |
20 |
15 |
15,5 |
Сычужная свертываемость, в т. ч. плотность сгустка, во многом зависит от величины активной кислотности молока, так как скорость свертывания прямо пропорциональна снижению рН за счет увеличения степени перехода сычужного энзима в сырную массу [28]. Наибольшая активная кислотность молока установлена у коров с генотипом CSNАА, так как ее титруемая кислотность равна 20, это больше, чем у животных с генотипом CSNАА и CSNАВ, на 30 % (табл. 4).
Заключение. Таким образом, установлено, что в популяции голштинизированного приобского типа черно-пестрой породы наиболее часто встречающимся генотипом является CSNAA, связанный у данных животных с более высоким удоем, в то время как альтернативный генотип CSNВВ, влияющий на сыропригодность, встречается редко. Поэтому для улучшения качественных показателей молока и повышения его сыропригодности необходимо помимо традиционных критериев подбора учитывать и полиморфизм гена каппа-казеина (СSN3), что позволит получить больше потомков с гомозиготным генотипом CSN3ВВ.
1. Afanas'eva A.I., Sarychev V.A., Pleshakov V.A. Allel'nyj polimorfizm gena kappa-kazeina (CSNZ) u bykov-proizvoditelej cherno-pestroj porody // Vestnik Altajskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2021. № 9 (203). S. 44–49. DOI: 10.53083/ 1996-4277-2021-203-09-44-49. EDN IPEPNK.
2. Afanas'eva A.I., Sarychev V.A. Harakteristika geneticheskogo profilya krupnogo rogatogo skota cherno-pestroj porody na osnove dnk-diagnostiki po genam kappa-kazeina (CSN3), beta-laktoglobulina (BLG), al'fa-laktal'bumina (LALBA) i leptina (LEP) // Vestnik Altajskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2022. № 5 (211). S. 48–52.
3. Stolpovskij Yu.A. Genomnaya selekciya. I. Pos¬lednie tendencii i vozmozhnye puti razvitiya // Genetika. 2020. T. 56, № 9. S. 1006–1017.
4. Shajdullin R.R. Syroprigodnost' moloka cherno-pestryh korov s raznymi genotipami kappa-kazeina i diacilglicerol O-aciltransferazy // Izvestiya Samarskoj gosudarstvennoj sel'sko¬hozyajstvennoj akademii. 2020. № 2. S. 59–63.
5. Zinov'eva N.A., Gladyr' E.A., Frolkin D.A. Primenenie DNK-diagnostiki dlya analiza genov-kandidatov lokusov kolichestvennyh priznakov sel'skohozyajstvennyh zhivotnyh // Zhivotnovodstvo XXI vek: nauch. tr. VIZh. Dubrovicy: Izd-vo VNII zhivotnovodstva, 2001. Vyp. 61. S. 218–224.
6. The influence of CSN3 and LGB polymorphisms on milk production and chemical composition in Romanian Simmental cattle / R.I. Neamt [et al.] // Acta Biochim Pol. 2017. № 64 (3). P. 493–497. DOI:https://doi.org/10.18388/abp. 2016_1454.
7. Curi R.A. Effects of CSN3 and LGB gene poly¬morphisms on production traits in beef cattle / R.A. Curi [et al.] // Gen. Mol. Biol. 2005. № 28. P. 262–266.
8. Trocenko I.V., Ivanova I.P. Vzaimosvyazi mezhdu priznakami produktivnosti u moloch-nogo skota // Vestnik KrasGAU. 2022. № 3 (180). S. 93–100. DOI:https://doi.org/10.36718/1819-4036-2022-3-93-100.
9. Lefler T.F., Krasheninnikova I.V. K voprosu o vliyanii genotipa na produktivnye kachestva korov // Vestnik KrasGAU. 2022. № 5 (182). S. 170–176. DOI:https://doi.org/10.36718/1819-4036-2022-5-170-176.
10. Safina N.Yu., Yul'met'eva Yu.R., Shakirov Sh.K. Vliyanie kompleksa polimorfizma genov κ-kazeina (CSN3) i prolaktina (PRL) na moloch¬nuyu produktivnost' korovpervotelok golshtins¬koj porody // Molochnohozyajstvennyj vestnik. 2018. № 1 (29). S. 74–82. EDN YWNTLG.
11. Loretc O.G., Matushkina E.V. Vliyanie genoti-pa kappa-kazeina na tehnologicheskie svojs-tva moloka // Agrarnyj vestnik Urala. 2014. № 3 (121). S. 23–26. EDN SGWXRN.
12. Molecular marker technologies and selection for the traits of economic interest / M. Ste-vanovic [et al.] // Biotech. Anim. Husb. 2000. № 16. P. 25–34.
13. Inihov G.S., Brio N.P. Metody analiza moloka i molochnyh produktov M.: Pischevaya pro-myshlennost', 1971. 423 s.
14. Alipanah M., Kalashnikova L., Rodionov G. Kappa-casein genotypic frequencies in Russian breeds Black and Red Pied cattle // Iran J. Biotechnol. 2005. № 3. P. 191–194.
15. Zagidullin L.R. Polimorfizm genov kappa-kazeina i diacilglicerol o-aciltransferazy u cherno-pestrogo skota // Molochnohozyajst-vennyj vestnik. 2020. № 1 (37). S. 24–34.
16. Ovsyannikova G.V., Borodina E.Yu. Polimor-fizm gena kappa-kazeina i ego svyaz' s tehno-logicheskimi svojstvami moloka u krasno-pestrogo skota // Studencheskij nauchnyj forum – 2016: mat-ly VIII Mezhdunar. stud. `elektron. nauch. konf. 2016. URL: https://scie-nceforum.ru/2016/article/2016025862 (data obrascheniya: 04.06.2022).
17. Yarlykov N.G., Tamarova R.V. Ispol'zovanie markernoj selekcii dlya polucheniya syrop-rigodnosti moloka korov / Ros. gos. agrar. un-t MSHA im. K. A. Timiryazeva, Fond «Pepsiko», In-t mezhdunar. obrazovaniya. M.: Izd-vo RGAU-MSHA, 2016. 115 s.
18. Molochnaya produktivnost' korov holmogor¬skoj porody s raznymi genotipami molochnyh belkov / I.E. Bagal' [i dr.] // Molochnoe i myas-noe skotovodstvo. 2015. № 7. S. 6–9.
19. Reproductive quality of cows of different genotypes on Csn3 and Dgat1 genes depending on milk level / A.S. Ganiev [et al.] // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. 2018. № 9 (6). P. 1504–1508.
20. Houaga I. Polymorphisms in major milk protein genes (LALBA, MBLG, CSN1S1 and CSN3) and milk fat genes (DGAT1 and SCD1) and association with milk production and fatty acid traits in indigenous white Fulani and borgou cattle breeds in benin: doctor of philosophy // Pan African university institute for basic scien-ces, technology and innovation, 2018. P. 145.
21. Ketto I.A., Qyass J., Andqy T. The influence of milk protein genetic polymorphism on the physical properties of cultured milk // International Dairy Jounal. 2018. Vol. 78, № 3. P. 130–137.
22. O'Connell J., Fox P. Heat-Induced Coagulation of Milk. In book // Advanced Dairy Che¬mistry – 1 Proteins, 2003. P. 879–945. DOI:https://doi.org/10.1007/978-1-4419-8602-3_25.
23. Singh H. Heat stability of milk // International Journal of Dairy Technology. 2004. № 57. P. 111–119.
24. Bruno G.B., Real de Lima Y.V., Cortinhas C.S. Effect of the kappa-casein gene polymorphism, breed and seasonality on physicochemical characteristics, composition and stability of bovine milk // R. Bras. Zootec. 2009. Vol. 38 (12). P. 2447–2454. DOI: 10.1590/ S1516-35982009001200022.
25. Paterson R.T., Kiruiro E., Arimi H.K. Calliandra calothyrsus as a supplement for milk production in the Kenya highlands // Trop. Anim. Health Prod. 1999. № 31 (2). P. 115–126.
26. Selection and Treatment of Milk for Chee-semaking, Cheese (Fourth Edition) / Ram R. Panthi [et al.] // Academic Press. 2017. P. 23–50. DOI:https://doi.org/10.1016/B978-0-12-417012-4.00002-8.
27. Composite β-κ-casein genotypes and their effect on composition and coagulation of milk from Estonian Holstein cows / M. Vallas [et al.] // Journal of dairy science. 2012. № 95. P. 6760–6769. DOI:https://doi.org/10.3168/jds.2012-5495.
28. Vitushkina M.A., Dulepova M.A. Syroprigod-nost' moloka pri proizvodstve syrov // Vestnik nauki. 2020. T. 5, № 8 (29). S. 59–63. EDN SSNNVZ.
