Введение. Основной тенденцией развития овцеводства в последние десятилетия во всем мире является устойчивый рост производства баранины, что определяет увеличение доли специализированных мясных пород и возрастающие требования к качеству баранины [1, 2]. Маркер-ассоциированная селекция может быть одним из инструментов ускорения этого процесса. Исследования генетико-биохимических основ фенотипического полиморфизма признаков, определяющих мясную продуктивность, ведутся уже многие десятилетия. Известно, что большинство показателей продуктивности находится под совместным контролем значительного числа генов. Однако применение генетических маркеров в повышении мясной продуктивности овец по сравнению с другими видами сельскохозяйственных животных до настоящего времени является менее разработанной областью. Тем не менее выявление генов, ассоциированных с мясной продуктивностью, может быть перспективным, поскольку признаки, определяющие рост костной, мышечной и жировой тканей, характеризуются невысокой наследуемостью [3].Ген кальпаина является одним из генов, который может быть использован в качестве маркера мясной продуктивности овец. Белок кальпаин, кодируемый геном CAPN, принадлежит семейству цитоплазматических кальцийзависимых протеиназ с папаиноподобной активностью [4]. Клеточный протеолитический аппарат высокоселективен и строго регулируется, так как избыточная деструкция жизненно необходимых белков или замедленная деградация короткоживущих регуляторных белков могут существенно изменить клеточные функции. Этот механизм, по всей видимости, у многих прокариот – результат совместной деятельности кальпаинов, лизосомальных катепсинов и протеасом [5]. Высоковариабельная структура обнаруженных последовательностей кальпаинов и кальпаиноподобных молекул свидетельствует о широком разнообразии выполняемых ими клеточных функций. Кальпаины принимают участие в основных кальцийзависимых клеточных процессах – передаче сигнала, клеточном цикле, пролиферации, дифференцировке, слиянии мембран, формировании мышечных волокон [6, 7]. Разрушение молекулярных комплексов прикрепления цитоскелета к мембране является наиболее выраженной функцией кальпаинов и подтверждается тем, что более 30 белков цитоскелета чувствительны к кальпаинам [8]. Ряд исследований показал, что кальпаин-кальпастатиновая система регулирует рост скелетных мышц, ускорение которого может быть результатом уменьшения деградации мышечного белка за счет снижения уровня кальпаина и увеличения активности кальпастатина [9].Таким образом, полиморфные варианты гена кальпаина могут оказывать фенотипические эффекты на прижизненные количественные признаки у сельскохозяйственных животных, являющиеся внешним проявлением внутренних процессов, контролируемых кальпаиновой системой. Это свойство определило интерес к изучению полиморфизма кальпаина у некоторых пород овец [10–12]. Однако в породах овец российской селекции, а также при использовании зарубежного генофонда выполнено недостаточно исследований полиморфизма гена кальпаина, что определило актуальность настоящей работы.Цель исследования – изучение фенотипического эффекта генотипов полиморфного гена кальпаина (CAPN1) на живую массу у овец пород калмыцкая курдючная и их помесей с породами шароле и дорпер для обоснования возможности генетического маркирования продуктивности в раннем возрасте.Объекты и методы. Исследование проведено на базе хозяйства «АРЛ» (Республика Калмыкия, Яшкульский район). В хозяйстве используется пастбищно-стойловая система содержания, при которой 285 дней – пастбищный период. Трава естественных пастбищ, представленная в основном полынью, несколькими видами дерновидных злаков (ковыли, типчаки) и солянкой, занимает 75–80 % годового рациона овец. Дополнительно, в соответствии с физиологическим состоянием овцематок, используется около 7–10 % концентрированных кормов и 10–17 % заготовленных грубых кормов. Таким образом, их основной рацион состоит из 3–4 кг травы злаково-полынного пастбища, 1,5 кг злаково-бобового сена, 0,25 кг концентрированного корма (50 % ячменя, 40 % кукурузы, 10 % шрота подсолнечникового) и 0,08 кг минеральной подкормки.Отбор образцов для генотипирования и учет показателей продуктивности проводили от животных калмыцкой курдючной породы (КК) мясо-сального направления продуктивности, шароле (Ш) мясо-шерстного направления продуктивности, а также помесей с шароле и дорпер (Д) – мясного направления продуктивности. Схема скрещивания была следующей: бараны-производители КК (n = 6), возраст 4,5 года, живая масса 89,3±1,1 кг; бараны-производители Ш (n = 2), возраст 3,5 года, живая масса 80,3 ± 1,1 кг; овцематки КК (n = 40): 20 – для чистопородного скрещивания, 20 – с баранами Ш, возраст 3–4 года, живая масса 62,3 ± 0,32 кг; овцематки ½Д×½КК (n = 40) возраст 3–4 года, живая масса 62,9 ± 0,31 кг.Численность и распределение потомства по полу: группа 1 – КК (n = 26: ♂14 и♀12); группа 2 – ½Ш×½КК (n = 32: ♂12 и ♀20), группа 3 – ½Ш×¼Д×¼КК (n = 50: ♂16 и ♀34).Экстракцию ДНК проводили из цельной крови овец набором ДНК-Экстран-1 («Синтол», Москва) согласно инструкции, предоставленной фирмой-производителем. Образцы геномной ДНК животных анализировали с использованием технологии HRM-анализа на приборе CFX96 (BioRad, США). Использовали следующие праймеры: F 5’-AACATTCTCAACAAAGTGGTG-3’ и R 5’-ACATCCATTACAGCCACCAT-3’. Условия проведения амплификации и HRM-анализа были следующими: 1) 95 °С – 4 мин; 2) (94 °С – 45 с, 62 °С – 45 с, 72 °С – 45 с) × 45 циклов; 3) 72 °С – 7 мин [13, 14]. Анализ результатов проводили с помощью программного обеспечения для HRM-анализа Precision Melt Analysis™ software.Живую массу животных разных генотипов устанавливали путем взвешивания. У молодняка учитывали данный показатель при рождении и в 4 месяца. По разности значений и периода учета определяли среднесуточный прирост. Полученный материал обрабатывали биометрически, используя программу MS Excel. Достоверность различий сравниваемых показателей по группам оценивали по критерию Стьюдента с уровнем значимости не ниже p < 0,05.Результаты и их обсуждение. При генотипировании использовали HRM-анализ (High Resolution Melts, HRM), основанный на определении различий в кривых плавления (диссоциации ДНК) после проведения ПЦР в реальном времени с помощью специального программного обеспечения. При плавлении продукта ПЦР двойная спираль ДНК диссоциирует с высвобождением интеркалирующего красителя и снижением уровня флуоресценции. Скорость этого процесса в зависимости от температуры отслеживается с помощью специального программного обеспечения, которое преобразует полученные данные в график кривой плавления. Изменения в графике могут быть очень небольшие, в доли градуса, однако этого достаточно, чтобы выявить однонуклеотидные замены (SNP), небольшие инсерции, делеции и метилирование ДНК [15].Визуализация результатов генотипирования представлена на рисунке.   Результаты HRM-анализа в программе PrecisionMeltAnalysisТМsoftware  Характеристика популяционных частот аллелей С и Т CAPN1 среди чистопородного поголовья овец калмыцкой курдючной породы и ее помесей от скрещивания с породами шароле и дорпер приведена в таблице 1.   Таблица 1Частоты аллелей С и Т CAPN1 у овец калмыцкой курдючной породы и ее помесей от скрещивания с породами шароле и дорпер АллельБараныОвцематкиМолоднякБаранчикиЯрочкиПородная принадлежностьККККККС 0,667±0,080,500±0,050,231±0,030,214±0,060,250±0,07Т0,333±0,080,500±0,050,769±0,030,786±0,060,750±0,07 ШКК½Шх×½ККС0,750±0,220,500±0,050,344±0,030,417±0,080,300±0,05Т0,250±0,220,500±0,050,656±0,030,583±0,080,700±0,05 Ш½ККх½Д½Ш×¼Д×¼ККС 0,750±0,220,550±0,020,540±0,020,500±0,060,559±0,03Т0,250±0,220,450±0,020,460±0,020,500±0,060,441±0,03  Анализ данных показывает, что частоты аллелей С и Т различны у родителей и потомства как при чистопородном разведении, так и при скрещивании. Так, у баранов-производителей и овцематок калмыцкой курдючной частота аллеля С составила 0,667 и 0,500 соответственно, тогда как у чистопородного потомства наблюдалось повышение частоты аллеля Т до 0,769, при снижении встречаемости аллеля С до 0,231. Аналогичное изменение частоты встречаемости аллелей наблюдалось и в группе помесного молодняка при использовании породы шароле. Если у баранов и овцематок аллель Т выявлялся с частотой 0,250 и 0,500, то у потомства его концентрация повысилась до 0,656, тогда как аллель С у родителей выявлялся с частотой 0,750 и 0,500, а у потомства его распространение снизилось до 0,344. Меньшие изменения в частоте встречаемости аллелей отмечались в потомстве, полученном от помесных калмыцких курдючных с породой дорпер овцематок и баранов породы шароле: аллели С и Т выявлялись практически с той же частотой, что и у матерей. При этом следует отметить, что в сравнении с потомством других вариантов разведения в этой группе было несколько большее переопределение в пользу аллеля С, что определило его большую частоту.Сравнивая частоты аллелей среди всех групп, можно заключить, что среди баранов-производителей обеих пород в гене CAPN1 чаще выявлялись носители аллеля С, тогда как среди чистопородных и помесных маток носительство аллелей С и Т было практически равным; среди молодняка – у чистопородных и двухпородных помесей преобладали особи с аллелем Т, тогда как трех породных – носители аллеля С.Анализ распределения генотипов в исследованных вариантах скрещивания и чистопородного разведения включал оценку соответствия наблюдаемого распределения генотипов теоретически ожидаемому согласно уравнению Харди-Вайнберга (табл. 2).  Таблица 2Распределение генотипов и оценка генетического равновесия (χ2) в CAPN1 у овец калмыцкой курдючной породы и ее помесей от скрещивания с породами шароле и дорпер, % ГенотипБараныОвцематкиМолоднякБаранчикиЯрочкиПородная принадлежностьККККККНОНОНОНОНО1234567891011СС33,344,440,025,015,45,314,34,616,76,3СТ66,744,420,050,015,435,514,333,716,737,5ТТ0,011,140,025,069,259,271,461,766,756,3Окончание табл. 21234567891011χ20,312,052,000,420,30 ШКК½Ш×½ККСС50,056,340,025,025,011,833,317,420,09,0СТ50,037,520,050,018,845,116,748,620,042,0ТТ0,06,340,025,056,343,150,034,060,049,0χ21,332,053,660,991,16 Ш½ Д×½ КК½Ш×¼Д×¼ККСС50,056,335,030,324,029,212,525,029,431,2СТ50,037,540,049,560,049,775,050,052,949,3ТТ0,06,325,020,316,021,212,525,017,619,5χ21,330,280,550,810,02Примечание: Н – наблюдаемые; О – теоретически ожидаемые значения; отклонение Н от О по закону Харди-Вайнберга значимо при χ2 ≥ 3,84.  Полученные данные не выявили ни в одной из групп достоверно значимого отклонения наблюдаемых генотипов от теоретически ожидаемых. Однако у баранов-производителей калмыцкой курдючной отмечалось некоторое увеличения доли гетерозигот (66,7 % наблюдаемой против 44,4 % ожидаемой), тогда как у овцематок это соотношение имело противоположный характер – снижение доли гетерозигот (20,0 % наблюдаемой против 50,0 % ожидаемой). У потомства отмечалось увеличение числа гетерозигот СТ и гомозигот ТТ (15,4 и 69,2 % против 35,5 и 59,2 % соответственно).Сравнение полученных данных с результатами других исследований позволяет отметить, что расположенный между экзонами 5 и 6 полиморфизм, представляющий собой синонимичный переход Т/С в 44 нуклеотиде гена (AF309634.1) [12, 14], характеризуется разным соотношением генотипов СС, СТ, и ТТ у тех или иных пород. Так, генотип CC и аллель C являются наиболее частыми у трех египетских пород овец (барки, рахмани и оссими), при отсутствии генотипа ТТ у пород барки и оссими [15]. У овец породы бандур зарегистрированы два генотипа – СС и СТ с частотами 0,67 и 0,30 [16]. У курдских овец в этом локусе обнаружен незначительный избыток гетерозигот [17], тогда как у овец пород бандур [16] и зел [14], а также колумбийских креольских овец [18], наоборот, наблюдался их дефицит.Анализ ассоциативной связи полиморфизма CAPN1 с живой массой и ее среднесуточным приростом у овец исследуемых групп был направлен на то, чтобы охарактеризовать особенности темпа роста чистопородного и помесного потомства разных генотипов (табл. 3). Таблица 3Живая масса баранов-производителей и овцематок различных генотипов по гену CAPN1 Породная принадлежностьПо всемгенотипам, кгГенотипСССТТТБараны-производителиКК89,3±1,191,0±0,688,0±1,4–Ш80,3±1,1–81,479,2ОвцематкиКК62,3±0,3262,3±1,262,4±1,362,0±1,1½ Д ×½ КК62,9±0,3162,8±0,563,0±0,762,8±0,6  Сопоставление живой массы разных генотипов показало, что бараны-производители калмыцкой курдючной породы с генотипом СС имели тенденцию к превышению над носителями генотипа СТ. Однако, ввиду небольшого размера выборки, для интерпретации данного наблюдения как закономерности требуется расширение исследования с привлечением большего числа животных. Среди овцематок разной породной принадлежности не установлено достоверных различий по живой массе между животными разных генотипов в гене CAPN1. По-видимому, значительно более жесткий отбор среди баранов калмыцкой курдючной породы привел к тому, что из разведения исключались носители генотипа ТТ, при этом животные с генотипом СТ уступали по живой массе носителям СС генотипа, что в определенной степени свидетельствует о понижающем эффекте аллеля Т на живую массу баранов.Показатели живой массы при рождении, в 4 месяца и среднесуточный прирост в этот период у чистопородного молодняка и от разных вариантов скрещивания, различных генотипов по гену CAPN1 представлены в таблице 4. Таблица 4Живая масса и среднесуточный прирост у чистопородного молодняка и от разных вариантов скрещивания, различных генотипов по генуCAPN1 ГенотипПородная принадлежностьКК×КК½ Ш ×½КК½Ш×¼ Д ×¼ ККЖивая масса, кгСреднесуточный прирост, гЖивая масса, кгСреднесуточный прирост, гЖивая масса, кгСреднесуточный прирост, гПрирождении4 мес.Прирождении4 мес.Прирождении4 мес.БаранчикиСС4,8±0,342,2±0,5*307±4,7*3,7±0,442,0±1,4*314±7,8*4,3±0,241,4±0,6304±7,2СТ3,6±0,238,2±0,4284±3,64,0±0,440,2±1,6297±6,93,7±0,140,8±0,6305±5,3ТТ4,3±0,341,9±0,4308±2,73,7±0,238,2±1,2283±9,15,2±0,341,6±0,5298±5,7ЯрочкиСС4,0±0,240,0±0,7*295±6,5*3,9±0,137,6±1,4279±9,03,5±0,238,5±0,6287±4,2СТ3,3±0,136,3±0,5271±7,13,6±0,335,1±0,5256±4,73,7±0,137,5±0,5278±4,4ТТ3,7±0,134,6±0,6253±5,83,5±0,136,0±0,8266±7,04,0±0,137,2±1,3272±8,7*p < 0,05.  Установлено, что независимо от породной принадлежности и пола живая масса молодняка при рождении разных генотипов по гену CAPN1 была схожей, тогда как в 4-месячном возрасте как баранчики, так и ярочки с генотипом СС имели достоверное превосходство над сверстниками других генотипов по живой массе и среднесуточному приросту. Так, у чистопородных баранчиков наибольшая разность была между животными генотипов СС и СТ, у помесей ½Ш×½КК – животных генотипов СС и ТТ, которая составила 10,4 и 8,1 %; 9,94 и 10,95 % (p < 0,05) соответственно. Среди ярочек наибольшие различия наблюдались при чистопородном разведении между животными генотипов СС и ТТ – 15,6 и 16,6 % (p < 0,05) соответственно. Следует отметить, что у ярочек-носителей генотипа СС во всех вариантах отмечена тенденция к большему уровню среднесуточного прироста в сравнении с животными, имеющими генотипы СТ и ТТ.Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что у молодняка овец в ранний период роста и развития генотип СС в гене CAPN1 ассоциирован с большей живой массой, тогда как присутствие аллеля Т снижает ее уровень. Можно предположить, что положительное влияние на прирост живой массы аллеля С в гомозиготном состоянии будет прослеживаться и в более поздние возрастные периоды роста ягнят, что станет обоснованием целесообразности отбора носителей генотипа СС для увеличения численности животных с потенциально более высокой мясной продуктивностью. Однако для подтверждения этого суждения необходимо проведение дальнейших исследований на большей по численности выборке животных.Заключение. Анализ результатов генотипирования полиморфизма в гене CAPN1 выявил, что среди баранов-производителей калмыцкой курдючной породы и шароле чаще выявлялись носители аллеля С, среди чистопородных и помесных маток носительство аллелей С и Т было практически равным; среди молодняка у КК и помесей ½Ш×½КК преобладали особи с аллелем Т, у помесей½Ш×¼Д×¼КК– носители аллеля С.Популяционно-генетический анализ не выявил достоверных отличий наблюдаемых частот генотипов от теоретически ожидаемых при равновесии Харди-Вайнберга.В 4-месячном возрасте как баранчики, так и ярочки с генотипом СС имели превосходство над сверстниками других генотипов по живой массе и среднесуточному приросту. Наибольшее превосходство выявлено при сравнении с животными генотипа СТ у чистопородных баранчиков и с генотипом ТТ у помесных животных ½Ш×½КК, которое соответственно составило 10,4 и 8,1 %; 9,94 и 10,95 % (p < 0,05). Среди ярочек наибольшие различия наблюдались при сравнении с особями генотипа ТТ при чистопородном разведении и составили 15,6 и 16,6 % (p < 0,05) соответственно.