Russian Federation
Russian Federation
employee
VAK Russia 4.1.2
VAK Russia 4.1.3
VAK Russia 4.1.4
VAK Russia 4.1.5
VAK Russia 4.2.1
VAK Russia 4.2.2
VAK Russia 4.2.3
VAK Russia 4.2.4
VAK Russia 4.2.5
VAK Russia 4.3.3
VAK Russia 4.3.5
UDC 579.63
The aim of the study is to investigate the microbiological contamination of plant-based feed used in livestock farming on farms in the Krasnoyarsk Region. To determine the qualitative and quantitative composition of various groups of microorganisms, a grain mixture (50 % spring wheat, 30 % barley, 20 % oats) and a total sample of perennial grasses from two pastures were used from the Borskiy Agricultural Production Complex in the Sukhobuzimsky District. Four samples were used for the research from Solyanskoye Agricultural Farm LLC: the feed mixture and each component of the feed mixture separately – grain mixture, silage, haylage (pea-oat mixture). All samples were characterized by a very high level of microbial contamination. The total microbial count (TMC) ranged from 1,00 • 1010 to 4,74 • 1014 CFU per 1 g; the number of mycelial fungi — from 0 to 1,20 • 106 CFU per 1 g; The number of yeasts and yeast-like fungi is from 0 to 2,91 • 107 CFU per 1 g; The number of Staphylococcus aureus is from 0 to 9,69 • 105 CFU/g; The number of Staphylococcus epidermidis is from 0 to 5,80 • 105 CFU/g; The number of Shigella sonnei is from 0 to 1,60 • 104 CFU/g; The number of Salmonella spp. is from 0 to 6,75 • 104 CFU/g; The number of Escherichia coli is from 0 to 5,00 • 103 CFU/g; The number of coliform bacteria is from 0 to 5,21 • 105 CFU/g; The number of Enterococcus spp. is from 0 to 7,25 • 105 CFU/g; the number of lactic acid bacteria (s.r. Lactiplantibacillus and Lactobacillus) – from 0 to 6,82 • 108 CFU/g. Representatives of the genus Clostridium were not detected in any of the samples. No correlations were found between the levels of the studied microbial groups in the samples. The level of contamination with specific microbial groups depends primarily on the feed type, not the feed manufacturer. The highest overall microbiological contamination was found in pasture grass, while the lowest was found in silage. Despite high levels of contamination with filamentous fungi in four of the six feed samples, mycotoxins were not detected in any of the samples.
silage, haylage, grain mixture, pasture grass, forage mixture, microbial contamination, bacteria, fungi, yeast.
Введение. Качество кормов в животноводстве определяется по степени контаминации их сапротрофной, условно-патогенной и патогенной микрофлоры [1–4]. Санитарную оценку состояния кормов растительного происхождения определяют по следующим показателям: общая бактериальная обсемененность, наличие патогенных микроорганизмов (pp. Salmonella, Shigella, р. Clostridium, энтеропатогенные типы кишечной палочки, энтерококки и др.), количество плесневых грибов и продуцируемые ими микотоксины [4–6]. Высокая обсемененность сырья и кормов патогенными микроорганизмами ведет к низкой продуктивности, заболеваемости и гибели животных [3]. Микотоксинам присущи канцерогенные, аллергические, мутагенные, эмбриотоксические, тератогенные, иммунодепрессивные свойства. Они способны угнетать иммунитет, что может приводить к развитию инфекционных и неинфекционных заболеваний [7].
Для укрепления кормовой базы, повышения продуктивности животных, снижения экономического ущерба необходим микробиологический контроль за санитарными показателями качества кормов [1, 4].
Цель исследования – изучение микробной обсемененности кормов растительного происхождения, используемых в хозяйствах Красноярского края.
Задачи: изучение бактериальной обсемененности кормов растительного происхождения, используемых в УНПК «Борский» и в ООО «ОПХ Солянское»; изучение обсемененности кормов растительного происхождения, используемых в УНПК «Борский» и ООО «ОПХ Солянское», одноклеточными и мицелиальными грибами; анализ группировки кормов разного состава и происхождения по совокупности показателей микробной обсемененности с использованием методов многомерной статистики и рангового анализа.
Объекты и методы исследований. Объектами исследования служили корма для крупного рогатого скота, отобранные в двух хозяйствах Красноярского края: УНПК «Борский», п. Борск, Сухобузимский район и ООО «ОПХ Солянское», с. Новая Солянка, Рыбинский район. Для определения качественного и количественного состава различных групп микроорганизмов использовали из УНПК «Борский» зерносмесь (50 % – яровая пшеница, 30 % ячмень, 20 % овес), заготовленную в 2023 г., и общую пробу многолетних трав с двух пастбищ. Из ООО «ОПХ Солянское» для исследований использовали четыре образца: кормосмесь и каждый компонент кормосмеси отдельно – зерносмесь, силос, сенаж (горохо-овсянная смесь).
Отбор проб производили в соответствии с ГОСТ ISO 6497-2014 «Корма. Отбор проб», ГОСТ 13496.0-2016 «Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы отбора проб».
Подготовку исследуемого материала к анализам проводили следующим способом: брали среднюю пробу массой 0,5 кг, тщательно перемешивали с соблюдением основных правил асептики и измельчали. Затем навеску 1 г корма добавляли в 100 мл стерильной воды и гомогенезировали [8]. Полученную суспензию разбавляли до нужной концентрации клеток, используя классический метод серийных разведений [9]. Высев суспензии проводили поверхностным способом на плотные питательные среды.
Рис. 1. Пример выделения бактерий с зерносмеси (слева) и пастбищной травы (справа)
на «Питательной среде № 1 ГРМ» для подсчета общего количества бактерий
An example of the isolation of bacteria from a grain mixture (left) and pasture grass (right)
on “Nutrient medium № 1 GRM” for counting the total number of bacteria
В качестве общего микробного числа учитывали количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных бактерий, способных к росту на среде «Питательная среда № 1 ГРМ» (ФБНУ «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии») (рис. 1).
Для выделения и подсчета бактерий группы кишечной палочки (БГКП) использовали питательную среду «Агар Эндо-ГРМ» (ФБНУ «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»). Колонии бактерий с характерным красным цветом, с металлическим блеском относили к Escherichia coli. Для выделения и подсчета бактерий видов Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus использовали «Агар маннит-солевой» (Laboratorios Conda, S.А., Испания); Salmonella spp., Shigella spp. – «Агар Сальмонелла Шигелла модифицированный» (Laboratorios Conda, S.А., Испания) (рис. 2).
Рис. 2. Пример выделения БГКП с пастбищной травы на питательных средах
«Агар маннит-солевой» (слева) и на «Агар Эндо-ГРМ» (справа)
An example of the isolation of coliform bacteria from pasture grass on the nutrient media
"Mannitol-salt agar" (left) and "Endo-GRM agar" (right)
Для выделения и подсчета бактерий Lactobacillus spp. использовали питательную среду «Агар Рогозы». Для выделения бактерий р. Clostridium использовали «Железосодержащий сульфитный агар». Культивирование облигатных и факультативных анаэробов производили в анаэростате Schuett Standard. Для выделения и подсчета энтеробактерий использовали «Агар селективный для энтерококков». Питательные среды – производства Laboratorios Conda, S.А., Испания. Образцы инкубировали при 37 °С. Подсчет колоний производили через 48 ч.
Для выделения и подсчета дрожжевых и плесневых грибов использовали «Агар Сабуро с декстрозой и хлорамфениколом», Laboratorios Conda, S.A., Испания. Образцы инкубировали при 25 °С. Подсчет колоний производили через 5 сут (рис. 3).
Рис. 3. Пример выделения с зерносмеси плесневых грибов (слева) и с силоса дрожжей (справа)
на питательной среде «Агар Сабуро с декстрозой и хлорамфениколом»
An example of the isolation of mold fungi from a grain mixture (left) and yeast from silage (right)
on the nutrient medium "Sabouraud agar with dextrose and chloramphenicol"
В качестве программного обеспечения для обработки данных использовали пакет StatSoft STATISTICA 8.0. Анализ кормов на микотоксины проводили в агрохимслужбе ФГБУ ГЦАЛ «Красноярский».
Результаты и их обсуждение. Для всех образцов был характерен очень высокий уровень микробной обсемененности. Так, общее микробное число (ОМЧ) варьировало от 1,00 ∙ 1010 до 4,74 ∙ 1014 КОЕ на 1 г; число мицелиальных грибов – от 0 до 1,20 ∙ 106 КОЕ на 1 г; число дрожжей и дрожжеподобных грибов – от 0 до 2,91 ∙ 107 КОЕ на 1 г; число Staphylococcus aureus – от 0 до 9,69 ∙ 105 КОЕ/г; число Staphylococcus epidermidis – от 0 до 5,80 ∙ 105 КОЕ/г; число Shigella sonnei – от 0 до 1,60 ∙ 104 КОЕ/г; число Salmonella spp. – от 0 до 6,75 ∙ 104 КОЕ/г; число Escherichia coli – от 0 до 5,00 ∙ 103 КОЕ/г; число бактерий группы кишечной палочки (БГКП) – от 0 до 5,21 ∙ 105 КОЕ/г; число Enterococcus spp. – от 0 до 7,25 ∙ 105 КОЕ/г; число молочнокислых бактерий (р. Lactiplantibacillus и Lactobacillus) – от 0 до 6,82 ∙ 108 КОЕ/г. Представители р. Clostridium не обнаружены ни в одном образце (табл. 1, 2).
Таблица 1
Численность представителей разных групп микроорганизмов
в изученных образцах в УНПК «Борский», КОЕ/г
The number of representatives of different groups of microorganisms
in the studied samples at the Borsky Scientific and Production Complex, CFU/g
|
Показатель |
Зерносмесь |
Пастбищная трава |
|
ОМЧ |
3,7∙1012 |
6,33∙1011 |
|
Мицелиальные грибы |
141 000 |
900 000 |
|
Дрожжи |
0 |
300 000 |
|
Staphylococcus aureus |
375 000 |
969 000 |
|
Staphylococcus epidermidis |
0 |
44 000 |
|
Shigella sonnei |
16 000 |
0 |
|
Salmonella spp. |
0 |
16 000 |
|
Escherichia coli |
5 000 |
3 000 |
|
БГКП |
437 000 |
521 000 |
|
Enterococcus spp. |
51 000 |
103 000 |
|
Молочнокислые бактерии (р. Lactiplantibacillus, Lactobacillus) |
0 |
0 |
|
р. Clostridium |
0 |
0 |
Здесь и далее: «0» означает, что микроорганизмы данной группы в соответствующем образце не выявлены.
Таблица 2
Численность представителей разных групп микроорганизмов
в изученных образцах в ООО «ОПХ Солянское», КОЕ/г
The number of representatives of different groups of microorganisms
in the studied samples at Solyanskoye Scientific and Production Farm, CFU/g
|
Показатель |
Зерносмесь |
Силос |
Сенаж |
Кормосмесь |
|
ОМЧ |
1,6∙1013 |
5,5∙1011 |
4,74∙1014 |
1,00∙1010 |
|
Мицелиальные грибы |
300 000 |
0 |
0 |
1 200 000 |
|
Дрожжи |
0 |
7 800 000 |
13 500 000 |
29 100 000 |
|
Staphylococcus aureus |
0 |
3 000 |
420 000 |
50 000 |
|
Staphylococcus epidermidis |
2 000 |
3 000 |
0 |
580 000 |
|
Shigella sonnei |
7 500 |
0 |
500 |
0 |
|
Salmonella spp. |
500 |
0 |
67 500 |
0 |
|
Escherichia coli |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
БГКП |
146 000 |
0 |
0 |
0 |
|
Enterococcus spp. |
0 |
74 000 |
55 000 |
725 000 |
|
Молочнокислые бактерии (р. Lactiplantibacillus, Lactobacillus) |
0 |
6,82∙108 |
1,72∙108 |
19 000 000 |
|
р. Clostridium |
0 |
0 |
0 |
0 |
В среднем по всем образцам с большим отрывом лидируют мезофильные аэробные и факультативно анаэробные бактерии, способные к росту на среде МПА. Этот факт представляется вполне естественным, поскольку данная группа включает и другие изученные группы бактерий, за исключением строгих анаэробов. На втором месте по численности находятся молочнокислые бактерии, на третьем – дрожжи, на четвертом – мицелиальные грибы; на последнем – E. coli (рис. 4). Однако распределение численностей изученных групп микроорганизмов по хозяйствам статистически значимо (p < 0,001 по тесту χ2) различается. Так, например, в образцах из УНПК «Борский» не выявлены молочнокислые бактерии, а в образцах из ООО «ОПХ Солянское» не выявлена E. coli (рис. 5, 6).
Рис. 4. Средняя по образцам численность изучаемых групп микроорганизмов
(логарифмическая шкала), КОЕ/г
Average number of studied microorganism groups in samples (logarithmic scale), CFU/g
Рис. 5. Средняя по образцам численность изучаемых групп микроорганизмов
в УНПК «Борский» (логарифмическая шкала), КОЕ/г
Average number of studied groups of microorganisms in the samples
at the Borsky Scientific and Production Complex (logarithmic scale), CFU/g
Рис. 6. Средняя по образцам численность изучаемых групп микроорганизмов
в ООО «ОПХ Солянское» (логарифмическая шкала), КОЕ/г
Average number of studied microorganism groups in samples
at Solyanskoye Scientific and Production Farm (logarithmic scale), CFU/g
Представляется, что указанные различия в первую очередь связаны не со спецификой хозяйств, а со спецификой образцов. Действительно, три из четырех образцов кормов из ООО «ОПХ Солянское» представлены силосом, сенажом и кормосмесью (зерносмесь + силос + сенаж); для всех этих субстратов присутствие молочнокислых бактерий является естественным, что и отмечается в нашем исследовании. В то же время образцы кормов из УНПК «Борский» представлены зерносмесью и пастбищной травой, для которых присутствие молочнокислых бактерий нехарактерно, что и отмечено нами. При этом как минимум для одного из образцов из УНПК «Борский» (пастбищной травы) естественным является присутствие E. coli, которая поступает туда с фекалиями животных.
Индивидуальная специфика образцов проявилась и в том, что коэффициент конкордации Кендалла между образцами по микробиологическому составу имеет крайне низкое значение – 0,0749.
Не выявлено каких-либо корреляций между содержанием изученных групп микроорганизмов в исследованных образцах. Несмотря на то что статистически значимые (p < 0,05) коэффициенты корреляции обнаружены между ОМЧ и численностью Salmonella spp. (r = 0,969), между численностью дрожжей и численностью Staphylococcus epidermidis (r = 0,864), между численностью дрожжей и численностью Enterococcus spp. (r = 0,864), а также между численностью Staphylococcus epidermidis и численностью Enterococcus spp. (r = 0,996), анализ соответствующих точечных диаграмм показал, что во всех этих случаях речь идет о корреляции, обусловленной лишь одной выпадающей точкой (рис. 7).
Кластерный анализ показал, что по комплексу изученных микроорганизмов образцы кормов группируются следующим образом: зерносмесь и силос из ООО «ОПХ Солянское» образуют тесный кластер, к которому примыкает сенаж из ООО «ОПХ Солянское»; зерносмесь и пастбищная трава из УНПК «Борский» образуют отдельный кластер; кормосмесь из ООО «ОПХ Солянское» максимально отличается от остальных образцов. При этом разные способы кластеризации дают сходные результаты (рис. 8).
Результаты кластерного анализа подкрепляются проекцией образцов на главные компоненты (рис. 9).
Рис. 7. Пример корреляции, обусловленной одной выпадающей точкой.
Каждая точка соответствует образцу корма. Выпадающая точка (левая диаграмма) –
кормосмесь из ООО «ОПХ Солянское»; исключение этой точки из анализа (правая диаграмма) приводит к исчезновению статистически значимой корреляции (r = 0,685, p > 0,05)
An example of a correlation due to a single outlier. Each point corresponds to a feed sample. The outlier (left diagram) is the feed mixture from Solyanskoye Farming Company; excluding this point from the analysis (right diagram) results in the disappearance of the statistically significant correlation (r = 0.685, p > 0.05)
Рис. 8. Кластеризация образцов кормов по микробиологическому составу разными способами
(в связи с высокими различиями численностей разных групп микроорганизмов
перед кластеризацией проведена стандартизация данных)
Clustering of feed samples by microbiological composition using different methods
(due to the high differences in the abundance of different groups of microorganisms,
data standardization was performed before clustering)
Окончание рис. 8.
Рис. 9. Проекция образцов кормов по микробиологическому составу на первые две
главные компоненты (сохранено 68,39 % информации о взаимном расположении образцов
в пространстве изученных показателей)
Projection of feed samples by microbiological composition onto the first two main components
(68.39% of information on the relative position of samples in the space
of the studied parameters was preserved)
Для сравнения между собой образцы кормов были проранжированы по каждому из показателей численности нежелательной микрофлоры, к которой были отнесены ОМЧ, мицелиальные грибы, дрожжи, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Shigella sonnei, Salmonella spp., Escherichia coli, БГКП и Enterococcus spp. Образец с минимальной численностью соответствующей группы микроорганизмов получал ранг 1, образец с максимальной численностью – ранг 6; в случае, если два или больше образцов имели одинаково низкую численность соответствующей группы микроорганизмов (0), они все получали ранг 1. В таблице 3 представлено распределение образцов по сумме рангов.
Таблица 3
Распределение образцов по сумме рангов,
характеризующих обсемененность нежелательными микроорганизмами
Distribution of samples by the sum of ranks characterizing
contamination with unwanted microorganisms
|
Корм |
Производитель |
Сумма рангов |
|
Силос |
ООО «ОПХ Солянское» |
19 |
|
Зерносмесь |
ООО «ОПХ Солянское» |
21 |
|
Зерносмесь |
УНПК «Борский» |
25 |
|
Сенаж |
ООО «ОПХ Солянское» |
28 |
|
Кормосмесь |
ООО «ОПХ Солянское» |
29 |
|
Пастбищная трава |
УНПК «Борский» |
34 |
Как видно из представленных данных, минимальная суммарная обсемененность нежелательными микроорганизмами характерна для силоса производства ООО «ОПХ Солянское»; этот образец можно охарактеризовать как максимально чистый с микробиологической точки зрения среди всех изученных образцов. На втором месте по микробиологической чистоте находится зерносмесь производства ООО «ОПХ Солянское», на третьем – зерносмесь производства УНПК «Борский», на четвертом – сенаж производства ООО «ОПХ Солянское», на пятом – кормосмесь производства ООО «ОПХ Солянское», на шестом – пастбищная трава производства УНПК «Борский».
Следует отметить, что, несмотря на высокий уровень загрязнения четырех из шести образцов кормов мицелиальными грибами, микотоксины не выявлены ни в одном из изученных образцов.
Заключение. Все изученные образцы кормов характеризуются очень высокой обсемененностью нежелательными микроорганизмами. Степень обсемененности конкретными группами микроорганизмов зависит главным образом не от производителя кормов, а от вида корма. Максимальная общая микробиологическая загрязненность характерна для пастбищной травы, минимальная – для силоса. Для решения проблемы микробного загрязнения рекомендуется термическая обработка кормов и/или исходного сырья, а также улучшение условий хранения кормов.
1. Ryadchikov VG. Fundamentals of nutrition and feeding of farm animals. SPb.: Lan: 2015. 640 p.
2. Grankina AS, Golyakevich ZS. Bacterial contamination of feed of animal and plant origin used in animal husbandry. Biotika. 2015;6:29-35.
3. Soboleva OM, Kolosova MM, Filipovich LA. Microbiological contamination of feed and electrophysical method for its reduction. Achievements of science and technology of the agro-industrial complex. 2018;32(12):50-52.
4. Toropyno AV, Shevchenko AA. Organoleptic and microbiological study of plant-based feed and water on livestock farms in the Rostov Region. Eurasian Union of Scientists. 2019;5-2:20-28.
5. Belousov VI, Romanenko EA, Bazarbaev SB. Veterinary and sanitary requirements for grain, feed and feed additives. Collection of scientific papers of the Krasnodar Scientific Center for Animal Science and Veterinary Medicine. 2023;12(1):53-59.
6. Patsaev MM, Sidorova VI, Yanvareva NI., et al. Microbiological studies of raw materials and compound feed for valuable fish species. Bulletin of Shakarim University. Technical sciences series. 2023;4:11-21.
7. Akhmadyshin RA, Kanarsky AV, Kanarskaya ZA. Mycotoxins-contaminants of feed. Bulletin of Kazan Technological University. 2007;2:88-103.
8. Solyanik TV, Glaskovich MA. Microbiology. Microbiology of animal and plant feed. Gorki: BGSHA; 2014. 76 p.
9. Pimenova MN, Grechushkina NN, Azova LG, et al. Guide to practical classes in microbiology. Moscow: Publishing house of Moscow University; 1983. 215 p.
