Vladikavkaz, Vladikavkaz, Russian Federation
The aim of the study is to identify potato genotypes with genes that control resistance to the potato cyst nematode (Globoder arostochiensis and Globoder apallida), potato virus X (XVC), and Y (YVC) in potato hybrids of the Vladikavkaz Scientific Center of the Russian Academy of Sciences using molecular markers. The analyzes were carried out in the Laboratory of Molecular Genetic Research of the Vladikavkaz Scientific Center of the Russian Academy of Sciences using an instrumentation line for PCR analysis. The breeding material was preliminary evaluated in laboratory and field conditions for the most important economically valuable traits in accordance with the "Methodological recommendations on the technology of the breeding process for potatoes". DNA was isolated from the leaves of potato samples using the DNA-Extran-3 reagent kit for DNA extraction from plant tissues of OOO Syntol (limited liability company). For molecular screening of potato samples, DNA markers of W virus resistance genes were used: STS marker YES3-3A linked to the Rysto gene, and SCAR marker RYSC3 of the Ruadg gene, STS marker Ry186 of the Rychc gene; against the golden potato nematode - SCAR marker of the H1 gene – TG 689, 57 R, N 195, STS marker Gro1-4-1 of the Gro1-4 gene; against the pale potato nematode, the STS marker Gpa2-2 of the Gpa2 gene; and against potato virus X, the STS marker PVX of the Rx1 gene. The combination of Gpa2-2 and PVX markers was found in 9 hybrid combinations. Molecular genetic analysis of potato hybrids showed that the PVX marker of the X virus resistance gene (Rx) was diagnosed in 18 samples. The RYSC3 marker of the Ryadg gene was found in potato hybrids 7/6-18, 7/7-18, 7/16-18.7/21-18, 8/1-18. The H1 gene was confirmed by a combination of three markers TG-689, 57R, N195 in 11 hybrid potato accessions. All studied genotypes lack a specific 602 bp fragment - a marker of the Gro 1-4 gene.
potato, hybrid, resistance, gene, nematode, markers, virus X, W
Введение. В странах с развитым картофелеводством в настоящее время средняя урожайность картофеля составляет 40,0 т/га, а в РСО-Алания средняя урожайность не превышает 20,0–25,0 т/га. Недобор урожая клубней связан со многими объективными и субъективными причинами [1–3]. Одной из причин низких урожаев картофеля является отсутствие собственного семенного материала и новых перспективных конкурентоспособных сортов, устойчивых к карантинным объектам, вирусным, бактериальным и грибным болезням, приспособленных к конкретным климатическим условиям [4, 5]. Опасность этих вирусов заключается в том, что они беспрепятственно распространяются в пределах сорта, приводя к полному поражению растений. Вирусные инфекции вызывают значительные потери при выращивании картофеля, поскольку патогены передаются с посадочным материалом и таким образом циркулируют в агроэкосистемах в течение длительного времени, вызывая высокие потери урожая – до 15–70 % [6, 7]. Основной проблемой в селекции картофеля является контроль вирусных инфекций, поэтому поиск источников устойчивости к вирусам является актуальной задачей в селекции. Сложность селекции на устойчивость к вирусам заключается в наличии большого их разнообразия и малом числе сортов с комплексной устойчивостью [8].
В области селекции наиболее перспективно создание новых вирусоустойчивых сортов с использованием межвидовой гибридизации и внедрение их в производство. Создание устойчивой к вирусу сортоформы стало возможным только благодаря подбору устойчивых родительских форм и отбору всех устойчивых гибридов для всей дальнейшей работы [9–11].
Наряду с традиционной схемой селекции поиск эффективных исходных форм и перспективных гибридов картофеля с использованием методов маркер-вспомогательной селекции становится перспективным. Молекулярные маркеры (ДНК-маркеры), тесно связанные с генами устойчивости, интенсифицируют поиск ценных селекционных образцов и позволяют значительно увеличить выборку исследуемого материала при отборе генотипов с комплексом олигогенов, что существенно сокращает время создания новых сортов картофеля [12–15].
ДНК-маркеры используются для отбора образцов, потенциально устойчивых к цистообразующей нематоде, фитофторозу, к наиболее вредоносным вирусам картофеля Х и У [16]. В селекции картофеля наиболее эффективные молекулярные маркеры связаны с генами Rysto, Ryadg и Rychc, контролирующими иммунитет к YBK, генами Rx1, контролирующими иммунитет к XBK, и генами H1 и Gro1-4 для устойчивости к золотистой нематоде Globodera rostochiensis, что может стать эффективным инструментом для интенсификации селекционной работы. Их использование для выявления ценных генотипов, включая формы с несколькими генами устойчивости, может значительно повысить эффективность отбора на ранних этапах селекции [17, 18].
Цель исследования – выявление генотипов картофеля с генами, контролирующими устойчивость к картофельной цистообразующей нематоде (Globodera rostochiensis и Globodera pallida), вирусам Х (ХВК) и У (УВК) картофеля среди образцов коллекций и гибридов ВНЦ РАН с использованием молекулярных маркеров.
Материалы и методы. Материалом для исследования служили гибриды картофеля отечественной селекции. Исследование выполнялось на базе лаборатории молекулярно-генетических исследований ВНЦ РАН с использованием приборно-аппаратной линии для проведения ПЦР-анализа. ДНК выделяли из молодых листьев полевых растений картофеля из селекционного питомника Владикавказского Научного Центра Российской академии наук (ВНЦ РАН) с использованием набором реагентов «ДНК-Экстран-3» (компания ООО «Синтол», Россия).
В исследовании использовались ДНК-маркеры, показывающие наиболее высокий уровень корреляции наличия амплифицированного фрагмента и устойчивости к патогену. Для молекулярного скрининга образцов картофеля использовали ДНК-маркеры генов устойчивости (табл. 1). ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 нг общей ДНК из сортов картофеля, 1× реакционный буфер (Диаэм, Москва), 2,5 мМ MgCl2, 0,5 мМ каждого из dNTP, 0,2 мкМ прямого и обратного праймеров и 1 единицу Taq-полимеразы. ПЦР проводили по стандартным методикам. Температуры отжига и условия циклирования соответствовали указанным разработчиками праймерам (см. табл. 1). Для повышения эффективности анализа несколько маркеров (Ry186, N 195, Gpa2-2) были объединены в одной мультиплексной реакции. GBSS-маркер Waxy (GBSSI) гена, контролирующего содержание амилопектина в крахмале, использовался в качестве внутреннего положительного контроля, указывающего на качество матрицы ДНК и правильность ПЦР. Мультиплексная ПЦР проводилась по следующей программе: 10 с при 94 °C (1 цикл); 30 с при 94 °C, 30 с при 68 °C, 1 мин при 72 °C, (5 циклов); 30 с при 94 °C, 30 с при 58 °C, 1 мин при 72 °C (35 циклов); 30 с при 94 °C, 5 мин при 72 °C (1 цикл). Присутствие специфического фрагмента определяли путем электрофоретического разделения продуктов амплификации в 1,5 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.
Таблица 1
ДНК-маркеры, используемые для оценки генотипов картофеля
|
Ген |
Маркер |
Размер фрагмента (п.н.) |
Tемпература отжига праймеров, ºС |
Литературный источник |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
ДНК-маркеры устойчивости к вирусу Y |
||||
|
Ryadg |
RYSC3 |
321 |
60 |
Kasai et al., 2000 [19] |
|
Rychc |
Ry186 |
587 |
55 |
Hosaka et al., 2001 [20] |
|
Rysto |
YES3-3A |
341 |
55 |
Song et al., 2005 [19] |
|
ДНК-маркеры устойчивости к Globodera rostochiensis |
||||
|
H1 |
TG 689 |
141 |
55 |
Бирюкова и др. 2008 [6] |
|
N 195 |
337 |
55 |
Mori et al. 2011 [18] |
|
|
57 R |
450 |
63 |
Schultz et al., 2012 [21] |
|
|
Gro1-4 |
Gro 1-4 |
602 |
60 |
Asanol et al., 2012 [22] |
Окончание табл. 1
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
ДНК-маркеры устойчивости к Globodera pallida |
||||
|
Gpa2 |
Gpa2-2 |
452 |
60 |
Asanol et al., 2012 [22] |
|
ДНК-маркер устойчивости к вирусу X |
||||
|
Rx1 |
PVX |
1230 |
58 |
Mori et al., 2011 [18] |
Результаты и их обсуждение. Молекулярный скрининг на наличие генов устойчивости проведен для 30 гибридов картофеля. В результате установлено, что в селекции картофеля на устойчивость в настоящее время используются близкородственные родительские формы, в родословной которых участвует один и тот же генетический источник, и имеются достаточно большие перспективы для расширения существующего генофонда.
В результате молекулярного скрининга гибридов селекции ВНЦ РАН установлено, что среди исследуемых образцов картофеля преобладают генотипы с маркерами генов H1, Gpa2 и Rx1 и имеются достаточно большие перспективы для расширения существующего генофонда, поскольку в их происхождении в качестве родительских форм участвуют сорта картофеля, устойчивые к цистообразующей картофельной нематоде и вирусу Х (табл. 2).
Таблица 2
Гибриды картофеля II года, устойчивые к патогенам,
отобранные по результатам маркер вспомогательной селекции
|
Гибрид |
Происхождение |
Наличие ДНК маркеров |
Общее кол-во генов |
|||||||||||
|
TG 689 |
57R |
N 195 |
Gro1-4 |
Gpa 2-2 |
YES3-3A |
RYSC3 |
Ry186 |
PVX |
5Rx1 |
|||||
|
Устойчивость к КЦН |
Устойчивость к YВК и ХВК |
|||||||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
||
|
1/2- 18 |
Nixe × Голубка |
+ |
+ |
+ |
– |
+ |
– |
– |
– |
+ |
+ |
6 |
||
|
1/10-18 |
Nixe × Голубка |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
5 |
||
|
2/15-18 |
Red Scarlett × Голубка |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
3 |
||
|
2/18-18 |
Red Scarlett × Голубка |
+ |
+ |
+ |
– |
+ |
– |
– |
– |
+ |
+ |
6 |
||
|
2/13-18 |
Red Scarlett × Голубка |
+ |
+ |
+ |
– |
+ |
– |
– |
– |
+ |
+ |
6 |
||
|
2/22-18 |
Red Scarlett × Голубка |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
3 |
||
|
3/3-18 |
Romano × Голубка |
– |
– |
– |
– |
+ |
– |
– |
– |
+ |
+ |
3 |
||
|
4/7-18 |
El Mundo × Labadia |
+ |
+ |
+ |
– |
+ |
– |
– |
– |
+ |
+ |
6 |
||
|
7_/6-18 |
Фрителла × Киви |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
– |
– |
– |
1 |
||
|
7_/7-18 |
Фрителла × Киви |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
– |
– |
– |
1 |
||
|
7/16-18 |
Фрителла × Киви |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
+ |
– |
– |
– |
4 |
||
|
7/21-18 |
Фрителла × Киви |
– |
+ |
+ |
– |
– |
– |
+ |
– |
– |
– |
3 |
||
|
8/1-18 |
Lady Claire × Киви |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
– |
– |
– |
1 |
||
|
8/8-18 |
Lady Claire × Киви |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
2 |
||
|
8/11-18 |
Lady Claire × Киви |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
2 |
||
Окончание табл. 2
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
|
9/11-18 |
144-3-2013 × Innovator |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
0 |
|
11/4-18 |
88.16/20 × Innovator |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
0 |
|
11/7-18 |
88.16/20 × Innovator |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
0 |
|
12/1-18 |
Ferrari × Бриз |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
2 |
|
12/12-18 |
Ferrari × Бриз |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
2 |
|
12/19-18 |
Ferrari × Бриз |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
1 |
|
13/13-18 |
El Beida × Бриз |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
5 |
|
13/17-18 |
El Beida × Бриз |
– |
– |
– |
– |
+ |
– |
– |
– |
+ |
– |
2 |
|
17/2-18 |
VR 808 × Вымпел |
+ |
+ |
+ |
– |
+ |
– |
– |
– |
+ |
+ |
6 |
|
17/7-18 |
VR 808 × Вымпел |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
3 |
|
17/18-18 |
VR 808 × Вымпел |
– |
– |
– |
– |
+ |
– |
– |
– |
+ |
+ |
3 |
|
17/20-18 |
VR 808 × Вымпел |
– |
+ |
+ |
– |
+ |
– |
– |
– |
+ |
+ |
5 |
|
17/22-18 |
VR 808 × Вымпел |
– |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
3 |
|
18/21-18 |
Метеор × Вымпел |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
2 |
|
22/2-18 |
Метеор × Армада |
+ |
+ |
+ |
– |
+ |
– |
– |
– |
+ |
+ |
6 |
Примечание: КЦН – картофельная цистообразующая нематода; YВК – Y вирус картофеля; ХВК – Х вирус картофеля; (+/–) – присутствие / отсутствие маркера.
Наличие гена H1 было подтверждено комбинацией трех диагностических маркеров TG-689, 57R, N195 у 11 гибридных образцов картофеля. Ген H1 придает устойчивость к двум патотипам золотистой нематоды Ro1 и Ro4.
У всех исследуемых генотипов отсутствует специфический фрагмент размером 602 п.н. – маркер гена Gro 1 (см. табл. 2). Маркер доминантного гена Gpa 2, который контролирует устойчивость к Globodera pallida, был идентифицирован в гибридах 1/2-18; 2/18-18; 2/13-18; 3/3-18; 3/17-18; 17/2-18;17/18-18; 17/20-18; 22/2-18. В исследованных гибридах все образцы с геном Gpa 2 также имели ген Rx1, поскольку ген Gpa 2 находится близко (менее 200 кб) к Rx1 и эти гены генетически сцеплены [18].
Молекулярный маркер RYSC3 гена Ryadg обнаружен у гибридов картофеля 7/6-18, 7/7-18, 7/16-18, 7/21-18 и 8/1-18, в происхождении которого участвует высоко-фертильная форма 128-6, сочетающая крайнюю устойчивость к Y вирусу картофеля c полевой устойчивостью к фитофторозу. Сорт Киви создан с участием формы 128-6 (от самоопыления беккроссов S. stoloniferum x S. tuberosumn). Интрогрессия маркера YES3-3A гена Rysto в гибриды происходит от сортов Метеор и Roko, полученных на основе S. stoloniferum. Маркеры генов Ryadg, Rysto встречаются реже, хотя имеют наибольшую селекционную ценность, поскольку обеспечивают оптимальную защиту картофеля ко всем пяти патотипам Ro1-Ro5 золотой картофельной нематоды и штаммам Y вируса картофеля соответственно. Маркер Ry186 гена Rychc отсутствует у исследуемых гибридов. Сопоставление результатов молекулярного скрининга с происхождением гибридов позволяет проследить интрогрессию R-генов от исходных (родительских) форм. Для дальнейшего прогресса в селекции генетическая база исходного материала должна быть дополнена включением новых источников генов устойчивости.
Заключение. Молекулярно-генетический анализ выявил новые источники генов устойчивости против картофельной цистообрующей нематоды и вирусных болезней картофеля. Полученные результаты свидетельствуют о селекционной ценности названных родительских линий. Наличие таких форм позволит обеспечить оптимальную защиту картофеля, а также ограничить распространение патогенов и предотвратить появление более агрессивных патотипов. В результате маркер-вспомогательной селекции среди перспективных гибридов из коллекции ВНЦ РАН выделены формы с комбинацией нескольких R-генов – 1/2-18, 2/13-18, 2/18-18, 4/7-18, 13/17-18, 22/2-18 – которые являются источниками групповой и комплексной устойчивости к картофельной цистообразующей нематоде, Y и Х вирусам картофеля и представляют интерес для целенаправленной селекции сортов картофеля с долговременной защитой к патогенам.
1. Kartofel': problemy i perspektivy / S.V. Zhevora [i dr.] // Kartofel' i ovoschi. 2019. № 7. S. 2–7.
2. Gerieva F.T., Gazdanova I.O. Effektivnost' primeneniya perspektivnyh biopreparatov novogo pokoleniya v usloviyah Cevero-Kavkazskogo regiona // Agrarnyy vestnik Urala. 2021. № 3 (206). S. 2–9.
3. Rafal'skiy S.V., Rafal'skaya O.M., Mel'nikova T.V. Izuchenie gibridnyh populyaciy kartofelya v usloviyah Priamur'ya // Vestnik KrasGAU. 2021. № 6 (171). S. 18–24.
4. Diagnostika i profilaktika virusnyh, bakterial'nyh i gribnyh bolezney, kontroliruemyh v semenovodstve kartofelya: metod. rekomendacii / B.V. Anisimov [i dr.]. Vladikavkaz, 2021.
5. Gazdanova I.O., Dzedaev H.T., Morgoev T.A. Biologicheskaya zaschita kartofelya v Respublike Severnaya Osetiya – Alaniya // Vestnik KrasGAU. 2022. № 1. S. 76–82.
6. Aktual'nye napravleniya razvitiya selekcii i semenovodstva kartofelya v Rossii / E.A. Simakov [i dr.] // Kartofel' i ovoschi. 2020. № 12. S. 22–26.
7. Hlestkina E.K., Shumnyy V.K., Kolchanov N.A. Marker-orientirovannaya selekciya i primery ee ispol'zovaniya v mirovom kartofelevodstve // Dostizheniya nauki i tehniki APK. 2016. T. 30 (10). S. 5–8.
8. DNA marker assisted evaluation of potato genotypes for potential resistance to potato cyst nematode pathotypes not yet invading into Japan / K. Asanol [et al.] // Breed. Sci. 2012.V. 62. P. 142–150.
9. Prodhomme C., Vos P., Paulo M.J., Tam-mes J.E., Richard G. F., Visser R.G.F., Jack H. Distribution of P1(D1) wart disease resistance in potato germplasm and GWAS identification of haplotype‑specific SNP markers. Theoretical and Applied Genetics. 2020;133:1859–1871.
10. Sincova N.F., Lyskova I.V., Sergeeva Z.F. Perspektivnye napravleniya selekcii kartofelya na Falenskoy selekcionnoy stancii // Agrarnaya nauka Evro-Severo-Vostoka. 2011. № 6 (25). S. 8–13.
11. Hirsch C.D., Hamilton J.P., Childs K.L., Cepe¬la J., Crisovan E., Vaillancourt B., Hirsch C.N. A resource for mining sequences, genotypes, and phenotypes to accelerate potato breeding. Plant Genome. 2014;7:1–12.
12. Shesteperov A.A., Griboedova O.G. Sozdanie nematodoustoychivyh sortov i gibridov sel'skohozyaystvennyh kul'tur // Agrarnaya nauka. 2019. № S2. S. 130–134.
13. Issledovanie kollekcionnyh obrazcov kartofelya na nalichie geneticheskih markerov ustoychivosti k fitopatogenam / A.B. Saynakova [i dr.] // Vavilovskiy zhurnal genetiki i selekcii. 2018. T. 22 (1). C. 18–24.
14. Ustoychivost' kartofelya k virusam: sovremennoe sostoyanie i perspektivy / S.S. Makarova [i dr.] // Vavilovskiy zhurnal genetiki i selekcii. 2017. № 21 (1). S. 62–73.
15. Lico C., Benvenuto E., Baschieri S. The twofaced Potato virus X: from plant pathogen to smart nanoparticle. Front. Plant Sci. 2015;6:1009.
16. Arif M., Azhar U., Arshad M., Zafar Y., Man-soor S., Asad S. Engineering broadspectrum resistance against RNA viruses in potato. Transgenic Res. 2012;21:303311.
17. Ustoychivost' kartofelya k karantinnym boleznyam / A.V. Hyutti [i dr.] // Vavilovskiy zhurnal genetiki i selekcii. 2017. № 21 (1). S. 51–61.
18. Mori K, Sakamoto Y, Mukojima N, Tamiya S, Nakao T, Ishii T, Hosaka K. Development of a multiplex PCR method for simultaneous detection of diagnostic DNA markers of five disease and pest resistance genes in potato // Euphytica. 2011. V. 180. P. 347–355.
19. Kasai K., Morikawa Y., Sorri V.A., Valko-nen J.P.T., Gebhardt C., and Watanabe K.N. Development of SCAR markers to the PVY resistance gene Ryadg based on a common feature of plant disease resistance genes // Genome. 2000. V. 43. P. 1–8.
20. Song Y.S., Hepting L., Schweizer G., Hartl L., Wenzel G., and Schwarzfischer A. Mapping of extreme resistance to PVY (Rysto) on chromosome XII using anther-culture-derived primary dihaploid potato lines // Theoretical and Applied Genetics. 2005. V. 111. P. 879–887.
21. Schultz L., Cogan N.O.I., McLean K., Dale M.F.B., Bryan G.J., Forster J.W., Sla-ter A.T. Evaluation and implementation of a potential diagnostic molecular marker for H1-conferred potato cyst nematode resistance in potato (Solanum tuberosum L.) // Plant Breed. 2012. V. 131. P. 315–321.
22. Asano K., Kobayashi A., Tsuda S., Nishina-ka M., Tamiya S. DNA marker assisted evaluation of potato genotypes for potential resistance to potato cyst nematode pathotypes not yet invading into Japan // Breed. Sci. 2012. V. 62. P. 142–150.
