Izhevsk, Russian Federation
The search for alternative sources of biologically active substances is the task of biomedicine, animal husbandry and other industries. The purpose of research is to study the effect of the extract of the larvae of the great wax moth (BWM) Galleria mellonella L. on the biochemical parameters of the blood plasma of rats. To study the role of G. mellonella products, an analysis of biochemical parameters reflecting the general condition against the background of the Ultimate Swimming test was carried out. The study was conducted on two groups of laboratory rats: the experimental group was given an alcoholic extract of G. mellonella larvae (n=7), the control group was given a 40 % water-alcohol solution (n=6). The rats were matched by the method of pair-analogues by weight and sex. In the study of biochemical parameters of blood, it was found that the swimming time of rats in the Forced swimming test at the end of the experiment increased by 22 times (p≤0.05) when drinking the extract of G. mellonella larvae. The introduction of a 40 % extract from native larvae of G. mellonella led to a significant increase in the concentration of malondialdehyde relative to the control group without the average values going beyond the physiological norm. With the introduction of an alcoholic extract, the oxidation processes start faster. From the 4th week of the experiment, in the experimental group of rats in the blood, there was a tendency for the stability of the glucose level within the range of 4.3–5.5 mmol/l, in the control, the tendency to increase the level by the end of the experiment was 4.7–5.0 mmol/l. There is more pyruvic acid in the blood of experimental rats, that is, the oxidation processes are faster, the utilization (mobilization) of glucose is also more intensive. The concentration of cortisol in rats of the experimental group did not change during the entire experiment, which also confirms the level of adaptation of animals to the stress factor. Thus, the alcoholic extract of G.mellonella larvae increases physical endurance and has a faster effect on carbohydrate (energy) metabolism.
Ultimate swimming test, extract from Galleria mellonella larvae, biochemical blood parameters
Введение. Стресс сопровождается активацией процессов адаптации наряду с повреждающими. Одним из механизмов является перестройка энергетического обеспечения специфических компонентов адаптации. Механизмы долговременной адаптации на начальных этапах обеспечиваются преимущественно активацией катаболических реакций. Повышение уровня катехоламинов и глюкокортикостероидов способствует преобладанию энерготропных процессов в организме, обеспечивая состояние резистентности. Следующим этапом за катаболической реакцией может формироваться анаболическая [1].
Одной из важнейших задач профилактической медицины является повышение устойчивости организма к действию патогенных факторов. Традиционно с этой целью применяются препараты растительного происхождения на основе женьшеня обыкновенного, родиолы розовой, элеутерококка колючего, левзеи сафлоровидной и другие или продукты пчеловодства (мед, перга, маточное молочко и др.) [2]. Поиск альтернативных источников биологически активных веществ, обладающих адаптогенными свойствами, является актуальной задачей современной биотехнологии и биомедицины. Одним из таких перспективных источников является личинка большой восковой моли (БВМ) (Galleria mellonella L.) [3].
Большая восковая моль, или огневка пчелиная, является вредителем в пчеловодстве [4]. Ее личинки живут в ульях медоносных пчел, поедают воск, пергу и нарушают целостность пчелиных семей [5]. Личинки БВМ могут широко применяться в научно-производственных целях. Их используют как модельный объект для физиологических и биохимических исследований основных патогенов человека [6]. Кроме того, личинку G. mellonella рассматривают в качестве сырья для изготовления экстракта, обладающего иммуномодулирующим, кардиопротекторным, противотубекулезным и другими эффектами [7].
Цель исследований – изучить влияние 40%-го экстракта личинок Galleria mellonella L. на биохимические показатели плазмы крови крыс на фоне теста «Предельное плавание».
Задачи: провести тест «Принудительное плавание» в контрольных группах и группах лабораторных животных, принимавших спиртовую вытяжку экстракта личинок G. Mellonella, для оценки физических возможностей; оценить содержание в плазме крови глюкозы, молочной кислоты, малонового диальдегида (МДА), пировиноградной кислоты, кортизола и мочевины на фоне приема спиртовой вытяжки из личинок G. mellonella.
Методы. Работа выполнена на кафедре ФКБиБ ФГБОУ ВО «УдГУ». Исследования проводились 2,5 месяца – с ноября 2020 г. по февраль 2021 г.
Эксперименты выполнялись в соответствии с этическими нормами обращения с животными, с соблюдением рекомендаций и требований «Европейской конвенции по защите экспериментальных животных» (Страсбург, 1986) [8].
Крыс содержали в виварии в стандартных клетках на обычном пищевом рационе в соответствии с ГОСТ Р-50258-92 «Комбикорма полнорационные для лабораторных животных». Животные имели свободный доступ к пище и воде. Перед экспериментом в течение двух недель проводился подготовительный этап «handing» (приручение) лабораторных крыс с целью уменьшения стресса при принудительном индивидуальном выпаивании растворов микропипеткой (табл. 1). Экстракт личинок G. mellonella получали по стандартной методике экстрагирования [9].
Таблица 1
Схема выпаивания растворов
|
Группа |
Дозировка |
Подаваемое вещество |
|
|
Контрольная |
0,5 мкл на 1 г живого веса |
40%-й спирт |
|
|
Опытная (спиртовая вытяжка) |
|||
|
40%-й экстракт из нативных личинок Galleria mellonella |
Белые однолинейные самцы крыс в возрасте 9 недель (в количестве 25 штук) рандомизированы в группы по 6–7 штук по среднему весу.
Уровень выносливости крыс определяли по длительности плавания с грузом 10 % от массы тела животного тестом «Принудительное плавание» [10, 11]. Через каждые 4 недели кровь отбирали методом пункции правых отделов сердца в гепариновый раствор при фиксации животного методом ввода в наркоз парами эфира. Биохимические показатели плазмы крови определяли по стандартной методике (общий белок, глюкоза, молочная кислота, перекисное окисление, пировиноградная кислота, кортизол и мочевина) с применением наборов реактивов фирмы «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия) колориметрическим методом.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программ «Statistica 10.0». Достоверность различий между группами животных выявляли с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни, данные представляли как среднее значение ± стандартное отклонение. Различия выборок считали достоверными при уровне значимости p < 0,05.
Результаты и их обсуждение. Отмечено, что средний вес до проведения исследования контрольной группы составил 300,5±2,0 г, опытной группы – 307,0±2,0 г. В течение эксперимента разница между показателями масс подопытных крыс контрольных и опытных групп недостоверна и в пределах ошибки. Результаты теста «Принудительного плавания» представлены в таблице 2.
Таблица 2
Динамика времени заплыва крыс в тесте «Предельное плавание», секунд
|
Группа |
1-я неделя |
4-я неделя |
12-я неделя |
|
Контроль |
129,4±77,19 |
674,43±209,86 |
1064,57±170,91 |
|
Опытная |
237,0±70,60 |
1235,8±326,16 |
5298,6±1417,22* |
*При достоверном различии P≤0,05.
Время предельного плавания контрольной группы, получавшей 40 % спиртовой раствор, повышалось в 5,2 и 8,2 раза по сравнению с 1-й неделей эксперимента. При этом в опытной группе, начиная с 4-й недели, прослеживается тенденция увеличения времени предельного плавания также в 5,2 раза, но к 12-й неделе эксперимента достоверно выше контрольных и исходных значений.
Ключевым гормоном, отражающим преобладание катаболических процессов, при хроническом стрессе в организме является кортизол. Среднее значение содержания кортизола в плазме крыс контрольной и опытной групп в ходе эксперимента представлено на рисунке 1.
Рис. 1. Концентрация кортизола в плазме крыс контрольной и опытной групп
в ходе эксперимента при введении спиртового экстракта личинок G. Mellonella
Концентрация кортизола в плазме крыс достоверно не изменялась в ходе эксперимента относительно исходных значений. Достоверных изменений по содержанию кортизола в опытной группе относительно контрольной также не обнаружено. Такие результаты свидетельствуют об отсутствии хронического стресса на фоне введения экстракта из личинок G. mellonella и стрессопротекторных свойствах исследуемого раствора.
Малоновый диальдегид является вторичным продуктом перекисного окисления липидов, накапливающимся в крови при интоксикации [12]. Сравнительный анализ показателя малонового диальдегида в опытной группе с контролем показал достоверную разницу между показателями. К концу эксперимента на фоне стресса отмечена тенденция выравнивания показателя с контролем (рис. 2).
Рис. 2. Среднее значение содержания малонового диальдегида в плазме крыс контрольной
и опытной групп при введении спиртового экстракта личинок G. mellonella
Наблюдается закономерность в повышении концентрации МДА в последующих взятиях проб в опытной группе по отношению к контролю и исходной точке. На 4-й неделе концентрация МДА в опытной группе составляет 4,5±0,2 мкмоль/л, на 8-й неделе – 4,6 мкмоль/л, а на 12-й – 4,7±0,2 мкмоль/л. В контрольной группе эти показатели варьируют, на 4-й неделе концентрация МДА – 4,5±0,6 мкмоль/л, на 8-й неделе продолжает уменьшаться до 3,5±0,6 мкмоль/л и на 12-й неделе чуть повышается до 3,8±0,4 мкмоль/л.
Достоверные отличия наблюдаются с 4-й недели в опытной группе относительно контроля. Можно предположить, что показатель МДА растет в крови опытной группы по причине перестройки мембран в клетке, и энергообеспечение происходит за счет липидов, а именно МДА. Наблюдается достоверный прирост, но из данных литературы мы знаем, что показатель МДА – это показатель адаптации, поэтому можно судить, что он тоже вовлечен в процесс энергообеспечения на фоне введения экстракта личинок БВМ.
Известно, что стресс вызывает стереотипную метаболическую реакцию, в том числе с усилением гипергликемии, что приводит к адаптационной стратегии выживания. В процессе расщепления глюкозы клетками организма высвобождается энергия, необходимая для обеспечения жизнедеятельности клеток. В начале эксперимента в контрольной группе уровень глюкозы крыс составлял 4,3±0,21 ммоль/л, в дальнейшем наблюдалось незначительное повышение уровня глюкозы в пределах нормы – 4,7±0,42, 5,2±0,47 и 5,0±0,56 ммоль/л соответственно. При введении экстракта личинок G. mellonella на фоне теста также отмечался стабильный уровень глюкозы в пределах нормы – 4,2±0,15; 4,3±0,36; 4,5±0,61; 5,5±0,63 ммоль/л. Достоверной разницы между полученными данными не выявлено.
Выявлено, что при введении спиртового экстракта процессы окисления запускаются быстрее. Поскольку известно, что пировиноградная кислота (ПВК) является конечным продуктом метаболизма глюкозы в процессе гликолиза, то отмечено, что на 4-й неделе глюкозы меньше, а ПВК больше, то есть процессы окисления идут быстрее, утилизация (мобилизация) глюкозы – интенсивнее. Относительно контрольной группы опытная группа имеет большие концентрации ПВК, кроме начала эксперимента и 12-й недели (рис. 3).
Рис. 3. Среднее значение содержания пировиноградной кислоты в плазме крыс контрольной
и опытной групп при введении спиртового экстракта личинок большой восковой моли
Средние значения по ПВК в контрольной и опытной группах не показали достоверных отличий между группами. Среднее значение варьируется, но по отношению к контролю в опытной группе наблюдается тенденция в повышении пировиноградной кислоты до 8-й недели, но на 12-й неделе уровень ПВК в контрольной группе превышает уровень в опытной группе. Такое резкое повышение концентрации пирувата, как в четвертом взятии контрольной группы, отмечается при мышечной работе.
В начале эксперимента у крыс контрольной группы концентрация лактата составляет 1,6±0,4 ммоль/л, у крыс опытной группы концентрация чуть больше и составляет 1,7±0,4 ммоль/л (рис. 4).
Рис. 4. Среднее значение содержания молочной кислоты в плазме крыс контрольной
и опытной групп при введении спиртового экстракта личинок БВМ
Тенденции в повышении молочной кислоты не наблюдается. Уровень молочной кислоты в плазме в норме во всех группах. Достоверных результатов нет как в отношении контрольных групп, так и достоверных отличий от исходных значений внутри группы.
Лактат является конечным продуктом анаэробного гликолиза. При физической нагрузке лактат выходит из мышц, превращается в пировиноградную кислоту в печени или метаболизируется мозговой тканью или сердцем [13]. Повышение концентрации лактата в крови наблюдается практически при любой физической деятельности, однако степень концентрации лактата в значительной мере зависит от характера выполненной работы и тренированности изучаемого объекта. Наибольший подъем уровня лактата в крови отмечается в зоне субмаксимальной мощности, так как в этом случае главным источником энергии для работающих мышц является анаэробный гликолиз, приводящий к образованию и накоплению молочной кислоты [14].
Достоверных изменений по лактату не выявлено. Повышение лактата и понижение ПВК происходят на 12-й неделе, можно предположить, что животные не успели восстановиться после физической нагрузки, поскольку забор крови осуществлялся на следующий день, а для восстановления организма требуются минимум сутки.
Отмечено, что спиртовой экстракт действует быстрее на показатели углеводного обмена уже на 4-й неделе, это свидетельствует о том, что введение спиртового экстракта повышает физическую выносливость и быстрее влияет на показатели углеводного обмена (энергетического). Выявлено, что в опытной группе в начале эксперимента дельта составляет -1,3, на 4-й неделе 10,2, на 8-й неделе 19,7 и в конце эксперимента -9,5. По значениям можно сделать вывод, что преобладает аэробный процесс окисления кислорода.
Содержание в организме ПВК тесно связано с содержанием продукта восстановления ПВК – молочной кислоты. Количественное соотношение этих кислот в крови является показателем соотношения интенсивности гликолитических и окислительных превращений углеводов, ее изменение указывает на нарушение нормального метаболизма, а также – какой путь окисления кислорода преобладает: аэробный или анаэробный [15]. Посчитав индекс ПВК/лактат, можно сделать вывод, что преобладает аэробный гликолиз.
Сравнивая контрольную и опытную группу в начале эксперимента, приходим к выводу, что концентрация мочевины опытной группы выше, чем у контрольной группы, и составляет 7,1±0,4 ммоль/л, а у контрольной группы – 6,1±0,4 ммоль/л. Концентрация опытной группы по отношению к контрольной выравнивается на 8-й и 12-й неделе и составляет 7±0,2 ммоль/л у обеих групп (рис. 5).
Рис. 5. Среднее значение содержания мочевины в плазме крыс контрольной и опытной групп
при введении спиртового экстракта личинок G. mellonella
Тенденции повышения мочевины наблюдаются в обеих группах, но к 12-й неделе концентрация мочевины выше, чем в начальной точке. В отношении контрольных групп достоверных результатов, как и достоверных отличий от исходных значений внутри группы, нет, поэтому нельзя утверждать, что концентрация мочевины повысилась из-за физической нагрузки. Достоверные отличия не наблюдаются между опытной группой и контролем Также нет достоверных отличий от исходного значения внутри группы.
В начале эксперимента в контрольной группе концентрация общего белка составляет 70,0±1,7 г/л, а у опытной группы относительно контроля концентрация чуть меньше и составляет 68,0±1,7 г/л (рис. 6).
Рис. 6. Среднее значение содержания общего белка в плазме крыс контрольной
и опытной групп при введении спиртового экстракта личинок БВМ
Наблюдается тенденция в повышении концентрации общего белка в опытной группе, однако данные не достоверны. Физическая нагрузка, даже незначительная, примерно на час повышает количество белка на 10 % [16].
Анализ биохимических показателей крови крыс при введении экстракта личинок G. Mellonella в тесте «Предельное плавание» показал, что повышение уровня стрессоустойчивости достигается при повышении углеводного обмена (аэробный гликолиз), что свидетельствует об ускоренном процессе запускания механизмов адаптации при стрессовом факторе.
Заключение
- Результаты проведенного теста «Принудительное плавание» свидетельствуют о том, что на фоне приема 40%-го экстракта из нативных личинок G. mellonella время предельного плавания увеличилось c 237,0±172,9 до 5298,5± 3471,4 секунд
- Введение 40%-го экстракта из нативных личинок большой восковой моли приводило к достоверному повышению концентрации малонового диальдегида относительно контрольной группы без выхода средних значений за пределы физиологической нормы.
1. Neudahin E.V., Moreno I.G. K voprosu o patogeneze ateroskleroza i korrekcii aterogennyh narusheniy u detey // RMZh. 2018. № 9. S. 62–68.
2. Karomatov I.Dzh., Abduvohidov A.T. Levzeya saflorovidnaya, bol'shegolovnik, maraliy koren' – rastenie adaptogen // Biologiya i integrativnaya medicina. 2017. № 2. S. 180–186.
3. Karomatov I.D., Karomatov S.I. Voskovaya mol' – perspektivnoe lechebnoe sredstvo // Biologiya i integrativnaya medicina. 2016. № 3. S. 56–65.
4. Sravnitel'naya ocenka preparatov protiv bol'shoy voskovoy moli / I.S. Shul'ga [i dr.] // Aktual'nye voprosy veterinarnoy biologii. 2020. № 3(47). S. 57–61. DOI:https://doi.org/10.24411/2074-5036-2020-10031.
5. Shishkanov A.V., Ivanova E. B., Shalatilova A.G. Ognevki (Lepidoptera: Piralidae) kak naibolee opasnye vrediteli v pchelovodstve // Prikladnaya entomologiya. 2013. № 2 (10). T. 4. S. 10–14.
6. Osokina A.S., Maslennikov I.V. Opredelenie mikrobnoy chuvstvitel'nosti k ekstraktam iz lichinok bol'shoy voskovoy moli (Galleria mellonella L.) i ih produktov zhiznedeyatel'nosti // Vestnik KrasGAU. 2020. № 7. S.100–107. DOI:https://doi.org/10.36718/1819-4036-2021-7-100-107.
7. Antioksidantnoe i immunoprotektornoe deystvie ekstrakta lichinok voskovoy moli pri okislitel'nom stresse u krys, vyzvannom potrebleniem korma, obogaschennogo zhelezom / A.A. Ovsepyan [i dr.] // Vestnik novyh medicinskih tehnologiy. 2010. № 1. S. 21–28.
8. European convention for protection of vertebrate animals used for experimental and ether scientific purpose // Council of Europe. 18.03.1986. Strasburg, 1986. 52 p.
9. Pat. RU 2038086 Rossiyskaya Federaciya. Sposob polucheniya biologicheski aktivnogo produkta iz lichinok bol'shoy voskovoy moli / Spiridonov N.A., Rachkov A.K., Muhin S.A., Kondrashova M.N.; zayavitel' Institut teoreticheskoy i eksperimental'noy biofiziki AN SSSR, patentoobladatel' Spiridonov N.A. № 4938002/14; zayavl. 26.03.1991; opubl. 27.06.1995, Byul. №18. 9 s.
10. Razrabotka metodiki ocenki fizicheskoy vynoslivosti melkih laboratornyh zhivotnyh dlya izucheniya adaptogennoy aktivnosti lekarstvennyh preparatov / V.N. Karkischenko [i dr.] // Biomedicina. 2011. № 1. S. 72–74.
11. Nalle S.C., Turner J.R. Intestinal barrier loss as a critical pathogenic link between inflammatory bowel disease and graftversus-host disease. // Mucosal Immunol. 2015. № 8. P. 720–730.
12. Uzbekov M.G. Perekisnoe okislenie lipidov i antioksidantnye sistemy pri psihicheskih zabolevaniyah // Social'naya i klinicheskaya psihiatriya. 2014. T. 24, № 4. S. 97–103.
13. Bakaneva V.F. Biologicheski aktivnye veschestva iz lichinok Galleria mellonella i produktov zhiznedeyatel'nosti pchel kak potencial'nye kardioprotektory i adaptogeny pri deystvii gipodinamicheskih i stressornyh faktorov na organizm eksperimental'nyh zhivotnyh i cheloveka: dis. … kand. biol. nauk: 14.00.51. M., 2002. 76 s.
14. Ivashev M.N., Kruglaya A.A., Savenko I.A. Biologicheskaya aktivnost' soedineniy iz rastitel'nyh istochnikov // Fundamental'nye issledovaniya. 2013. № 10-7. S. 1482–1484.
15. Crawley J.N. Behavioral phenotyping strategies for Galleria mellonella // Neuron. 2008. Vol. 57. P. 809–818.
16. Global differential gene expression in response to growth temperature alteration in group A Streptococcus / L.M. Smoot [et al.] // ProcNatlAcadSci USA. 2001. № 98. P. 10416–10421.
