Russian Federation
Russian Federation
The aim of research is to study the structure formation in the system of muscle proteins of the giant grenadier Albatrossia pectoralis under the action of transglutaminase when using dietary fibers of animal origin as substrates. The objectives of the study are to determine the change in the viscosity of collagen and chitosan solutions under the action of transglutaminase, to determine the rheological properties and fractional composition of muscle tissue proteins of the object of deep-sea fishing of the giant grenadier in the presence of dietary fibers and transglutaminase. The study was conducted on the basis of the Research Institute of Innovative Biotechnologies of the Far Eastern State Technical Fisheries University in Vladivostok. The efficiency of the catalytic action of the enzyme was evaluated by changing the viscosity of solutions when collagen and its combined solutions containing high-molecular-weight chitosan or its derivative (chitosan lactate) were used as substrates. A direct dependence of viscosity on the concentration of the enzyme is shown with its greatest increase in the presence of chitosan lactate. An analysis of the dynamics of changes in viscosity suggested that chitosan lactate affects the direction of formation of intra- and intermolecular bonds of collagen. The addition of collagen and chitosan lactate to the minced muscle tissue of the giant grenadier in the presence of transglutaminase made it possible to increase the strength of the samples by 90 % compared to the initial raw material, ensuring the retention of water and the preservation of the shape of finished products after heat treatment. The fractional composition of proteins in the muscle tissue of the giant grenadier after fermentation was studied by electrophoresis. The changes corresponding to the polymerization of proteins, the preservation of the direction of enzymatic catalysis with a decrease in the amount of low molecular weight proteins and an increase in the amount of high molecular weight protein aggregates, which enhance the strength of the samples, are shown. The resulting product can be positioned as a functional product.
giant grenadier, transglutaminase, collagen, chitosan
Введение. В связи с сокращением объема вылова традиционных объектов рыбного промысла актуальной является проблема использования нетрадиционного сырья для производства пищевой продукции. Рациональное использование водно-биологических ресурсов может быть обеспечено переработкой недоиспользуемых объектов и вторичного сырья. Современное перспективное направление переработки – применение ферментных технологий с использованием трансглутаминазы (ТГ) для улучшения структурно-механических свойств мышечной ткани [1]. Процессы эффективной ферментативной сшивки макромолекул могут быть реализованы в присутствии белковых и углеводных субстратов, что позволяет усилить функциональную значимость продуктов. Работы в этом направлении интенсивно ведутся в Японии, Китае и других странах АТР [2–3]. Также исследования последних лет показывают безопасность использования ТГ в продуктах, подвергнутых термической обработке [4].
В настоящее время промышленный промысел глубоководных видов рыб имеет большие перспективы. Одним из многочисленных глубоководных видов рыб северной части Тихого океана является макрурус малоглазый Albatrossia pectoralis, возможность вылова которого составляет до 30–40 тонн в сутки. Однако, несмотря на хорошие питательные свойства и большие запасы, макрурусы остаются недоиспользованными из-за особенностей мышечной ткани: высокой обводненности и неспособности миофибриллярных белков удерживать воду при различных способах технологической обработки [5].
Добавление пищевых волокон (ПВ) в рыбные продукты представляет большой интерес как для улучшения технологических свойств продуктов, так и для усиления их функциональности. С технологической точки зрения введение ПВ улучшает связывание воды, прочность, эмульсионную способность и желирующие свойства продуктов. С физиологической точки зрения добавление ПВ усиливает полезные эффекты рыбной продукции (снижение уровня холестерина, гликемического индекса, увеличение пребиотической емкости) [6]. Такие ПВ, как коллаген и хитозан, могут быть рассмотрены в качестве субстратов ТГ в реакции образования изопептидных связей, образующих прочный и термостабильный каркас в структуре мышечной ткани. Участие коллагена в этом процессе целесообразно, но требует дополнительных исследований [7]. Использование хитозана находится на начальной стадии исследований, имеются противоречивые данные по участию его в образовании сшивок с молекулами белков [8]. Но во всех исследованиях отмечаются антимикробные и антиоксидантные качества, обеспечивающие увеличение сроков хранения продукции [9].
Цель исследования – изучить структурообразование в системе мышечных белков макруруса малоглазого под действием трансглутаминазы при использовании в качестве субстратов пищевых волокон животного происхождения.
Задачи: изучить изменение вязкости растворов коллагена и хитозана под действием ТГ, определить реологические свойств и фракционный состав белков мышечной ткани макруруса в присутствии ПВ и ТГ.
Условия, материалы и методы. Все экспериментальные исследования проводились в лаборатории НИИ инновационных биотехнологий Дальневосточного государственного рыбохозяйственного университета («Дальрыбвтуз»).
Макрурус малоглазый Albatrossia pectoralis выловлен в Охотском море в 2020 г. Срок хранения замороженных образцов 3–4 мес. В качестве ПВ использовали коллаген из кожи минтая, высокомолекулярный хитозан и лактат хитозана (ООО «ФармОушенЛаб», Россия), ферментный препарат ACTIVA® TG-TI («Аджиномото Ко. Инк.» Япония).
Динамическую вязкость растворов (ʋ, мПа/с) определяли на ротационном вязкозиметре «FungilabSMARTR» («Fungilab»), используя шпиндель R4, скорость вращения 100 об/мин. Величину прочности образцов на разрыв (Н) определяли на приборе Валента ВЦ-1 с грибовидным индентором.
Для определения прочности были приготовлены образцы: фарш макруруса без добавок; фарш с добавлением 1 % ПВ без ТГ; фарш с добавлением 1м % ПВ и 0,1 % мТГ; фарш с добавлением 1 % ПВ и 0,25 % мТГ; фарш с добавлением 1 % ПВ и 0,5 % мТГ. Образцы помещали в поливиниловую оболочку (диаметр образца 2,5 см), плотно запечатывали с обоих концов, помещали на водяную баню и выдерживали при 25 °С в течение 2 ч, после чего фермент инактивировали при 90 °С в течение 20 мин. После охлаждения измеряли прочность.
Электрофорез (ЭФ) проводили в 7%-м полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). Для экстракции белков образцы выдерживали в 1/15 М фосфатном буфере, содержащем 0,5 М КCl, при 40 °С в течение 3 часов Для получения геля использовали
Результаты и их обсуждение. Ранее нами была показана целесообразность сочетания двух различных типов структурообразователей – желатина и хитозана – в технологии желеобразных продуктов из мышечной ткани макруруса малоглазого [5]. Полученные студни имели доказанные высокие питательные и органолептические качества, биологическую ценность. Однако данный вид кулинарной продукции имел ограниченный потребительский спрос, предпочтительными являются формованные рыбные изделия, выдерживающие тепловую обработку при сохранении текстуры. Также было показано, что для получения прочной структуры мышечной ткани макруруса недостаточно введения ТГ, что связано с очень низкой концентрацией миофибриллярных белков. Только использование дополнительных белковых и/или углеводных субстратов инициирует формирование полимерной сети, стабилизирующей структуру мышечного геля. Определяющим фактором термостабильности готового пищевого продукта является реакция образования изопептидных связей.
Коллаген считается хорошим субстратом для ТГ, но в водном растворе происходит самосборка его отдельных цепей в трехспиральную структуру, близкую к нативной. Это затрудняет реакцию его взаимодействия с ТГ [10]. Поэтому важно установить факторы, влияющие на этот процесс. Вторым компонентом из разряда ПВ был взят хитозан в двух его формах: коммерческий препарат с Мм 588 кДа и степенью деацилирования 75 % и лактат хитозана, полученный на его основе. Оба этих продукта являются поликатионами, но отличаются растворимостью, которая зависит от степени протонирования аминогрупп, рН системы и рКа кислоты [11]. При этом хитозан растворяется при рН менее 6,0, а лактат хитозана растворим в воде. Относительно способности хитозана быть субстратом для ТГ существуют противоречивые данные [9, 12]. С одной стороны, постулируется, что аминогруппы хитозана могут служить акцепторами ацильных групп в реакции переноса ацила от γ-карбоксиламидных групп к глутамильным остаткам белка. С другой стороны, его присутствие рассматривается как препятствие для образования межбелковых сшивок. Но во всех случаях отмечено стабилизирующее влияние на текстуру продукта и значимость в качестве ПВ.
При определении влияния ПВ на эффективность действия ТГ использовали следующие системы в виде растворов: коллаген + ТГ (1); коллаген + хитозан + ТГ (2); коллаген + лактат хитозана + ТГ(3). Концентрация мТГ составляла 0,1; 0,25 и 0,5 % для каждого образца соответственно. рН растворов поддерживали на уровне 6,0±0,2, что входит в диапазон активности мТГ [1]. Соотношение ПВ было определено по способности к образованию однородной системы, содержащей в растворенном состоянии 4 % коллагена и 1 % хитозана или лактата хитозана. Эффективность реакции оценивали по увеличению вязкости. Вязкость исходных растворов составила для образцов без добавления фермента: 29,8 (1); 38,3 (2) и 31,0 мПа/с (3). Динамика изменений вязкости представлена на рисунке 1. Время становления максимальной вязкости составило для растворов: (1) – 90 мин, (2) – 75 мин, (3) – 105 мин при всех концентрациях ТГ. При этом увеличение вязкости по сравнению с контролем было максимальным при концентрации фермента 0,5 % и составило 109, 110 и 120 % соответственно.
Как видно из рисунка 1, для всех образцов характерно первоначальное снижение вязкости по сравнению с контролем (без ТГ), что связано с разбавлением при добавлении раствора фермента. Выраженное повышение вязкости проявилось только через 30–45 мин и продолжалось до 75–105 мин с различной интенсивностью в зависимости от состава образцов. Наиболее высокие значения вязкости отмечены для образцов, содержащих коллаген и лактат хитозана, – прирост значений к контролю составил почти 20 %. При добавлении высокомолекулярного хитозана эта величина не превышала 10 %, что было практически равным величине вязкости для чистого коллагена. Способность одинарных цепей коллагена в растворе самоорганизовываться в трехспиральные фибриллы, стабилизирумые водородными связями, приводило к маскировке реакционноспособных групп и снижало эффективность действия ТГ. Добавление реагентов, препятствующих образованию водородных связей, обеспечивало ферментативный катализ. При этом график изменения контролируемых показателей в процессе самосборки коллагена имел типичную сигмоидную конфигурацию. Лаг-фаза соответствовала процессу формирования волокон, а выход на плато – окончанию процесса [10].
Доказательством изменений вязкости именно под действием фермента является зависимость процесса от концентрации ТГ. Во всех случаях наблюдали линейную зависимость вязкости от концентрации фермента (рис. 2).
|
|
|
|
|
|
Рис. 1. Динамика изменения вязкости под действием различных концентраций ТГ в образцах:
А – коллаген; Б – коллаген + лактат хитозана; В – коллаген + хитозан;
1 – 0,1 % мТГ; 2 – 0,25 % мТГ; 3 – 0,5 % мТГ
Рис. 2. Зависимость изменения вязкости растворов от концентрации ТГ:
1 – коллаген; 2 – коллаген + лактат хитозана; 3 – коллаген + хитозан
В нашем эксперименте для образцов коллагена без добавления хитозана графики имели сигмоидную форму, наиболее выраженную при минимальной концентрации ТГ. Добавление хитозана нивелирует эту зависимость, однако в значительно меньшей степени, чем лактата хитозана. Сопоставляя эти результаты с литературными данными, можно предположить, что хитозан способен тормозить самосборку коллагена, препятствуя образованию внутримолекулярных взаимодействий. Это увеличивает возможности формирования межмолекулярных ковалентных сшивок с помощью ТГ. Образование такого ферментативно реструктурированного коллагена повышает температуру его денатурации и термостабильность продуктов на его основе. Это, в свою очередь, очень важно для получения продуктов из мышечной ткани глубоководных рыб, так как способствует удержанию воды, увеличению прочности и сохранению формы.
Полученные результаты были использованы для изучения процессов взаимодействия системы коллаген+ лактат хитозана + ТГ при добавлении к мышечной ткани макруруса малоглазого (табл. 1).
Таблица 1
Влияние различных концентраций ТГ на прочность системы миофибриллярных белков
макруруса малоглазого с добавлением ПВ
|
ТГ, % к сырью |
ПВ, % к сырью |
Прочность, Н |
Прирост к контролю, % |
|
0 |
0 |
0,844±0,043 |
100 |
|
0 |
1 |
1,001±0,057 |
118,6±2,9 |
|
0,1 |
1 |
1, 119±0,086 |
132,6±3,7 |
|
0,25 |
1 |
1, 579±0,088 |
187,8±5,3 |
|
0,5 |
1 |
1, 618±0,090 |
192,2±5,5 |
Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности использования выбранного способа для повышения прочности фаршей на основе мышечной ткани макруруса малоглазого, что может быть использовано в технологии формованной рыбной продукции.
Для выяснения изменения молекулярного-массового распределения белков в мышечной ткани макруруса после обработки ТГ использовали метод ЭФ (рис. 3).
После сканирования гелей были получены данные, характеризующие изменения в количественном составе белковых фракций после проведения ферментативной реакции (табл. 2).
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
М |
|
|
|
250 |
|||||
|
130 |
||||||
|
100 |
||||||
|
70 |
||||||
|
55 |
||||||
|
35 |
||||||
|
25 |
||||||
|
15 |
||||||
|
8 |
||||||
Рис. 3. Разделение белков методом электрофореза в 7 %-м ДСН-ПААГ:
1 – контроль + 0,5 % ТГ; 2 – контроль без добавок. Образцы с добавлением 1 % системы лактат хитозана + коллаген при различных концентрациях ТГ: 3 – 0,5 %; 4 – 0,1 %; 5 – 0,25 %; М –маркеры
Таблица 2
Распределение белковых фракций после ЭФ образцов мышечной ткани макруруса
(номера образцов соответствуют указанным на рисунке 3)
|
Мм, кДа |
8 |
15 |
30 |
43 |
46 |
52 |
57 |
62 |
72 |
105 |
110 |
128 |
250 |
|
Площадь пиков, мм2 |
|||||||||||||
|
1 |
172 |
– |
– |
1173 |
– |
281 |
– |
– |
– |
– |
– |
66 |
74 |
|
2 |
553 |
– |
439 |
1295 |
1945 |
1350 |
– |
– |
227 |
478 |
374 |
668 |
343 |
|
3 |
1924 |
2115 |
– |
4111 |
– |
5673 |
691 |
832 |
– |
1393 |
2198 |
1134 |
1058 |
|
4 |
695 |
910 |
– |
3187 |
– |
4146 |
535 |
632 |
– |
857 |
891 |
636 |
575 |
|
5 |
230 |
925 |
– |
1383 |
– |
755 |
– |
– |
– |
275 |
323 |
519 |
864 |
Как показывают результаты, в исходном сырье преобладали белки с Мм 43–52 кДа, относящиеся к группе миогенов. Миофибриллярные белки с Мм 220 кДа и выше образовывали пики меньшей интенсивности. После воздействия ТГ снизилась доля как миогенов, так и миофибриллярных белков, вероятно, за счет образования высокомолекулярных конъюгатов, не входящих в диапазон разделяемых компонентов. Также полностью исчезли фракции в диапазоне 57–110 кДа. В присутствии ПВ характер воздействия фермента изменился. Сохранилось преобладание миогенов, однако их количество снижалось по мере увеличения концентрации ТГ. При этом с ростом концентрации фермента также снизилось количество фракций в диапазоне 57–110 кДа. Возможно, происходит увеличение количества высокомолекулярных конъюгатов, не входящих в диапазон разделяемых компонентов. Сопоставление результатов изменения молекулярно-массового распределения белков мышечной ткани макруруса малоглазого в присутствии системы коллаген + лактат хитозана и реологических характеристик этих образцов позволяет говорить, что субстратная специфичность и направленность воздействия в этих условиях не изменяются, но количество белковых фракций в их полимерной форме возрастает. Это служит причиной повышения прочности образцов и может быть использовано в технологии формованных продуктов из обводненного рыбного сырья.
Заключение. Исследовано влияние коллагена, хитозана и лактата хитозана на каталитическое действие ТГ, оцениваемое по увеличению вязкости растворов, наибольший рост которой наблюдается в присутствии лактата хитозана. Выраженное действие ТГ проявляется через 45 мин инкубации, максимальное повышение вязкости происходит через 90 мин с разной интенсивностью для отдельных образцов. Полученные результаты позволяют предположить, что лактат хитозана способен тормозить самосборку коллагена и обеспечивать формирование межмолекулярных ковалентных сшивок с помощью мТГ. При исследовании влияния системы коллаген + лактат хитозана на формирование текстуры мышечной ткани макруруса малоглазого показано увеличение прочности мышечной ткани на 90 % по сравнению с исходным сырьем, что обеспечивает удержание воды и сохранение формы готовых изделий после термообработки. Исследование фракционного состава белков мышечной ткани макруруса малоглазого под действием ТГ показывает, что внесение коллагена и лактата хитозана не изменяет направленность действия фермента, но обеспечивает уменьшение фракции миогенов и повышение количества высокомолекулярных белковых агрегатов. Полученные результаты служат обоснованием технологии формованного продукта из фарша макруруса малоглазого, который может быть позиционирован в качестве изделия функционального назначения.
1. Gaspar A., de Góes-Favoni S. Action of microbial transglutaminase in the modification food proteins // Food Chem. 2015. V. 171. P. 315–322.
2. Kuraishi C., Yamazaki K. Susa Y. Transgluta-minase: Its utilization in the food industry // Food Reviews International. 2001. V. 17. P. 221–246.
3. Ahhmed A.M., Kuroda R., Kawahara S. et al. Dependence of microbial transglutaminase on meat type in myofibrillar proteins cross-linking // Food Chemi. 2009. V. 112. P. 354–361.
4. Gartovannaya E.A., Ivanova K.S. Biologicheskaya bezopasnost' farsha na osnove myasa perepela, obogaschennogo belkovo-uglevodnoy kompoziciey i fermentom transglyutaminazoy // Vestnik KrasGAU. 2020. № 1. S. 139–145.
5. Pivnenko T.N., Karpenko Y.V., Krashchen-ko V.V. et al. Biochemical factors affecting the quality of products and the technology of processing deep-sea fish Albatrossia pectoralis // J. Ocean Univ. China. 2020. V. 19. R. 681–690.
6. Borderıas A., Sanchez-Alonso I., Perez-Mateos M. New applications of fibres in foods: Addition to fishery products // Trends Food Sci Technol. 2005. V. 16. P. 458–465.
7. Cheng S., Wang W., Li Yu et al. Cross-linking and film-forming properties of transglutami-nase-modified collagen fibers tailored by denaturation temperature // Food Chem. 2019. V. 271 (15). P. 527–535.
8. Benjakul S., Visessangua W., Phatchrat S., Tanaka M. Chitosan affects transglutaminase-induced surimi gelation // J. Food Biochem. 2002. V. 27. P. 653–661.
9. Jeon Y., Shahidi F., Kim S. Preparation of chitin and chitosan oligomers and their applications in physiological functional foods // Food Reviews International. 2000. V. 16 (2). P. 159–176.
10. Nomura Y., Toki S., Ishii Y., Shirai K. Improvement of shark type I collagen with microbial transglutaminase in urea // Biosci. Biotechnol. Biochemi. 2001. V. 65 (4). R. 982–985.
11. Rinaudo M., Pavlov G., Desbrieres J. Solubilization of chitosan in strong acid medium // Int. J. Polym. Anal. Charact. 1999. V. 5. P. 267–276.
12. Gómez-Guillén C., Montero P.M., Solas T. et al. Effect of chitosan and microbial transglu-taminase on the gel forming ability of horse mackerel muscle under high pressure // Food Res Int. 2005, V. 38 (1). R. 103–110.
13. Ooizumi T., Xiong Y.L. Identification of cross‐linking site(s) of myosin heavy chains in oxidatively stressed chicken myofibrils // Food Science. 2006. V. 71 (3). P. 196–199.
