The aim of research is to study the influence of the stage of development (size), the time of treatment of the buds with low positive temperatures and the genotype of the donor sample on the dedifferentiation of callus from unpollinated ovules of spring rape. Research objectives: to introduce isolated ovules into in vitro crop and determine the frequency of explants dedifferentiation on Murashige-Skoog (MS) agar nutrient medium with the addition of growth regulators 2,4-D (2-4 dichlorophenoxyacetic acid) and kinetin at 5.0 mg / l. The objects of the study were non-pollinated ovules of eight hybrid samples of spring rape. Samples 1 and 2 formed callus tissue with a frequency of 2.6 and 2.5 %, respectively. Ovules isolated from buds of the studied sizes (2.0; 4.0; 6.0 mm) differed in the frequency of callus dedifferentiation from 11.59 to 16.95 %. The ovules isolated from the 6.0 mm buds were the most competent for callus formation and formed callus with a maximum frequency of 16.95 %. Treatment of inflorescences for 24, 36 and 60 hours at low temperatures of 4 ± 1 ° C does not have a positive effect on the formation of callus tissue from ovules. The frequency of dedifferentiation decreases from 7.29 % without treatment of buds to 1.24 % - with 60 hours of treatment. The results of the cultivation of ovules on the initial nutrient medium showed that the frequency of dedifferentiation in the studied genotypes of spring rape varied from 0.2 (sample 188) to 2.6 % (sample 1). Ovules isolated from donor plants obtained using tissue culture induced callus tissue at a frequency of 15.57 %. Secondary structures and seedlings were obtained on MS medium supplemented with 6-BAP (6-benzylaminopurine) - 0.5 mg / L and kinetin - 3.0 mg / L. The results obtained indicate the effect of preprocessing, the size of the buds and the genotype of the donor plant on the frequency of dedifferentiation of ovules of spring rape.
nutrient medium, genotype, non-pollinated ovules, ovules, callus formation.
Введение. Рапс яровой (Brassica napus L.) – ценная масличная и кормовая культура, хорошо приспособленная для возделывания в умеренном климате. С точки зрения физиологии питания человека рапсовое масло имеет преимущество перед другими растительными маслами, так как содержит все физиологически важные кислоты в оптимальном соотношении [1].
Одним из важных элементов повышения продуктивности рапса является возделывание гетерозисных гибридов на стерильной основе.
В гетерозисной селекции основным требованием, предъявляемым к родительским формам, является их гомозиготность по большинству генов. Одним из путей получения гомозиготных линий ярового рапса является гаплоидия. При использовании гаплоидии процесс формирования гомозиготных линий по сравнению с традиционными методами селекции сокращается на 5–7 лет [2].
У растений с мужской стерильностью гиногенез является единственным способом получения гаплоидов, так как признак ЦМС передается только с материнской цитоплазмой. Разработка нового регламента получения исходных форм в достаточном количестве и внедрение этих разработок в селекционный процесс будет способствовать получению конкурентоспособных гибридов с комплексом желаемых хозяйственно полезных признаков [3].
Цель исследования: изучение влияния стадии развития семязачатков (размера бутонов), времени обработки бутонов пониженными положительными температурами и генотипа донорного образца на дедифференциацию каллуса из неопыленных семязачатков ярового рапса.
Задачи исследования: ввести в культуру in vitro изолированные семязачатки и определить частоту дедифференциации эксплантов на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга (MS) с добавлением регуляторов роста 2,4-Д
(2-4 дихлорфеноксиуксусная кислота) и кинетина по 5,0 мг/л.
Объекты и методы исследования. В качестве донорного материала использовались гибриды F1 и образцы, полученные через культуру тканей in vitro. Бутоны собирали с центральной кисти, так как по сравнению с побегами первого и второго порядков они обладают лучшей способностью к каллусообразованию и регенерации растений [4]. Длина бутонов, взятых для исследования, составляла 2,0; 4,0; 6,0 мм.
Для повышения индуцирующей способности неоплодотворенных семязачатков проводили предобработку бутонов низкими положительными температурами. Собранные бутоны помещали в холодильник на 24; 36 и 60 ч при температуре 4+1 ºС. В качестве стерилизующего агента использовался 7 % раствор Domestos, экспозиция бутонов в растворе составляла 10 мин. Затем бутоны 3–4 раза промывались стерильной дистиллированной водой. Изолирование семязачатков проводили в стерильных условиях ламинар-бокса под бинокулярной лупой (МБС-10). После извлечения из завязей семяпочки помещались на поверхность питательной среды по 16–22 шт. Культивирование неоплодотворенных семяпочек проводилось на поверхности питательной среды Мурасиге и Скуга (МS) с добавлением 2,4-Д (2-4 дихлорфеноксиуксусная кислота) и кинетина по 5,0 мг/л [5]. Культивирование эксплантов проводили при 16-часовом фотопериоде и температуре 25+2 ºС. Наблюдение за культурой и анализ динамики развития проводили каждые 10 дней.
Результаты исследования. При введении в культуру in vitro семяпочки отличались размерами, плотностью оболочек и цветом. Семязачатки, изолированные из бутонов, длиной от 2,0 до 3,0 мм, отличались малыми размерами, имели светлый цвет и почти прозрачные покровы. Семязачатки, изолированные из более крупных бутонов, обладали не только большим размером, но и более плотными оболочками и имели светло-зеленый цвет.
Через неделю культивирования неоплодотворенные семяпочки увеличились в размерах и благодаря накоплению хлорофилла приобрели темно-зеленый цвет. В этот же период наблюдали начало образования соматического каллуса из клеток фуникулуса, которые не были удалены при изолировании семязачатков (рис. 1). Образовавшийся шероховатый, зеленый, плотный каллус удаляли при пересадке на органогенную среду.
Рис. 1. Развитие неоплодотворенных семязачатков
на инициальной питательной среде через 30 сут
Процессы формирования морфогенной каллусной ткани из семязачатков протекали медленно. Большая их часть останавливалась в развитии и погибала. Отзывчивые семяпочки на первичной среде формировали морфогенный каллус, а при пересадке на органогенную среду наблюдали формирование как морфогенного каллуса, так и зеленых вторичных новообразований (рис. 2).
Семяпочки, извлеченные из бутонов исследуемых размеров (2,0; 4,0; 6,0 мм), проявляли разную способность к каллусообразованию. Интервал отзывчивости составил от 11,59 до 16,95 % (табл. 1). Наиболее компетентными к регенерации оказались семязачатки, извлеченные из бутонов размером 6,0 мм (т. е. содержащие зрелый или почти зрелый зародышевый мешок).
|
a |
|
b |
|
Рис. 2. Дедифференциация семязачатков:
а – морфогенный каллус; b – вторичные структуры
Таблица 1
Влияние размера бутонов на инициацию гиногенеза ярового рапса in vitro
|
Размер бутонов, мм |
Количество культивируемых семяпочек, шт. |
Частота каллусообразования, % |
|
2,0 |
69 |
11,59 |
|
4,0 |
194 |
12,89 |
|
6,0 |
596 |
16,95 |
|
НСР0,05 |
0,05 |
|
Полученные данные согласуются с целым рядом отечественных научных работ, где показано, что разные виды покрытосеменных растений имеют различные оптимальные стадии развития зародышевого мешка для инициации гиногенеза и переключения программы развития с гаметофитного на спорофитный путь. Например, исследования, проводившиеся на огурце (Cucumis sativus L.) [6] и сахарной свекле (Beta vulgaris L.), также показали, что изолированные неоплодотворенные семяпочки в условиях in vitro способны к новообразованиям на всех этапах развития [7]. Но наиболее предпочтительными являются семязачатки, имеющие зрелый или почти зрелый зародышевый мешок.
Эффект от обработки бутонов пониженными положительными температурами (4±1 ºС) имел обратную зависимость от длительности воздействия. Наибольшую отзывчивость проявляли семязачатки, которые не подвергались воздействию пониженных температур (табл. 2). Обработка соцветий свыше 24 ч приводила к снижению степени дедифференциации семяпочек in vitro.
Зависимость регенерационной способности семязачатков от температурного воздействия была отмечена и на других культурах. Так, в исследованиях, проводившихся на сахарной свекле, авторы отмечали некоторое увеличение регенерационной способности при предварительной обработке пониженной температурой [8].
Таблица 2
Влияние предобработок бутонов пониженными положительными
температурами на дедифференциацию неоплодотворенных семяпочек
ярового рапса
|
Время предобработки, ч |
Количество культивируемых семяпочек, шт. |
Частота |
|
Без обработки |
2319 |
7,29 |
|
24 |
2955 |
6,67 |
|
36 |
1871 |
1,76 |
|
60 |
1208 |
1,24 |
|
НСР0,05 |
0,14 |
|
В таблице 3 представлены результаты культивирования семязачатков гибридных образцов ярового рапса, используемых в исследовании. Изучаемые генотипы обладают различной способностью к дедифференциации семяпочек в культуре in vitro. Частота дедифференциации у исследуемых образцов составила от 0,2 (обр. 188) до 2,6 % (обр. 1). Наибольшей отзывчивостью отличаются образцы 1 и 2, у которых наблюдалась дедифференциация семяпочек 2,6 и 2,5 % соответственно. Различия между этими образцами несущественны.
Таблица 3
Отзывчивость гибридных образцов в культуре in vitro
|
Номер образца |
Количество культивируемых семяпочек, шт. |
Частота каллусообразования, % |
|
1 |
1138 |
2,6 |
|
2 |
827 |
2,5 |
|
185 |
639 |
0,5 |
|
186 |
1117 |
0,9 |
|
187 |
1741 |
1,0 |
|
188 |
927 |
0,2 |
|
189 |
788 |
1,0 |
|
190 |
1559 |
1,5 |
|
Всего |
8536 |
1,37 |
|
НСР0,05 |
0,45 |
|
Известно, что образцы, полученные с использованием культуры тканей in vitro, способны изменять статус генотипа донорного растения. Возникают генетические вариации – важная составляющая любой селекционной программы [9]. В таблице 4 показаны результаты культивирования неопыленных семяпочек из донорных растений, полученных через гиногенез (ГГ), андроклинию (АЛ) и каллусогенез (R – из каллуса листового эксплантата). Средняя частота каллусообразования у образцов, прошедших через культуру тканей, существенно выше (15,57 %), чем у исходных образцов (1,37 %). Особенно это видно при дедифференциации каллуса у донорного образца № 190 – 1,5 % и биотехнологических линий ГГ 190 – 29,7 % и АЛ 190 –
10,2 % (табл. 3, 4).
Таблица 4
Отзывчивость образцов, полученных через культуру тканей in vitro
|
Номер образца |
Количество культивируемых семяпочек, шт. |
Частота каллусо-образования, % |
|
ГГ 404 |
53 |
7,54 |
|
ГГ 440 |
154 |
6,49 |
|
R 404 |
204 |
8,33 |
|
ГГ 190 |
306 |
29,7 |
|
АЛ 190 |
195 |
10,2 |
|
|
912 |
15,57 |
|
НСР0,05 |
2,92 |
|
Морфогенные каллусы, полученные на инициальной среде, а также вторичные структуры культивировали на среде MS с добавлением
6-БАП – 0,5 мг/л и кинетина – 3,0 мг/л, формировали меристематические зоны и проростки.
Выводы. В ходе настоящего исследования было установлено, что лучшая частота дедиффенренциации семязачатков ярового рапса получена при изолировании их из бутонов размером 6 мм. Предобработка пониженными положительными температурами (4±1 ºС) ингибирует развитие образования каллуса с 7,29 до
1,24 %. Также на дедифференциацию семязачатков влияет генотип донорного образца и способ их получения.
1. Ackman R.G. Canola fatty acids: an ideal mixture for health, nutrition and food use // F. Shahidi (ed.), Canola and Rapeseed: Production, Chemistry, Nutrition and Processing Technology. Van Nostrand Reinhold, New York. 1990. R. 81–98.
2. Ellialtioglu S., Sari N., Abak K. Production of haploid plants // In: Babaoglu M., Gazel E., Ozcan S. (eds) Plant biotechnology I, Selcuk Univ. Press. 2001. P. 137–189.
3. Zhuzhzhalova T.P., Kolesnikova E.O., Cherkasova N.N. i dr. Perspektivnye tehnologii izolirovannyh tkaney v selekcionnom processe saharnoy svekly // Rossiyskaya sel'skohozyaystvennaya nauka. 2018. № 6. S. 13–18.
4. Kotlyarova E.B. Aspekty primeneniya metodov biotehnologii v selekcii yarovogo rapsa (Brassica napus L.): avtoref. dis. … kand. biol. nauk: 06.01.05. Ramon', 2007. 24 s.
5. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol plant. 1962. V. 15. P. 215–222.
6. Shmykova N.A., Suprunova T.P. Indukciya ginogeneza v kul'ture in vitro neopylennyh semyapochek Cucumis sativus L. // Gavrish. 2009. № 4. S. 40–44.
7. Zhuzhzhalova T.P. , Podvigina O.A., Znamenskaya V.V. i dr. Gaploidnyy partenogenez in vitro u saharnoy svekly (Beta vulgaris): faktory i diagnosticheskie priznaki // Sel'skohozyaystvennaya biologiya. 2016. T 51,№ 5. S. 636–644.
8. Vasil'chenko E.N., Kolesnikova E.O., Zhuzhzhalova T.P. Vozmozhnost' sozdaniya gomozigotnogo materiala saharnoy svekly v kul'ture in vitro // Nauka i obrazovanie: otechestvennyy i zarubezhnyy opyt: sb. tr. Semnadcatoy mezhdunar. nauch.-prakt. konf. Belgorod, 2019. S. 259–262.
9. Mohan J. Tissue culture-derived variation in crop improvement // Euphytica. 2001. 118. P. 153–166.
