The aim of research is to study the polymorphic systems of milk and blood proteins of subpopulations of the Yakut cattle breed in order to create a more complete picture of the genetic situation in the population, covering four loci. Research objectives are determination of the frequency of occurrence of alleles and genotypes at the loci of beta and kappa casein, whey proteins - beta-lactoglobulin and alpha-lactalbumin. The study was carried out by the method of vertical electrophoresis on polyacrylamide gel, using the method of salt extraction of DNA and polymerase chain reaction (PCR). Three alleles A, B and C were identified at the -Cn locus. It should be noted that alleles A and B are also often found in Yakut cattle. Thus, 71 % of this livestock was homozygous for allele A, i.e., had -Cn AA genotype. The frequency of occurrence of heterozygous individuals was 29 %, of which individuals with a combination of B and C alleles were most common. No alleles B and C were found in the homozygous state and animals with the -Cn AC genotype, i.e., a heterozygous AC combination. The degree of realization of possible genetic variability for this locus was 43.7 %, which is a satisfactory indicator. There is also a shortage of heterozygous individuals. From the presented data on the study of milk protein polymorphism (-Cn, k -Cn, -Lg, -La) and the results of PCR analysis of blood samples at the k-Cn locus, the S1-Cn locus turned out to be monomorphic. A gene imbalance is noted at the -Cn and k-Cn loci. In the -La and -Lg, the gene balance is not disturbed, but a very low level of realization of possible variability is noted. In our opinion, the disturbance of the gene balance at the loci is a consequence of the random drift of genes due to the small number and isolation of the livestock.
DNA technologies, electrophoresis, locus, allele, polymorphism, proteins, casein.
Введение. В проблеме сохранения малочисленных аборигенных пород сельскохозяйственных животных кроме их численного сохранения важную роль играет поддержание их генетического разнообразия, формирования оптимальной генетической структуры популяции для дальнейшего совершенствования его генофонда. Существующие на сегодняшний день методы ДНК-технологий позволяют наметить пути и разработать способы точной идентификации генотипов животных и на их основе вести селекцию сельскохозяйственных животных в популяциях по хозяйственно ценным признакам. Якутская порода скота относится к молочно-мясным породам скота и является малочисленным аборигенным видом в Республике Саха (Якутия) в северо-восточной части Сибири в России. Данный вид отличается исключительно высокой морозоустойчивостью и выносливостью к недостаточному питанию. Молоко якутских коров отличается высоким содержанием жиров. Эти особенности якутского скота делают его незаменимым генетическим ресурсом в сельском хозяйстве субарктических регионов.
В настоящее время в научных публикациях многих отечественных ученых имеются данные исследований по изучению полиморфизма белков крови и молока, установлению связи генотипов с признаками молочной продуктивности коров разных пород крупного рогатого скота и технологическими свойствами молока [1–11]. Из белков молока наибольший интерес представляла казеиновая фракция. С использованием ДНК-технологий по локусу каппа-казеина исследованы 24 популяции 11 пород крупного рогатого скота. Частоты аллелей и генотипов по локусу каппа-казеина варьируют как между породами, так и внутри породы. Они могут существенно различаться в разных стадах одной породы и даже в разных группах внутри одного стада [12, 13]. Полиморфизм гена каппа-казеина якутской породы скота впервые отмечается в исследованиях Г.Е. Сулимовой с соавторами (1996), имеются сведения в работах и других авторов (табл. 1).
Таблица 1
Частоты аллелей гена каппа-казеина у якутской породы скота
|
№ п/п |
n |
Частота аллелей |
Литературный источник |
|||||
|
A |
B |
E |
F |
C |
G |
|||
|
1 |
33 |
80,00 |
13,30 |
0,00 |
6,70 |
0,00 |
0,00 |
[1] |
|
2 |
32 |
56,06 |
43,94 |
0,00 |
0,00 |
0,00 |
0,00 |
[3] |
|
3 |
69 |
74,64 |
25,36 |
0,00 |
0,00 |
0,00 |
0,00 |
[13] |
По данным Е.А. Гладырь (2001), из исследованных групп животных популяция якутского скота оказалась наиболее гомогенной, и в ней были выявлены только два аллеля гена каппа-казеина – А и В. Частота встречаемости гетерозиготного генотипа АВ – 69,7 % [3]. При исследовании различных пород крупного рогатого скота по содержанию В-аллеля каппа-казеина достоверно различались стада бестужевской породы, якутского скота и черно-пестрой породы. Так, частота В-аллеля якутского скота – 25,36±3,70 [13].
Цель исследования: изучение полиморфизма белков молока и крови у якутской породы скота для создания более полной картины генетической ситуации в популяции с охватом четырех локусов.
Задачи исследования: определение частоты встречаемости аллелей и генотипов гена каппа-казеина (k-Cn), бета-казеина (b-Cn),
b-лактоглобулина (b-Lg ) и a-лактоальбумина (a-La).
Результаты исследования. Белки молока образованы из двух основных групп – казеина и сывороточных белков. Из казеиновых фракций нами исследованы as1-Cn, b-Cn и k-Cn. В таблице 2 приведены результаты анализа белков молока 14 якутских коров. Результаты наших исследований показали, что локус as1-Cn (CSN1S1) у якутского скота оказался мономорфным, поскольку обнаружен только один В-тип. В локусе b-Cn выявлены три аллеля: А, В и С. Аллели В и С в гомозиготном состоянии не обнаружены. Также не обнаружены животные с генотипом АС. Степень реализации возможной генетической изменчивости составила 43,7 %. Генный баланс нарушен, так как c2 = 20,03,
Р < 0,001.
Наиболее ценный с технологической точки зрения локус k-Cn у якутского скота имеет полиморфное состояние. В данном стаде было обнаружено только два аллеля – А и В. Частота встречаемости А-аллеля составила 0,79. По данному локусу также испытывается недостаток гетерозиготных особей и степень реализации возможной генетической изменчивости также невысок. Генный баланс нарушен, c2 = 4,64,
Р < 0,05.
Сывороточные белки молока являются ценными компонентами молока, так, b-лакто-глобулин необходим для роста и развития молодняка [15], и в настоящее время выявлено 13 аллельных вариантов гена BLG, который отвечает за синтез данного белка [16]. По данным Л.К. Эрнста, Н.А. Зиновьевой (2008), Я.А. Хабибрахмановой (2009), ген b-лактоглобулина влияет на жирность молока, отвечает за белковомолочность и показатель биологической ценности молока [17, 18].
В данных исследованиях из сывороточных белков молока полиморфными оказались локусы b-Lg и a-La. В локусе b-Lg обнаружены аллели А и С. Наиболее часто (85 %) встречались животные с гомозиготным АА генотипом, который, как показывают литературные данные, коррелирует с повышенным содержанием белка в молоке и, по данным Е.А. Гладырь (2001), среди исследованных пород крупного рогатого скота была наивысшей у якутского скота (18,75 %) [19]. При этом частота встречаемости генотипа ВВ была минимальной в якутской породе (15,62 %) и с преобладающим количеством АВ гетерозигот (65,63 %) [3].
Таблица 2
Популяционно-генетический анализ
полиморфных систем белков молока у якутского скота
|
Локус |
n |
Частота p |
Уровень гомозиготности |
Число эффективных аллелей |
Уровень генетической изменчивости, % |
Тест гетерозиготности |
c2 |
|
|
фактически |
табличный |
|||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
b-Cn |
|
|
0,594388 |
1,682403 |
43,68132 |
-0,2824 |
20,03175 |
16,3 |
|
Генотип: |
|
|
||||||
|
АА |
10 |
0,714286 |
||||||
|
АВ |
1 |
0,071429 |
||||||
|
АС |
0 |
0 |
||||||
|
ВС |
3 |
0,214286 |
||||||
|
ВВ |
0 |
0 |
||||||
|
СС |
0 |
0 |
||||||
|
Аллель: |
|
|
||||||
|
А |
|
0,75 |
||||||
|
В |
|
0,142857 |
||||||
|
С |
|
0,107143 |
||||||
|
k-Cn |
|
|
0,663265 |
1,507692 |
36,26274 |
-0,34103 |
4,640955 |
3,8 |
|
Генотип: |
|
|
||||||
|
АА |
10 |
0,714286 |
||||||
|
АВ |
2 |
0,142857 |
||||||
|
ВВ |
2 |
0,142857 |
||||||
|
Аллель: |
|
|
||||||
|
А |
|
0,785714 |
||||||
|
В |
|
0,214286 |
||||||
|
b-Lg |
|
|
0,867347 |
1,152941 |
14,28571 |
-0,22157 |
0,08284 |
3,8 |
|
Генотип: |
|
|
||||||
|
АА |
12 |
0,857143 |
||||||
|
АС |
2 |
0,142857 |
||||||
|
СС |
0 |
0 |
||||||
|
Аллель: |
|
|
||||||
|
А |
|
0,928571 |
||||||
|
С |
|
0,071429 |
||||||
Окончание табл. 2
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
a-La |
|
|
0,931122 |
1,073973 |
7,417582 |
-0,28472 |
0,019204 |
3,8 |
|
Генотип: |
|
|
||||||
|
АА |
13 |
0,928571 |
||||||
|
АВ |
1 |
0,071429 |
||||||
|
ВВ |
0 |
0 |
||||||
|
Аллель: |
|
|
||||||
|
А |
|
0,964286 |
||||||
|
В |
|
0,035714 |
По нашим данным, частота аллеля С составляла 0,07. Он встречался только в гетерозиготном АС состоянии. Это отразилась в числе эффективных аллелей (1,15) и степени реализации возможной изменчивости (14,3 %).
Локус a-La у якутского скота также является полиморфным. У 7 % животных установлен гетерозиготный a-La АВ генотип. У большинства особей установлен наиболее электрофоретически подвижный А-аллель, а альтернативный В-аллель в гомозиготном состоянии не обнаружен. В этом локусе также отмечается низкий уровень использования диаллельного состояния, а степень реализации возможной изменчивости еще ниже – 7,4 %.
В таблице 3 приведены результаты анализа по k-Cn локусу белков крови у 30 голов якутского скота.
Таблица 3
Популяционно-генетический анализ по k-Cn локусу
белков крови у якутского скота
|
Локус |
n |
Частота p |
Уровень гомозиготности |
Число эффективных аллелей |
Уровень генетической изменчивости, % |
Тест гетерозиготности |
c2 |
|
|
фактически |
табличный |
|||||||
|
k-Cn |
|
|
0,605 |
1,65289 |
40,8621 |
-0,31806 |
10,2537 |
11,3 |
|
Генотип: |
|
|
||||||
|
АА |
19 |
0,633333 |
||||||
|
АВ |
4 |
0,133333 |
||||||
|
АF |
3 |
0,1 |
||||||
|
ВF |
0 |
0 |
||||||
|
FF |
0 |
0 |
||||||
|
BB |
4 |
0,133333 |
||||||
|
S |
30 |
|
||||||
|
Аллель: |
|
|
||||||
|
А |
|
0,75 |
||||||
|
В |
|
0,20 |
||||||
|
F |
|
0,05 |
||||||
В данной популяции были обнаружены три аллеля; А, В и F. Очень часто встречается аллель А. Частота В аллеля составляет 0,20.
Как было сказано выше, у якутского скота встречается весьма редкая k-Cn F-аллель, которая встречается в гетерозиготном состоянии с одним А-аллелем, и его частота составила 0,05. Уровень гомозиготности популяции достаточно высокая, соответственно испытывается недостаток гетерозигот, в частности уменьшается число АВ сочетаний.
Степень реализации возможной изменчивости не высокая. Критерий c2 указывает на то, что генное равновесие нарушено (Р < 0,025).
Выводы. Результаты проведенного анализа свидетельствуют о сохранении генетического разнообразия в отношении гена k-Cn в популяции якутского скота.
В целом по исследованному поголовью скота можно сделать заключение, что нарушен генный баланс по b-казеиновым (c2 = 20,03; Р < 0,001) и k-казеиновым локусам (c2 = 4,64; Р < 0,05). В локусах a-La и b-Lg генное равновесие не нарушено, но отмечается весьма низкий уровень реализации возможной изменчивости – соответственно 7,4 и 14,3 %.
При анализе по k-Cn локусу белков крови также выявлено, что генное равновесие нарушено (c2 = 10,25; Р < 0,025). Встречается редкая k-Cn F-аллель с частотой 0,05.
На наш взгляд, нарушение генного равновесия является следствием случайного дрейфа генов из-за малочисленности и изолированности поголовья. Чтобы не допустить дальнейшего сужения генетического разнообразия у якутского скота, надо увеличить или по крайней мере сохранить нынешнее его поголовье и вести генетический мониторинг.
1. Sulimova G.E., Badagueva Yu.N., Udina I.G. Polimorfizm gena kappa – kazeina v populyaciyah podsemeystva Bovinae // Genetika. 1996. T. 32. S. 1576–1582.
2. Iolchiev B.S., Eremina M.A. Ispol'zovanie polimorfnyh sistem belkov moloka v selekcii // Molochnoe i myasnoe skotovodstvo. 1996. № 2. S. 20–22.
3. Gladyr' E.A. DNK-diagnostika variantov genov kappa-kazeina i beta- laktoglobulina u krupnogo rogatogo skota: avtoref. dis … kand. biol. nauk.: 06.02.01. Dubrovicy, 2001. 21 s.
4. Gladyr' E.A., Kostyunina O.V., Zinov'eva N.A. Diagnostika polimorfizma gena al'fa-laktal'bumina krupnogo rogatogo skota // Sovremennye dostizheniya i problemy biotehnologii sel'skohozyaystvennyh zhivotnyh. Dubrovicy, 2002. S. 109–110.
5. Kalashnikova L.A., Strelkova N.A., Golubina E.P. Polimorfizm gena kappa-kazeina krupnogo rogatogo skota krasno-pestroy porody // Sovremennye dostizheniya i problemy biotehnologii sel'skohozyaystvennyh zhivotnyh. Dubrovicy, 2002. S. 137–138.
6. Tinaev A.Sh. Hozyaystvenno poleznye priznaki produktivnosti pervotelok cherno-pestroy porody s raznymi genotipami po lokusu gena kappa-kazeina: avtoref. dis. … kand. s.-h. nauk: 06.02.07. Lesnye Polyany, 2003. 18 s.
7. Kostyunina O.V. Molekulyarnaya diagnostika geneticheskogo polimorfizma osnovnyh molochnyh belkov i ih svyaz' s tehnologicheskimi svoystvami moloka: dis. … kand. biol. nauk: 03.00.23. Dubrovicy, 2005. 127 s.
8. Kalashnikova L.A. Genomnaya ocenka molochnogo skota // Molochnoe i myasnoe skotovodstvo. 2010. № 1. S.10–12.
9. Ahmetov T.M. Ispol'zovanie metodov marker-vspomogatel'noy selekcii v molochnom skotovodstve Respubliki Tatarstan: dis. … d-ra biol. nauk: 06.02.01. Kazan', 2009. 277 s.
10. Drozdov E.V. Polimorfizm genov, svyazannyh s molochnoy produktivnost'yu krupnogo rogatogo skota: avtoref. dis. … kand. biol. nauk: 03.02.07. SPb.: Pushkin, 2013. 24 s.
11. Pozovnikova M.V., Serdyuk G.N., Pogorel'skiy I.A. i dr. Geneticheskaya struktura korov molochnyh porod po DNK-markeram i vliyanie ih genotipov na molochnuyu produktivnost' // Molochnoe i myasnoe skotovodstvo. 2016. № 2. S. 8–12.
12. Yarlykov N.G., Tamarova R.V. Vliyanie genotipa kappa-kazeina na syroprigodnost' moloka korov yaroslavskoy porody i mihaylovskogo tipa: monografiya. Yaroslavl': Izd-vo Yaroslavskoy GSHA, 2012. 124 s.
13. Sulimova G.E., Ahani-Azari M., Rostamzadeh D. i dr. Allel'nyy polimorfizm gena kappa-kazeina (CSN3) u rossiyskih porod krupnogo rogatogo skota i ego informativnost' kak geneticheskogo markera // Genetika. 2007. T. 43, № 1. S. 88–95.
14. Zinov'eva H.A., Popov A.P., Ernst L.K. i dr. Metodicheskie rekomendacii po ispol'zovaniyu metoda polimeraznoy cepnoy reakcii v zhivotnovodstve. Dubrovicy: Izd-vo VIZh, 1998. 47 s.
15. Tepel A. Himiya i fizika moloka. M.: Pischevaya promyshlennost', 1979. 624 s.
16. Martin P., Bianchi L., Cebo C., Miranda G. Genetic polymorphism of milk proteins: Quantitative variability and molecular diversity. Advanced dairy chemistry. Springer Science+Business, Media. New York, 2013. V. 1A: Proteins: Basic Aspects, 4th ed. P. 387–429. DOI:https://doi.org/10.1007/978-1-4614-4714-6.
17. Ernst L.K., Zinov'eva N.A. Biologicheskie problemy zhivotnovodstva v XXI veke. M.: Izd-vo RASHN, 2008. 508 s.
18. Habibrahmanova Ya.A. Polimorfizm genov molochnyh belkov i gormonov krupnogo rogatogo skota: dis. ... kand. biol. nauk: 06.02.01. Lesnye Polyany: Izd-vo VNIIplem, 2009. 20 s.
19. Ng-Kwai Hang K.F. Genetic variants of milk proteins and cheese yield // IDF Seminar Cheese yield and factors affecting its control. Cork, 1993. P. 160–166.
