Vladikavkaz, Vladikavkaz, Russian Federation
UDK 633.491 Картофель. Solanum tuberosum L.
Cel' issledovaniya – vyyavlenie i izuchenie sortov kartofelya, obladayuschih ustoychivost'yu k osnovnym virusam kartofelya (PVY; PVX), dlya dal'neyshego ispol'zovaniya sortov v programme selekcii i semenovodstva kartofelya. V hode molekulyarnogo skrininga selekcionnyh genotipov kartofelya primenyali DNK-markery: dlya identifikacii gena Ruadg ispol'zovali SCAR marker RYSC3. Prisutstvie gena Rysto opredelyali s pomosch'yu markera STS YES3-3. Detekciyu gena Rychc provodili s primeneniem STS-markera RY186 ustoychivosti k virusu PVX – STS-marker PVX gena Rx1. Praymery dlya PCR i usloviya reakcii byli vybrany iz literaturnyh istochnikov. Dlya provedeniya PCR-analiza ispol'zovalas' priborno-apparatnaya liniya. PCR-ampli¬fikacii provodili v obschem ob'eme 25 mkl, soderzhaschem 10H bufer dlya Taq DNK-polimerazy (Sintol), 2,5 mM smes' dNTP (Helikon), 2,5 mM vodnyy rastvor hlorida magniya (Fermentas), 5–10 pkmol' kazhdogo praymera (Sintol), 0,2 e.a. Taq DNK-polimerazy (Sintol), 20 ng proby DNK i 13–15 mkl avtoklavirovannoy bidistillirovannoy vody. Vse produkty PCR razdelyali elektroforezom na 1,5 % agaroznom gele v 1 × TAE-bufere i vizualizirovali s pomosch'yu ul'trafioletovogo izlucheniya (UF). V kachestve markerov molekulyarnogo vesa ispol'zuetsya DNA GeneRuler, Thermo FS. Predvaritel'no selekcionnyy material byl ocenen v laboratorno-polevyh usloviyah v sootvetstvii s rekomendaciyami po selekcionnomu processu dlya kartofelya. Total'nuyu DNK vydelyali iz list'ev polevyh rasteniy kartofelya, sobrannyh v period vegetacii, s ispol'zovaniem CTAB-metoda. Dlya analiza ispol'zovali DNK, vydelennye iz lis¬t'ev polevyh rasteniy kartofelya, s ispol'zovaniem protokola, osnovannogo na metode CTAB. V rezul'tate provedennyh analizov na gen-ustoychivost' kartofelya vydeleny sorta s R-genami virusoustoychivosti kartofelya: s genom Rysto sceplennogo s markerom YES3-3A s ozhidaemym razmerom fragmenta 341 p.n. (otmecheno u 4 obrazcov kartofelya Darenka, Farn, Rokko). Gen Rx1, kontroliruyuschiy ustoychivost' k virusu (PVX), vyyavlen u 2 obrazcov kartofelya.
potato, DNA, RNA, virus, resistance, gene, variety, breeding
Введение. Картофель (Solanum tuberosum) является одной из наиболее важных сельскохозяйственных культур в мире, ежегодно производящей свыше 350 миллионов тонн. Его успех объясняется прежде всего его способностью адаптироваться к различным климатическим условиям, обеспечивающей высокий уровень урожайности и питательную ценность [1, 2]. Однако из-за широкого распространения выращивания картофеля риск заболевания растений является значительным и имеет серьезные последствия.
Многие вредители и патогены наносят большой экономический ущерб при выращивании картофеля. Согласно исследованиям, потенциальные потери от насекомых-вредителей, патогенов и вирусов составляют 44,9 %. Считается, что вирусы поражают урожай картофеля больше, чем любые другие патогены во всем мире. Существуют приблизительно 30 различных видов вирусов, которые могут поражать культурные растения. Значительные потери производства картофеля во всем мире вызывают вирус Y картофеля (PVY; род Potyvirus), вирус скручивания листьев картофеля (PLRV; род Polerovirus ) и вирус картофеля X (PVX; род Potexvirus) [3–5].
Имеющиеся данные свидетельствуют, что вирус PVY может вызвать потери урожая картофеля в размере от 10 до 80 %, в зависимости от штамма вируса и наличия сопутствующих инфекций с другими вирусами. Сертификация семян позволяет сократить уровень инфекции в полевых условиях и обнаружить вирусы, поражающие картофель. Однако, несмотря на все усилия, PVY все чаще встречается на полях, и несколько его штаммов уже были выявлены. Особое значение имеет тот штамм PVY, который представляет симптомы, такие как некроз листьев и стеблей и опадение листьев [4].
Вирус Х (PVX) картофеля вызывает легкую мозаичную болезнь картофеля и других растений, преимущественно пасленовых. PVX – один из наиболее широко распространенных вирусов. PVX обычно передается через пыльцу или клубни, легко передается механическим путем в результате деятельности человека или от растения к растению при контакте между здоровой и зараженной листвой или корнями. Известно, что (PVX) вызывает тяжелое заболевание, когда он возникает при смешанных инфекциях с другими вирусами, особенно с потивирусами, такими как картофельный вирус Y (PVY) и картофельный вирус S (PVS) [5, 6].
С учетом требований промышленности к скорости, надежности и экономичности анализа традиционные методы не всегда эффективны. В связи с этим появилась потребность в использовании альтернативных методов диагностики. Один из таких методов – анализ ПЦР, который широко используется в различных областях, включая выявление патогенов растений. ПЦР – анализ на ген-устойчивость к фитопатогенам, является более чувствительным, чем традиционные методы. Тесты на обнаружение, основанные на ПЦР, обладают достаточно высокой скоростью и позволяют получить результаты за несколько часов [7].
Применение метода МОС (Marker Assisted Selection) с использованием ДНК-маркеров позволяет облегчить селекцию сельскохозяйственных растений с кoмплексной устойчивостью к болезням и вредителям. Этот метод широко используется для ускорения отбора устойчивых сортов с хорошими агрономическими характеристиками. В картофеле было выявлено наличие генетического комплекта, определяющего разные формы устойчивости к Y-вирусу. Присутствие RY-генов обеспечивает устойчивость картофеля, что говорит о том, что, вирус не способен размножаться в растении, независимо от его вида. Эти идентифицированные гены, связанные с устойчивостью картофеля к вирусам, могут быть использованы в селекции для создания сортов картофеля, устойчивых к вирусу или комплексу вирусов. Тем не менее ученые должны приложить дополнительные усилия либо для применения генов устойчивости, либо для открытия новых генов устойчивости у картофеля [8, 9]. Поэтому создание устойчивых к вирусам сортов картофеля с применением ДНК-маркеров становится все более актуальной задачей [10, 11].
Цель исследования – выявление и изучение сортов картофеля, обладающих устойчивостью к основным вирусам картофеля (PVY; PVX), для дальнейшего использования сортов в программе селекции и семеноводства картофеля.
Задача: использование специальных ДНК-маркеров для определения генов, ответственных за устойчивость к вирусам PVY, PVХ, в сортах картофеля. Это позволит провести молекулярное скринирование данных сортов с целью дальнейшего использования в маркер-опосредованной селекции.
Материалы и методы. Материалом для исследования служили сорта картофеля из коллекционного питомника, выделившиеся по фенотипической оценке. Для анализа использовали ДНК, выделенные из листьев полевых растений картофеля, с использованием протокола, основанного на методе CTAB. В ходе молекулярного скрининга селекционных генотипов картофеля применяли ДНК-маркеры: для идентификации гена Rуadg использовали SCAR маркер RYSC3. Присутствие гена Rysto определяли с помощью маркера STS YES3-3. Детекцию гена Rychc проводили с применением STS-маркера RY186 устойчивости к вирусу PVX – STS-маркер PVX гена Rx1. Праймеры для ПЦР и условия реакции были выбраны из литературных источников и представлены в таблице 1 [12–14].
ПЦР-амплификации проводили в общем объеме 25 мкл, содержащем 10Х буфер для Taq ДНК-полимеразы (Синтол), 2,5 мМ смесь dNTP (Хеликон), 2,5 мМ водный раствор хлорида магния (Fermentas), 5–10 пкмоль каждого праймера (Синтол), 0,2 е.а. Taq ДНК-полимеразы (Синтол), 20 нг пробы ДНК и 13–15 мкл автоклавированной бидистиллированной воды.
Все продукты ПЦР разделяли электрофорезом на 1,5 % агарoзном геле в 1 × TAE-буфере и визуализировали с помощью ультрафиолетового излучения (УФ). В качестве маркеров молекулярного веса используется DNA GeneRuler, Thermo FS.
Таблица 1
ДНК-маркеры, используемые для оценки генотипов картофеля
|
Ген |
Маркер |
Размер фрагмента, п.н. |
Нуклеотидные последовательности праймеров (5`→ 3`) |
Tемпература отжига праймеров, ºС |
Литературный источник |
|
ДНК-маркеры устойчивости к вирусу Y |
|||||
|
Ryadg |
RYSC3 |
321 |
F: ATACACTCATCTAAATTTGATGG R: AGGATATACGGCATCATTTTTCCGA |
60 |
[12] |
|
Rychc |
Ry186 |
587 |
F – TGGTAGGGATATTTTCCTTAGA R –GCAAATCCTAGGTTATCAACTCA |
55 |
[14] |
|
Rysto |
YES3-3A |
341 |
F – TAACTCAAGCGGAATAACCC R – AATTCACCTGTTTACATGCTTCTTGTG |
55 |
[13] |
|
ДНК-маркер устойчивости к вирусу X |
|||||
|
Rx1 |
PVX |
1230 |
F: ATCTTGGTTTGAATACATGG R: CACAATATTGGAAGGATTCA |
58 |
[14] |
Результаты и их обсуждение. Неотъемлемой необходимостью при выведении новых сортов является комплексная устойчивость к PVY-вирусу [15]. В данном исследовании рассмотрены три широко используемых маркера устойчивости: к вирусу (PVY) – YES3-3A / ген Rysto, RYSC /ген Ryadg, Ry186/ ген Rychc. Из 30 анализируемых образцов картофеля было обнаружено наличие гена Rysto, который связан с маркером YES3-3A. Ожидаемый размер фрагмента составляет 341 нуклеотид. Интересно отметить, что этот ген был обнаружен в 4 образцах картофеля – Даренка, Метеор, Фарн, Рокко. SCAR маркер RYSC3 гена Ryadg обнаружен у сортов Даренка и Садон. Ген устойчивости Ryсhc к
Y-вирусу картофеля, сцепленный с маркером Ry186, не был обнаружен в изучаемой выборке (табл. 2).
Таблица 2
Результаты исследования образцов выделившихся
сортов картофеля с помощью ДНК-маркеров
|
№ п/п |
Сорт |
Наличие ДНК-маркеров/ген |
№ п/п |
Сорт |
Наличие ДНК-маркеров/ген |
||||||
|
YES3-3A/ген Rysto |
RYSC3/ ген Ryadg |
Ry186/ Rychc |
PVX/ ген Rx1 |
YES3-3A/ген Rysto |
RYSC3/ ген Ryadg |
Ry186/ Rychc |
PVX/ ген Rx1 |
||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
1 |
Сорокинский |
– |
– |
– |
– |
16 |
Innovator |
– |
– |
– |
– |
|
2 |
Фламинго |
– |
– |
– |
– |
17 |
Владикавказкий |
– |
– |
– |
– |
|
3 |
Даренка |
+ |
+ |
– |
– |
18 |
Синеглазка |
– |
– |
– |
– |
|
4 |
Невский |
– |
– |
– |
– |
19 |
Жуковский ранний |
– |
– |
– |
– |
|
5 |
Самба |
– |
– |
– |
+ |
20 |
Краса |
– |
– |
– |
– |
|
6 |
Ривьера |
– |
– |
– |
– |
21 |
Фарн |
+ |
– |
– |
– |
|
7 |
Бизон |
– |
– |
– |
– |
22 |
Гулливер |
– |
– |
– |
– |
|
8 |
Взрывной |
– |
– |
– |
– |
23 |
Конкурент |
– |
– |
– |
– |
|
9 |
Изюминка |
– |
– |
– |
– |
24 |
Ред Леди |
– |
– |
– |
– |
|
10 |
Триумф |
– |
– |
– |
– |
25 |
Кармен |
– |
– |
– |
– |
Окончание табл. 2
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
11 |
Садон |
– |
+ |
– |
– |
26 |
Рябинушка |
– |
– |
– |
– |
|
12 |
Метеор |
+ |
– |
– |
+ |
27 |
Рокко |
+ |
– |
– |
– |
|
13 |
Краса Мещеры |
– |
– |
– |
– |
28 |
Алена |
– |
– |
– |
– |
|
14 |
Удача |
– |
– |
– |
– |
29 |
Romano |
– |
– |
– |
– |
|
15 |
Вымпел |
– |
– |
– |
+ |
30 |
Крепыш |
– |
– |
– |
– |
Примечание: «+» – маркер присутствует, «–» – маркер не выявлен.
Одной из значимых проблем в сельском хозяйстве является наличие вируса картофеля Х (PVX), обуславливающего возникновение слабой мозаики. Устойчивость к данному вирусу обладает доминантным геном Rх1, который нашел свое происхождение в редкой сортности, известной как Solanum Andigenum Juz. Et Buk., официальное название – CPC 1673-20. Место нахождения гена Rх1 было определено на 12-й хромосоме. Базируясь на данных о последовательности нуклеотидов гена Rx, был разработан STS-маркер PVX (1230 п.н.), который находится в сцеплении с геном Rх1. Ген Rx1 идентифицирован после амплификации у сортов картофеля Самба и Вымпел.
Заключение. Картофель занимает третье место в мировом продовольственном производстве, что подчеркивает его важность для обеспечения пищевой безопасности и поддержания экономического благополучия. Этот корнеплод имеет высокие пищевые свойства и является неотъемлемой частью рациона здорового питания. С помощью ПЦР-анализа на ген-устойчивость селекционер может сократить срок выведения новых сортов картофеля с комплексом ценных генов. Из коллекционного питомника были отобраны особые генотипы картофеля, обладающие уникальным комплексом генов устойчивости к патогенам для дальнейшей селекции выведения новых вирусоустойчивых сортов картофеля.
1. Aktual'nye napravleniya razvitiya selekcii i semenovodstva kartofelya v Rossii / E.A. Sima¬kov [i dr.] // Kartofel' i ovoschi. 2020. № 12. S. 22–26.
2. Ustojchivost' kartofelya k karantinnym bolez-nyam / A.V. Hyutti [i dr.] // Vavilovskij zhurnal genetiki i selekcii. 2017. T. 21(1). S. 51–61. DOI:https://doi.org/10.18699/VJ17.223.
3. Ustojchivost' kartofelya k virusam: sovremen-noe sostoyanie i perspektivy / S.S. Makarova [i dr.] // Vavilovskij zhurnal genetiki i selekcii. 2017. T. 21(1). S. 62–73. DOI:https://doi.org/10.18699/VJ1 7.224.
4. Ermishin A.P. Osobennosti ispol'zovaniya DNK-markerov v selekcii kartofelya // Kartofele¬vodstvo: sb. nauch. tr. 2013. T. 21. S. 169–183.
5. Molekulyarnyj skrining sortov i gibridov karto-felya severo-zapadnoj zony Rossijskoj Federa-cii / T.A. Gavrilenko [i dr.] // Vavilovskij zhurnal genetiki i selekcii. 2018. T. 22 (1). S. 35-45. DOI: 10.18699/ VJ18.329.
6. Rogozina E. Identifikaciya roditel'skih form dlya selekcii kartofelya, ustojchivogo k boleznyam i vreditelyam metodom mul'tipleksnogo PCR-analiza // Sel'skohozyajstvennaya biologiya. 2019. T. 54 (1). S. 19–30.
7. Mezhvidovye gibridy kartofelya, ustojchivye k vozbuditelyam boleznej / E. Rogozina [i dr.] // Katalog mirovoj kollekcii VIR. SPb., 2018. Vyp. 866. C. 26–31.
8. Hlestkina E.K., Shumnyj V.K., Kolchanov N.A. Marker orientirovannaya selekciya i primery ee ispol'zovaniya v mirovom kartofelevodstve // Dostizheniya nauki i tehniki APK. 2016. T. 30 (10). S. 5–8.
9. Álvarez D., Gutiérrez P., Marín M. Secuencia-ción del genoma del Potato yellow vein virus (PYVV) y desarrollo de una prueba molecular para su detección // Bioagro. 2017. Vol. 29 (1). P. 3–14.
10. Issledovanie kollekcionnyh obrazcov kartofelya na nalichie geneticheskih markerov ustojchi¬vosti k fitopatogenam / A.B. Sajnakova [i dr.] // Vavilovskij zhurnal genetiki i selekcii. 2018. T. 22 (1). S. 18–24. DOI:https://doi.org/10.18699/VJ18.326.
11. Molekulyarnyj skrining sortov kartofelya Falen-skoj selekcionnoj stancii na ustojchivost' k fito¬patogenam / A.V. Bakulina [i dr.] // Agrarnaya nauka Evro-Severo-Vostoka. 2021. T. 22 (3). S. 340–350. DOI:https://doi.org/10.30766/2072-9081.2021. 22.3.340-350.
12. Development of SCAR markers to the PVY resistance gene Ryadg based on a common feature of plant disease resistance genes / K. Kasai [et al.] // Genome. 2000;43:1-8.
13. Mapping of extreme resistance to PVY (Rysto) on chromosome XII using anther-culture-deri-ved primary dihaploid potato lines / Y.S. Song [et al.] // Theor. Appl. Genet. 2005;111:879-887.
14. Development of a multiplex PCR method for simultaneous detection of diagnostic DNA markers of five disease and pest resistance genes in potato/ K. Mori [et al.] // Euphytica. 2011;180:347-355.
15. Characterization of resistance to Globodera rostochiensis pathotype Ro1 in cultivated and wild potato species accessions from the Vavilov Institute of Plant Industry / L. Liman-tseva [et al.] // Plant Breeding. 2014;133(5):660-665. DOI:https://doi.org/10.1111/pbr.12195.
