Saratov, Russian Federation
The aim of the study is to obtain hyperimmune blood sera of guinea pig and rabbit using an antigen isolated from Yersinia pseudotuberculosis cells using dimethyl sulfoxide, as well as to study the possibility of complex use of the obtained specific antibodies in indirect enzyme immunoassay (ELISA) for the detection of Yersinia. To obtain hyperimmune sera, a mixture of antigen and adjuvant was used in a ratio of 1:1. Proteins predominated in the composition of the antigen. It was administered to animals in the amount of 0.6 mg per guinea pig and 2 mg per rabbit. 1 % polyazolidinammonium modified with iodine hydrate ions was used as an adjuvant. Animals were immunized subcutaneously five times with an interval of 2 weeks. The resulting sera showed generic specificity in ELISA against Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis (1:6400–1:25600). Their interaction with Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes, Brucella abortus was insignificant (1:100–1:400). The complex use of specific hyperimmune blood sera from two animal species made it possible to conduct indirect ELISA for antigen detection. To do this, we adsorbed guinea pig antibodies on the surface of microplate wells. Then, with the help of rabbit serum, an indication of the antigen attached to the guinea pig antibodies adsorbed on the microplate was carried out. Rabbit antibodies were detected with a peroxidase antispecies conjugate. The complex use of experimental sera made it possible to detect enteropathogenic Yersinia in the accumulation medium even under conditions of significant fecal contamination of the test material already on the 3rd day of “cold enrichment”, provided that at least 50 Yersinia cells were added to 1 ml of the accumulation medium.
Yersinia pseudotuberculosis, hyperimmune serum, antigen, dimethyl sulfoxide, enzyme immunoassay
Введение. Энтеропатогенные иерсинии (Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis) повсеместно вызывают расстройства функции желудочно-кишечного тракта у молодняка сельскохозяйственных животных. Эти расстройства известны как кишечный иерсиниоз и псевдотуберкулез.
Основным методом диагностики иерсиниозов является бактериологический, в котором ключевое значение имеет «холодовое обогащение» возбудителя на бедных питательных средах накопления [1].
Эффективность бактериологической диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза можно повысить предварительной индикацией иерсиний в средах накопления при помощи иммуноферментной тест-системы. Обязательной составной частью тест-системы являются гипериммунные сыворотки, содержащие специфические антитела. Для непрямого варианта ИФА необходимо наличие иерсиниозных сывороток, полученных от двух видов лабораторных животных [2]. Нами ранее была получена иерсиниозная гипериммунная сыворотка от кроликов [3]. В настоящей работе предпринята попытка использования морских свинок для получения антител.
Для иммунизации животных нами использовался антиген (ДА), полученный в результате обработки клеток Y. pseudotuberculosis диметилсульфоксидом. Основной химический состав ДА представлен белками [4].
Получение иммунных сывороток с высоким титром антител возможно только при использовании адъювантов, усиливающих действие антигена. Синтетические полиэлектролиты являются перспективной группой адъювантных препаратов [5]. Представителем данной группы химических соединений является полиазолидинаммоний, модифицированный гидрат-ионами йода (ПААГ).
Возможности совместного применения ПААГ и ДА Y. pseudotuberculosis для получения гипериммунных сывороток крови впервые изучались нами при иммунизации кроликов [3]. Данный эксперимент показал перспективность таких гипериммунизаций, что определило использование комплекса ПААГ + ДА Y. pseudotuberculosis при иммунизации морских свинок.
Цель исследования – получение гипериммунной сыворотки крови морской свинки путем иммунизации животного ДА Y. Pseudotuberculosis в комплексе с ПААГ, а также изучение возможности комплексного использования полученных антител с аналогичными кроличьими антителами в непрямом ИФА.
Задачи: получение гипериммунной сыворотки крови морской свинки в результате иммунизации животного ДА Y. pseudotuberculosis и ПААГ в качестве адъюванта; изучение специфичности полученной гипериммунной сыворотки крови морской свинки; совместное использование полученных антител с аналогичными кроличьими антителами в непрямом ИФА для индикации иерсиний в среде накопления с фекалиями свиней.
Объекты и методы. ДА получали из микробной культуры Y. pseudotuberculosis III О:3 серовариантa. Специфичность гипериммунных сывороток крови морских свинок определяли при помощи формалинизированных клеток Y. Pseudotuberculosis О:1, О:3, О:4, О:5 серовариантов, Y. enterocolitica О:3, О:9 серовариантов и других видов бактерий кишечной группы, а также единого бруцеллезного антигена производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов». Все использованные в работе штаммы бактерий были получены из музейной коллекции патогенных микроорганизмов ФКУН РосНИПЧИ «Микроб».
Методика получения ДА Y. Pseudotuberculosis заключалась в обработке сухой ацетоновой микробной массы бактерий диметилсульфоксидом. «Ацетоновый порошок» заливали диметилсульфоксидом в соотношении 1:6, инкубировали на шейкере при 37 °С 40 мин, осаждали центрифугированием при 5 тыс. об/мин и удаляли осадок. Надосадочную жидкость, содержащую ДА, диализировали против 0,01 М карбонатно-бикарбонатного буферного раствора (КББ) для освобождения от диметилсульфоксида. Диализ проводили 10 ч при комнатной температуре, с перемешиванием и сменой КББ. Полученный ДА лиофильно высушивали [4].
Иммунизацию морских свинок массой 400–500 г проводили подкожно четырехкратно вдоль спины в 3–4 точки в объеме 1 мл смеси ДА и ПААГ. Соотношение адъюванта к раствору антигена составляло 1:1. ПААГ использовали в 1 %-й концентрации. ДА вводили из расчета 0,6 мг препарата на животное. Иммунизирующая доза для морской свинки была рассчитана из дозы, использованной нами ранее для иммунизации кролика, с учетом коэффициента межвидового переноса доз [6]. Было проведено 5 иммунизаций с интервалом в 2 недели. Кровь для получения сыворотки брали из сердца в процессе тотального обескровливания животного через 14 сут после последней иммунизации.
Гипериммунная сыворотка крови кролика была получена нами ранее аналогичным способом при введении 2 мг ДА на животное [3].
Полученные гипериммунные сыворотки крови морских свинок исследовали методом твердофазного непрямого ИФА [7].
10 %-ю взвесь свиных фекалий, отобранных в момент дефекации, обсеменяли суточными агаровыми культурами Y. enterocolitica или Y. pseudotuberculosis, а затем вносили в среду накопления (фосфатно-солевой буфер (ФСБ) pH = 7,6–7,8) таким образом, чтобы концентрации иерсиний в средах накопления составляли 5·105; 5·103; 50; 5 клеток/мл. Среды накопления с посевами инкубировали при 4 °С в течение 6 сут. Исследование сред в ИФА проводили на 3-и и 6-е сут «холодового обогащения» посевов. Для индикации иерсиний часть содержимого пробирки после перемешивания среды вносили в лунку планшета и обрабатывали 1 %-м формалином в течение 4 ч.
Результаты и их обсуждение. Результаты оценки специфичности гипериммунных сывороток представлены в таблице 1. Полученная гипериммунная сыворотка морской свинки показала родовую иерсиниозную специфичность в ИФА с цельными клетками бактерий. Взаимодействие с бактериями из других родов кишечной микрофлоры и бруцеллами было незначительным. Гипериммунная сыворотка крови морской свинки проявила несколько меньшую антительную активность и сходную специфичность при сравнении с аналогичной кроличьей сывороткой (табл. 1).
Таблица 1
Результат определения специфичности полученных гипериммунных сывороток крови
|
Бактериальные клетки в разведении 109 на 1 мл |
Титры антител полученных сывороток в ИФА с клетками бактерий |
|
|
Сыворотка морской свинки |
Сыворотка кролика |
|
|
Yersinia pseudotuberculosis О:1 |
1:12800 |
1:25600 |
|
Yersinia pseudotuberculosis О:3 |
1:12800 |
1:25600 |
|
Yersinia pseudotuberculosis О:4 |
1:6400 |
1:12800 |
|
Yersinia pseudotuberculosis О:5 |
1:12800 |
1:12800 |
|
Yersinia enterocolitica О:3 |
1:12800 |
1:25600 |
|
Yersinia enterocolitica О:9 |
1:6400 |
1:12800 |
|
Escherichia coli |
1:200 |
1:400 |
|
Salmonella typhimurium |
1:100 |
1:100 |
|
Proteus vulgaris |
1:100 |
1:200 |
|
Enterobacter aerogenes |
1:200 |
1:200 |
|
Brucella abortus |
1:100 |
1:200 |
Для определения антигенов в исследуемом материале могут быть использованы прямой и непрямой варианты ИФА. Для проведения прямого ИФА диагностическую сыворотку необходимо конъюгировать с ферментом, что может привести к снижению чувствительности и специфичности создаваемой тест-системы. В непрямом варианте ИФА конъюгировать специфическую сыворотку не надо, поэтому непрямой вариант ИФА был признан более перспективным. Для его осуществления мы имели две специфические гипериммунные сыворотки: морской свинки и кролика. Антитела морской свинки было решено использовать для адсорбции на поверхности лунок планшета в разведении 1:200, а с помощью кроличьих антител мы осуществляли индикацию антигена в исследуемом материале, также используя разведения 1:200. Последовательность этапов проведения непрямого ИФА приведена на рисунке.
Исследуемым материалом для индикации являлась среда накопления – ФСБ, предварительно обсемененная энтеропатогенными иерсиниями и фекалиями свиней, а также подвергнутая «холодовому обогащению». Проведенная подготовка исследуемого материала позволила максимально приблизить процесс индикации к реальной ситуации, при которой наблюдается присутствие значительного количества посторонней микрофлоры и накопление корпускулярных и растворимых иерсиниозных антигенов. Результаты исследования указывают на возможность индикации энтеропатогенных иерсиний при помощи экспериментальных сывороток на 3-й день «холодового обогащения» при условии внесении в 1 мл среды накопления не менее 50 иерсиниозных клеток, а при инокуляции 5 клеток – на 6-й день (табл. 2).
Схема проведения непрямого варианта ИФА для индикации
энтеропатогенных иерсиний в средах накопления
Таблица 2
Диагностические возможности совместного использования
экспериментальных сывороток
|
Кол-во бактерий, внесенных в среды накопления |
Время обогащения, сут |
|||
|
3 |
6 |
|||
|
Разведения среды, показавшие положительный результат с экспериментальными сыворотками |
||||
|
Y. pseudotuberculosis |
5·105 |
1:8 |
1:32 |
|
|
5·103 |
1:4 |
1:16 |
||
|
50 |
1:2 |
1:8 |
||
|
5 |
– |
1:4 |
||
|
Y. enteroсolitica |
5·105 |
1:4 |
1:16 |
|
|
5·103 |
1:2 |
1:8 |
||
|
50 |
Цельная |
1:4 |
||
|
5 |
– |
Цельная |
||
|
Контроль |
без фекалий |
с Y. pseudotuberculosis |
1:4 |
1:16 |
|
с Y. enteroсolitica |
1:4 |
1:16 |
||
|
с фекалиями |
Без иерсиний |
– |
– |
|
Заключение
1. Иммунизация морских свинок ДА Y. Pseudotuberculosis в комплексе с ПААГ позволила получить гипериммунную сыворотку крови с родовой специфичностью.
2. Комплексное использование двух экспериментальных сывороток позволило выявлять в непрямом ИФА энтеропатогенных иерсиний на 3–6-е сут «холодового обогащения» в условиях значительного фекального загрязнения исследуемого материала.
1. Zykin L.F., Scherbakov A.A., Hapcev Z.Yu. Iersinioz i psevdotuberkulez sel'skohozyaystvennyh zhivotnyh. Saratov, 2002. 67 s.
2. Teoriya i praktika immunofermentnogo analiza / A.M. Egorov [i dr.]. M.: Vyssh. shk., 1991. 288 s.
3. Manieson V.E., Ivaschenko S.V. The use of polyazolidineammonium and dimethyl-sulfoxide antigen Yersinia pseudotuberculosis to obtain hyperimmune serum // E3S Web of Conf. 2020. 175. 03011. DOI:https://doi.org/10.1051/e3sconf/20201750 3011.
4. Svoystva dimetilsul'foksid-frakcii Yersinia enterocolitica / A. Hadzhu [i dr.] // Nauchnaya zhizn'. 2014. № 6. S. 149–155.
5. Petrov R.V., Haitov R.M. Immunogeny i vakciny novogo pokoleniya. M.: GEOTAR-Media, 2011. 608 s.
6. Vybor dozy preparata dlya doklinicheskogo issledovaniya: mezhvidovoy perenos doz / E.V. Shekunova [i dr.] // Vedomosti Nauchnogo centra ekspertizy sredstv medicinskogo primeneniya. 2020. № 1 (10). S. 19–28.
7. Hornbeck P., Winston S.E., Fuller S.A. Enzyme-linked immunosorbent assays // Current Protocols in Molecular Biology. 2001. № 15. P. 15.
