The aim of the work was to optimize cultivation techniques at the stage of actual micropropagation of Clematis L varieties. N.V. The studies were carried out in 2021–2022 in the laboratory of plant biotechnology of N.V. Tsitsin Main Botanical Garden of the Russian Academy of Sciences (GBS RAS). Varieties of various garden groups of clematis were chosen as objects: Princess Diana, Madame Julia Correvon, Yubilejnyj 70, Multi Blue. In the course of the study, the influence of genetic characteristics and the composition of the nutrient medium on the regeneration potential of Clematis L. was shown. It was established that on the nutrient medium DKW (Driver and Kuniyuki, 1984) with the addition of 0.1 mg/l BA (6-benzylaminopurine), Clematis L. regenerants were characterized by active growth of microshoots and the highest height. It was 5.0 ± 0.2 cm for Princess Diana, 6.3 ± 0.1 cm for Madame Julia Correvon, 2.1 ± 0.1 cm for Yubilejnyj 70, and 2.8 ± 0.1 cm for Multi Blue. The maximum multiplication factor was noted for the Princess Diana variety (3.7 ± 0.1), the minimum for the Multi Blue variety (2.4 ± 0.1). When studying the effect of growth regulators and their concentrations during cultivation on DKW medium, it was shown that 2-iP (2-isopentyladenine) at a concentration of 1.5 and 2.0 mg/l was more effective than BA at the same concentrations. At the same time, the highest height (8.6 ± 0.2 cm) and multiplication factor (6.7 ± 0.2) were observed in the Madame Julia Correvon variety on a nutrient medium with the addition of 1.5 mg/l BA. The multiplication factor of variety Yubilejnyj 70 reached its maximum at 2.0 mg/l BA (4.2 ± 0.1), variety Multi Blue – at 1.5 and 2.0 mg/l 2-iP (4.0 ± 0 .1 and 4.3 ± 0.1, respectively).
Clematis L., clonal micropropagation, multiplication factor, nutrient media, growth regulators
Введение. Род клематис (Clematis L.) относится к семейству Ranunculaceae и насчитывает около 355 видов [1]. Клематисы в основном представлены лианами, однако встречаются также кустарниковые, полукустарниковые и травянистые жизненные формы [2]. Представители данного рода произрастают на всех континентах, кроме Арктики и Антарктиды. За многообразие окрасок, размеров и форм цветков клематисы в декоративном садоводстве часто называют «королями вьющихся растений». Данная культура также ценится за быстроту роста, обилие одновременно цветущих на одном кусте цветов (до 500 шт. и более) и продолжительность цветения (до 3 месяцев и более). Рекомендуются как высокодекоративные растения для различных видов озеленения, в том числе вертикального [3, 4].
Кроме своих декоративных свойств, многие представители рода Clematis L. являются источниками различных биологически активных соединений. В лекарственном сырье данных растений содержатся дубильные вещества, витамины, фенольные соединения и их производные, алкалоиды, гликозиды, воски, сапонины, смолы [1, 3, 5].
В культуре известны с XVI в., но лишь в XIX в. начата их интродукция, гибридизация и селекция [3]. Все сортовые клематисы, учитывая преобладающие признаки родительских пар, делятся на группы: Jackmanii, Viticella, Lanuginosa, Patens, Florida, Integrifolia и др. [5] Семена используются для размножения Clematis L. редко, так как время прорастания может занять от 2–3 недель до 12 месяцев в зависимости от вида. Также семена являются генетически не однородными, и сеянцы часто не сохраняют свойств материнского растения. Большинство гибридных сортов крупноцветковых клематисов практически не завязывает семена [6, 7]. Клематисы можно размножать делением, отводками, прививкой или черенками [6]. Размножение отводками – самый простой метод размножения клематисов, но его недостатками являются создание специальных условий для укоренения и длительный период времени (как правило, один вегетационный сезон). Прививка Clematis L. была очень распространена до середины 1900-х годов (особенно крупноцветковых клематисов), но данный метод является трудоемким, требует определенных навыков и не является эффективным для размножения некоторых видов (например, Clematis socialis Kral.). Успех черенкования Clematis L. зависит от вида, сорта, размера цветка, техники и используемого субстрата. Мелкоцветковые виды (например, Clematis montana Buch.-Ham. ex DC., Clematis tangutica (Maxim.) Korsh., Clematis viticella L.) и их сорта довольно легко размножаются стеблевыми черенками. Черенки крупноцветковых клематисов (например, Clematis armandii Franch., Clematis florida C.P.Thunberg ex A. Murray «Sieboldii») являются трудноукореняемыми. Кроме этого, черенки клематисов подвержены таким заболеваниям, как серая гниль и инфекционное увядание (вилт) клематиса, вызывающим их гибель [6, 8].
Традиционные методы размножения Clematis L. не позволяют получать достаточное количество посадочного материала, что является одной из причин разработки и широкого коммерческого использования методов размножения in vitro. Микроразмножение в комплексе с оздоровлением позволяет освободить исходный материал от вирусов, бактерий и грибов, передаваемых растениями, и получить здоровый растительный материал. Защита от болезней особенно важна при размножении ранних крупноцветковых сортов и сортов Clematis lanuginosa Lindl. & Paxton, которые являются более восприимчивыми к возбудителю Phoma clematidina [6].
Существуют исследования, касающиеся культивирования Clematis L. в условиях in vitro. В 1975 г. впервые были проведены эксперименты по проращиванию семян в условиях in vitro [5]. В публикациях Z. Mandegaran, V.K. Sieber впервые представлены успешные эксперименты по соматическому эмбриогенезу гибрида Clematis integrifolia L. ´ C. viticella L. [9]. Непрямой соматический эмбриогенез был описан у сорта клематисов Multi-Blue [10]. И.В. Митрофановой и др. [11] представлены многолетние и многосторонние исследования по разработке способа прямой регенерации растений, позволяющего на одной питательной среде непосредственно из вегетативной почки получать соматические зародыши и регенеранты у 13 сортов клематиса. В работах R.N. Hanumanaika, К. Venkatarangaiah была продемонстрирована успешная регенерация микропобегов из каллусной культуры Clematis gouriana Roxb. ex DC. [12].
Особенности клонального микроразмножения представителей Clematis L. были изучены рядом авторов [13–15]. Вместе с тем современные исследования микроразмножения клематисов носят также прикладной характер и направлены на регенерацию в условиях in vitro отдельных сортов [5]. О.И. Коротковым был усовершенствован протокол клонального микроразмножения сортов клематисов, относящихся к восьми садовым группам, и сформирована коллекция декоративных сортов Clematis L. in vitro [13]. В работе отмечено, что представители некоторых групп клематисов требуют более тщательного подбора состава питательных сред из-за высокой видо- и сортоспецифичности.
Цель исследования – оптимизации приемов культивирования на этапе собственно микроразмножения некоторых сортов Clematis L.
Задачи: подбор оптимального минерального и гормонального состава питательной среды.
Объекты и методы. Исследование выполняли в лаборатории биотехнологии растений Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина в 2021–2022 гг. В качестве объектов исследования были выбраны сорта различных групп рода Clematis L.: Texensis (Princess Diana), Viticella (Madame Julia Correvon), Jackmanii (Юбилейный 70), Patens (Multi Blue). В опытах была использована общепринятая методика биотехнологических исследований с культурами изолированных тканей и органов растений [16].
Для введения в культуру in vitro образцы клематиса были отобраны из коллекции ГБС РАН. В качестве первичных эксплантов для инициации роста и развития использовали апикальные и латеральные почки. Оптимальной была последовательная стерилизация эксплантов, состоящая из обработки 0,13 %-м раствором препарата «Чистоцвет», КЭ (ЗАО Фирма «Август», Россия) с экспозицией 20 мин, 70 % этанолом – 15 с и 7 %-м гипохлоритом кальция – 5–7 мин.
На стадии микроразмножения изучали влияние состава питательных сред MS (Murashige and Skoog, 1962) [17], WPM (Lloyd and McCown, 1981) [18], DKW (Driver and Kuniyuki, 1984) [19] и QL (Quoirin and Lepoivre, 1977) [20] на регенерацию микропобегов in vitro. В качестве контроля использовали среду MS с добавлением 0,1 мг/л BA. Для изучения влияния гормонального состава питательной среды на рост и развитие растений на стадии собственно микроразмножения использовали питательную среду DKW, дополненную цитокининами BA и 2-iP в концентрации 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 мг/л. В качестве контроля использовали среду DKW с добавлением 0,1 мг/л BA. Через 30–40 сут культивирования измеряли высоту микропобегов и подсчитывали коэффициент размножения. В условиях лаборатории микропобеги клематисов выращивали при освещении (2000 лк) и фотопериоде 16 ч, температуре 21–23 °С и влажности 70 %. Статистическую обработку данных проводили согласно стандартным методам с использованием пакета программ PAST (PAleontological STatistics). Достоверность различий между вариантами рассчитывали по t-критерию Стьюдента при Р ≤ 0,05. В таблице и графиках представлены средние значения и их стандартные ошибки.
Результаты и их обсуждение. Питательная среда является одним из важнейших факторов при клональном микроразмножении растений. Оптимальный состав питательной среды для роста регенерантов во многом зависит от генотипа культуры [11]. Наиболее часто в культуре клеток и тканей Clematis L. использовали среду MS [13]. Однако в исследовании M. Duta [21] при сравнении питательных сред MS, LF (Lee Fossard, 1972) и QL, дополненных гиббереллиновой кислотой (0,1 мг/л), BA (1,0 мг/л) и 1-нафталинуксусной кислотой (0,2 мг/л), наибольший коэффициент размножения Clematis × jackmanii 10,5) был получен на среде QL через 5 субкультивирований, что может говорить о синергетическом эффекте факторов состава питательной среды, а также типа и концентрации регуляторов роста. В настоящее время расширяется использование среды DKW, которая изначально предназначалась для размножения микропобегов и каллуса грецкого ореха [19]. Основным различием между средой DKW и MS является соотношение солей азота, кальция и фосфора, которое положительно влияет на рост и развитие многих культур (Pimpinella pruatjan Molk., Theobroma cacao L., Manihot esculenta Crantz, Corylus avellana L. и др.) [22].
На питательной среде DKW наблюдали увеличение высоты микропобегов у всех исследуемых сортов клематисов (табл.).
Морфометрические показатели различных сортов Clematis L.
в зависимости от состава питательной среды
|
Сорт |
Питательная среда |
Высота микропобега, см |
Коэффициент размножения |
|
Princess Diana |
MS |
3,3 ± 0,2 |
2,2 ± 0,2 |
|
WPM |
4,3 ± 0,2 |
2,3 ± 0,2 |
|
|
DKW |
5,0 ± 0,2 |
3,7 ± 0,1 |
|
|
QL |
3,8 ± 0,3 |
2,8 ± 0,1 |
|
|
Multi Blue |
MS |
1,9 ± 0,1 |
1,4 ± 0,1 |
|
WPM |
1,3 ± 0,1 |
1,4 ± 0,1 |
|
|
DKW |
2,8 ± 0,1 |
2,4 ± 0,1 |
|
|
QL |
1,4 ± 0,1 |
1,6 ± 0,1 |
|
|
Madame Julia Correvon |
MS |
4,0 ± 0,2 |
2,6 ± 0,1 |
|
WPM |
3,6 ± 0,2 |
2,4 ± 0,1 |
|
|
DKW |
6,3 ± 0,1 |
3,4 ± 0,1 |
|
|
QL |
3,6 ± 0,1 |
1,9 ± 0,2 |
|
|
Юбилейный 70 |
MS |
2,1 ± 0,1 |
1,8 ± 0,2 |
|
WPM |
1,8 ± 0,2 |
2,5 ± 0,2 |
|
|
DKW |
2,1 ± 0,1 |
3,3 ± 0,1 |
|
|
QL |
1,6 ± 0,1 |
2,4 ± 0,1 |
Среди исследуемых сортов отличался сорт Юбилейный 70, который не показал существенных различий по высоте микропобегов при культивировании на средах MS, WPM и DKW. Так, максимальная высота микропобега (6,3 ± 0,1 см) была характерна для регенерантов сорта Madame Julia Correvon.
Установлено, что на питательной среде DKW, вне зависимости от сорта, коэффициент размножения увеличивался. Коэффициент размножения сорта Princess Diana был максимальным (3,7 ± 0,1), однако не показал существенной разницы с сортами Madame Julia Correvon (3,4 ± 0,1) и Юбилейный 70 (3,3 ± 0,1). Также не было существенной разницы на средах MS и WPM у сортов Princess Diana, Madame Julia Correvon и Multi Blue. Самый низкий коэффициент размножения и низкая кинетика роста были отмечены у крупноцветкового сорта Multi Blue. Коэффициент размножения данного сорт составил 2,4 ± 0,1 на среде DKW, а на остальных средах варьировал в пределах от 1,4 до 1,6.
В нашем исследовании выявлено влияние различных типов и концентраций цитокининов на рост и развитие сортов Clematis L. (рис. 1).
Рис. 1. Варьирование высоты сортов Clematis L. in vitro на средах
с различными регуляторами роста
Установлено, что с повышением концентрации BA и 2-iP, вне зависимости от сорта, высота микропобега увеличивалась по сравнению с контролем. Наибольшего значения данный показатель достигал на среде с 1,5 мг/л 2-iP у сорта Madame Julia Correvon (8,6 ± 0,2 см). Наибольшую высоту регенеранты сорта Юбилейный 70 и Multi Blue достигали при использовании 2,0 мг/л 2-iP (6,6 ± 0,1 и 5,8 ± 0,1 см), однако не показали существенной разницы по этому показателю на среде с 1,5 мг/л 2-iP (6,6 ± 0,1 см и 5,8 ± 0,1). Следует отметить, что практически все сорта имели меньшую высоту при культивировании на питательной среде, содержащей BA, чем при выращивании на среде с 2-iP.
Коэффициент размножения имел тенденцию к повышению с ростом концентрации цитокининов и понижению при концентрации 2,0 мг/л 2-iP (рис. 2).
Исключение составил сорт Юбилейный 70, коэффициент размножения которого снизился на среде с 1,5 мг/л BA (3,4 ± 0,1) и повысился на среде с 2,0 мг/л BA (4,2 ± 0,1). Для регенерантов сорта Multi Blue было характерно понижение коэффициента размножения, начиная с концентрации 1,5 мг/л BА. При концентрациях 1,5 и 2,0 мг/л 2-iP (4,0 ± 0,1 и 4,3 ± 0,1) показатель продолжал расти, однако разница между последними двумя вариантами была не существенна. Наибольший коэффициент размножения был характерен для сорта Madame Julia Correvon (6,7 ± 0,2) на питательной среде с добавлением 1,5 мг/л BA. Данный показатель также достигал своего максимума у регенерантов сорта Юбилейный 70 (5,4 ± 0,1).
C увеличением концентрации BA наблюдали негативные морфологические изменения регенерантов: формирование деформированных и оводненных микропобегов желто-зеленой окраски. В дальнейшем это приводило к замедлению их развития. Полученные нами данные согласуются с результатами других исследователей [14]. В случае 2-iP негативные морфологические изменения наблюдали при повышении концентрации до 2,0 мг/л.
Рис. 2. Варьирование коэффициента размножения различных сортов Clematis L. in vitro на средах с различными регуляторами роста
Наибольший морфогенетический потенциал был характерен для представителя группы Viticella (сорт Madame Julia Correvon), наименьший – для представителя группы Patens (сорт Multi Blue). В исследовании О.И. Короткова [13] отмечено, что наибольшей способностью к регенерации обладали сорта групп Viticella и Early Large-flowered (включающей группу Patens). Однако в нашем исследовании сорт Multi Blue характеризовался низкими морфометрическими показателями, что может быть связано со специфическими особенностями крупноцветковых сортов, которые, как было отмечено в работе [6], имеют меньший потенциал к размножению.
Заключение. В процессе исследования выявлено, что на регенерирующую способность сортов Clematis L. в культуре изолированных тканей существенное влияние оказывает генотип: сорт Madame Julia Correvon (Viticella) отличался наибольшим морфогенетическим потенциалом по сравнению с крупноцветковыми сортами Юбилейный 70 (Jakmanii) и Multi Blue (Patens). Регенеранты различались по своей реакции на содержание BA и 2-ip в питательной среде. Выявлено, что на этапе собственно микроразмножения сортов Clematis L. наиболее эффективно использовать питательную среду DKW c добавлением 2-iP в концентрации 1,5–2,0 мг/л.
1. Chemical and biological research of Clematis medicinal resources / D. Hao [et al.] // Chin Sci Bull. 2013. Vol. 58 (10). P. 1120–1129. DOI:https://doi.org/10.1007/s11434-012-5628-7.
2. Nasurdinova R.A., Zhigunov O.Yu. Dikorastuschie klematisy v kollekcii Botanicheskogo sada g. Ufy // Vestnik Orenburgskogo gosudarstvennogo universiteta. 2009. № 6. S. 272–274.
3. Saparklycheva S.E., Chapalda T.L. Vidy klematisa (Clemátis L.), ispol'zuemye v landshaftnom dizayne // Agrarnoe obrazovanie i nauka. 2020. № 1.
4. Richard G. Hawke. Clematis for Northern Landscapes // Plant Evaluation Notes. 1997. Iss. 10. P. 1–7.
5. Myakisheva E.P. Primenenie metodov biotehnologii dlya sozdaniya sortovyh kollekciy i polucheniya posadochnogo materiala roda Clematis L. // Izvestiya Altayskogo gosudarstvennogo universiteta. 2013. T. 2, № 3 (79). S. 92–94.
6. Johnson C. Stem cutting propagation of the endangered species [Degree of Master of Science Thesis, Auburn University] // Electronic Theses and Dissertations of Auburn University. 2006. URL: https://etd.auburn.edu/xmlui/bitstream/handle/10415/597/JOHNSON_CONNIE_58.pdf?sequence=1&isAllowed=y (data obrascheniya: 20.10.2022).
7. Mitrofanova I.V., Sokolov O.I., Ezhov V.N. Nepryamoy somaticheskiy embriogenez klematisa (Clematis sp.) // Sb. tr. GNBS. 2007. T. 127. P. 9–20.
8. Kreen S., Svensson M., Rumpunen K. Rooting of clematis microshoots and stem cuttings in different substrates // Scientia Horticulturae. 2002. V. 96. Iss. 1–4. P. 351–357. DOI:https://doi.org/10.1016/S03 04-4238(02)00126-7.
9. Mandegaran Z., Sieber V.K. Somatic embryogenesis in Clematis integrifolia × C. viticella // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2000. V. 62. № 2. P. 163–165. DOI:https://doi.org/10.1023/A:1026 514707169.
10. Somatic embryogenesis and plant regeneration of clematis 'Multi-Blue' / Q.X. Zhang [et al.] // Propagation of Ornamental Plants. 2011. № 11. P. 21–27.
11. In vitro regeneration of Clematis plants in the Nikita Botanical Garden via somatic embryogenesis and organogenesis / I. Mitrofanova [et al.] // Front. Plant Sci. 2021. 12:541171. DOI:https://doi.org/10.3389/fpls.2021.541171.
12. Hanumanaika R.N., Venkatarangaiah K. Plant regeneration from callus culture of Clematis gouriana Roxb. // Turkish Journal of Biology. 2008. Vol. 32. № 2. P. 99–103.
13. Korotkov O.I. Formirovanie i kompleksnoe izuchenie kollekcii klematisov (rod Clematis L.): biotehnologicheskie i molekulyarno-geneticheskie aspekty: avtoref. dis. ... kand. biol. nauk: 03.00.05. M., 2004. 15 s.
14. Ivanova N., Mitrofanova I., Zubkova N. Cytokinin effect on shoot formation in clematis in vitro // Bulletin of Udmurt University. Series Biology. Earth Sciences. 2017. Vol. 27. P. 278–284.
15. Chavan J., Gaikwad P. Rapid in vitro propagation of Clematis heynei M. A. Rau: an important medicinal plant // Emirates Journal of Food and Agriculture. 2012. Vol. 23. P. 79–84. DOI:https://doi.org/10.9755/ejfa.v24i1.10601.
16. Butenko R.G. Biologiya kul'tiviruemyh kletok i biotehnologiya rasteniy. M.: Nauka, 1991. 279 c.
17. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Plant Physiology.1962. Vol. 15. P. 473–497.
18. McCown B.H., Lloyd G. Woody Plant Medium (WPM) – a mineral nutrient formulation for microculture of woody plant species // HortScience. 1981. Vol. 16. P. 453–453.
19. Driver J.A., Kuniyuki A.H. In Vitro Propagation of Paradox Walnut Rootstock // HortScience. 1984. Vol. 19. P. 507–509.
20. Quoirin M., Lepoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. // Acta Horticulturae. 1977. Vol. 78. P. 437–442.
21. Duta M., Posedaru A. In vitro propagation of Clematis jackmanii // Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca: horticulture. 2008. Vol. 65. Iss. 1. P. 462–462.
22. Rahman S.S. DKW emerges as a superior media factor in in vitro plant regeneration // J. Agri. Vol. 1. № 1. P. 3–4.
