Russian Federation
Crown rust of oats, caused by the obligate parasite Puccinia coronata Corda f. sp. Avenae Erikss has a significant impact on oat production, leading to a decrease in grain yield and a deterioration in the quality of the resulting product. One of the most effective ways to combat crown rust epiphytoties is to create genetically resistant varieties. Molecular labeling methods can make this process more efficient and targeted. The purpose of research is to evaluate the effectiveness of primers for highly effective crown rust resistance genes using a genetic collection of Siberian oats. The material for the study was samples of oats cultivated by the Research Institute of Agriculture of the Northern Trans-Urals – a branch of the Tyumen Scientific Center SB RAS, as well as source varieties of highly effective genes for resistance to crown rust from the collection of the All-Russian Research Institute. To select optimal conditions for amplification, 3 different modes, 4 reaction mixtures, and a temperature gradient of 55.0–70.0 °C were used. The melting temperature was determined for each primer. Amplification products were separated in 2 % agarose and 8 % polyacrylamide gels. Amplification products were obtained, visualized on the gel in the form of clear bands. For none of the source varieties of Pc genes, amplification products were obtained that distinguished them from samples without these genes. This indicates their ineffectiveness for assessing the genetic collection of samples of Siberian selection. To successfully carry out marker-associated selection of oats for resistance to crown rust in Western Siberia, it is necessary to evaluate the effectiveness of other known primers for Pc genes, as well as the creation of our own marker systems.
oats (Avena sativa L.), crown rust of oats (Puccinia coronate Corda f. sp. avenae Erikss), Pc resistance genes, polymerase chain reaction, primer, genetic collection, marker-assisted selection
Введение. Овес посевной (Avena sativa L.) – зерновая культура, широко используемая как корм для животных и птицы, а в последнее время приобретающая все большую популярность и в питании человека. Зерно овса обладает сбалансированным аминокислотным составом, богато жирными кислотами и β-глюканами, благодаря чему широко используется в диетическом и функциональном питании [1, 2].
Большое влияние на производство этой культуры оказывает возбудитель корончатой ржавчины овса – Puccinia coronata Corda f. sp. avenae Erikss. Это заболевание приводит к снижению урожайности зерна до 20 % и более, а также ухудшает качество получаемой крупы. Защита от данного паразита требует комплексного подхода, включающего удаление альтернативных хозяев рода Rhamnus L., которые способствуют не только размножению патогена, но и эволюции новых рас; внесение прикорневых фунгицидов и создание сортов с генетической устойчивостью к патогену [3, 4].
У овса идентифицировано более 100 генов устойчивости к корончатой ржавчине [5]. В качестве доноров генов расоспецифической устойчивости широко используют дикие популяции A. sterilis L., от которых интрогрессирована почти половина из описанных генов: Pc35, Pc36, Pc38-77, Pc97, Pc98, Pc101, Pc103, Pc104. Кроме того, источниками генов устойчивости выступают такие виды, как A. magna Murphy et Terr., A. strigosa Schreb., A. longiglumis Durieu, A. murphyi Ladiz, A. barbata Pott. ex Link [3, 4].
Значительно повысить эффективность селекционного процесса, в том числе и на устойчивость к заболеваниям, позволяют методы молекулярного маркирования. Маркер-ассоциированная селекция (marker-assisted selection) основывается на применении ДНК-маркеров, сцепленных с целевым геном или локусом [6, 7]. Овес в генетическом плане изучен меньше, чем пшеница и ячмень. Как отмечает А.В. Бакулина с соавт., несмотря на большое разнообразие описанных в литературе генов Pc, лишь для небольшого числа из них определена хромосомная локализация и указаны сцепленные ДНК-маркеры [3]. Эффективность ДНК-маркера на конкретной картирующей популяции не означает, что он будет также эффективен на другом селекционном материале [8].
Цель исследований – оценка эффективности некоторых праймеров к высокоэффективным генам устойчивости к корончатой ржавчине с использованием генетической коллекции овса сибирской селекции.
Материалы и методы. Исследования проводили на базе лаборатории геномных исследований в растениеводстве Тюменского научного центра СО РАН в 2022 г. Материалом для исследования послужили селекционные линии и сорта овса посевного селекции НИИСХ Северного Зауралья – филиала ТюмНЦ СО РАН, а также сорта – источники высокоэффективных генов устойчивости к корончатой ржавчине из коллекции Федерального исследовательского центра «Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова» (ВИР). В качестве отрицательного контроля использовались восприимчивые к корончатой ржавчине сорта овса – Neklan и Kasztan (табл. 1).
На основе литературных источников были подобраны праймеры к высокоэффективным генам устойчивости к корончатой ржавчине овса (табл. 2) [9].
Таблица 1
Анализ образцов овса посевного
|
№ п/п |
Шифр |
Сорт / линия |
Ген Pc |
№ п/п |
Шифр |
Сорт / линия |
|
1 |
В1 |
РС 38 |
Pc 38 |
18 |
С5 |
Тоболяк |
|
2 |
В2 |
Нарпс (РС 39) |
Pc 39 |
19 |
С6 |
Радужный |
|
3 |
В3 |
Гибрид (к-15020) |
Pc 38 |
20 |
С7 |
Сириус |
|
4 |
В4 |
Гибрид (к-15021) |
Pc 39 |
21 |
С8 |
ТМ 07-95-16 |
|
5 |
В5 |
AC Goslin |
Pc 48 |
22 |
С9 |
ТМ 11-6-1 |
|
6 |
В6 |
Камбулинский |
Pc 48 |
23 |
С10 |
ТМ 11-41 |
|
7 |
В7 |
РС 68 |
Pc 68 |
24 |
С11 |
14-67-3 |
|
8 |
В8 |
AC Francis |
Pc 68 |
25 |
С12 |
14-50-30 |
|
9 |
В9 |
PC 58 |
Pc 58 |
26 |
С13 |
16-58-10 |
|
10 |
В10 |
AC Medalion |
Pc 38, 39, 68 |
27 |
С14 |
16-46-9 |
|
11 |
В11 |
Astor |
|
28 |
С15 |
16-33-11 |
|
12 |
В12 |
Neklan |
Восприимчивый |
29 |
С16 |
16-67-2 |
|
13 |
В13 |
Kasztan |
Восприимчивый |
30 |
С17 |
16-8-19 |
|
14 |
С1 |
Мегион |
|
31 |
С18 |
16-58-4 |
|
15 |
С2 |
Талисман |
|
32 |
С19 |
16-43-15 |
|
16 |
С3 |
Отрада |
|
33 |
С20 |
16-46-16 |
|
17 |
С4 |
Фома |
|
|
|
|
Примечание: В1–В13 – образцы, предоставленные из коллекции ВИР, С1–С20 – образцы из коллекции НИИСХ Северного Зауралья.
Таблица 2
Праймеры к генам Pc, использованные для оценки коллекции овса посевного
|
Ген / Праймер |
Последовательность |
|
1 |
2 |
|
Pc38 GMI_ES17_c4223_141 |
F-GATGCCCAAGCACTTCTCC R-GAAGAAGGTACAATGATAGGAGCTG |
|
Pc38 GMI_DS_LB_459 |
F-GTCTGAGCAGCTAGGGATCG R-TGCCCAAGTTCAGTTCAGTG |
|
Рс38 Xcdo673 |
F-GCCATTGGTATTGCGAGAGG R-ACGAGCGTCAGTCGGTCACT |
|
Pc48 GMI_ES01_c10310_366 |
F- CTGGTACGACCGTTCTGTCA R- CCTTCTTCGATCATCGGCTA |
Окончание табл. 2
|
1 |
2 |
|
Pc48 GMI_ES_LB_9185 |
F-CATCTCTGGATTTGAGGGTGA R-CTTGGGCTCATTGATCTGGT |
|
Pc68 GMI_DS_LB_8147 |
F- GGCACCATACGAGGTAGTTTATG R- TGTGGGTAGATTTTTGTGACCA |
|
Pc68 GMI_ES02_c11450_462 |
F-GGGCGATTTCTTGTAGTGGA R-TCTCAGATGGTGAGGTTAGTATCG |
|
Pc68 GMI_DS_A3_340_378 |
F-AAAGTGGCAACAAAGGGATGAC R-GCGGTATTTTGATCTGATTTGC |
|
Pc71 GMI_ES01_c3435_183 |
F- CAAGCTCTGTGAAGATGTTGC R- AAAGCGACGAATTTCAAGCA |
|
Pc71 GMI_ES15_c14779_89 |
F-GATACTACAGACGAGGCATCCA R-CAAGATCACAACTGGCCTCA |
Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) для исследований выделяли из 5-дневных проростков с помощью набора для выделения «ЦитоСорб», Синтол. Для подбора условий полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали концентрированную и разведенную в 10 раз ДНК.
При подборе оптимальных условий амплификации применяли несколько реакционных смесей (табл. 3).
Таблица 3
Состав смесей для амплификации, мкл
|
Показатель |
Смесь 1 |
Смесь 2 |
Смесь 3 |
Смесь 4 |
|
10×буфер |
2,5 |
2,0 |
2,5 |
2,0 |
|
MgCl2 |
1,5 |
2,0 |
1,5 |
0,8 |
|
dNTP |
2,0 |
0,5 |
1,0 |
1,6 |
|
primerF |
0,6 |
0,25 |
1,5 |
0,5 |
|
primerR |
0,6 |
0,25 |
1,5 |
0,5 |
|
Taq.Polymerase |
0,2 |
0,5 |
0,5 |
0,2 |
|
H2O |
15,6 |
13,5 |
9,0 |
12,4 |
|
ДНК |
2,0 |
1,0 |
2,5 |
2,0 |
|
Объем 1 образца, мкл |
25,0 |
20,0 |
20,0 |
20,0 |
Разделение фрагментов амплификации проводили в 2 % агарозном и 8 % полиакриламидном гелях (ПААГ). В состав ПААГ входили: акриламид 30 % – 13,3 мл; вода бидистиллированная – 26,4 мл; персульфат аммония 3 % – 4 мл; буфер 5×ТВЕ (маточный раствор трис-борат-ЭДТА (Tris-Borat-EDTA)) – 10 мл; ТЕМЕД (тетраметилэтилендиамин)– 15 мкл.
Для проведения амплификации использовали несколько режимов (табл. 4).
Таблица 4
Использованные режимы амплификации
|
Режим |
Этап |
Температура, °С |
Длительность |
Количество циклов |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
1 |
Денатурация |
94 |
3 мин |
45 |
|
|
94 |
30 с |
||
|
Отжиг |
36 |
1 мин |
||
|
Элонгация |
72 |
2 мин |
Окончание табл. 4
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
2 |
Денатурация |
98 |
2 мин |
35 |
|
|
98 |
15 с |
||
|
Отжиг |
56 |
15 с |
||
|
Элонгация |
72 |
15 с |
||
|
|
72 |
5 мин |
||
|
3 |
Денатурация |
95 |
3 мин |
34 |
|
|
95 |
30 с |
||
|
Отжиг |
60 |
30 с |
||
|
Элонгация |
72 |
1 мин |
||
|
|
72 |
5 мин |
Результаты и их обсуждение. На начальном этапе для проведения ПЦР использовали только ДНК сортов-источников генов Pc с целью увидеть продукт амплификации, свидетельствующий о наличии целевого гена в сортах-донорах. На электрофореграммах восприимчивых сортов, выступающих в качестве отрицательного контроля, целевой фрагмент должен был отсутствовать.
Важным этапом в повышении чувствительности и специфичности ПЦР является правильный подбор концентрации ионов магния и температуры плавления/отжига праймеров [10–13]. В настоящее время существует большой выбор программного обеспечения для расчетов теоретических величин данных показателей, но зачастую подбирать оптимальные условия амплификации приходится эмпирическим путем. В нашем случае для подбора наиболее подходящих условий для каждого из праймеров были использованы различные буферные смеси и режимы амплификации.
В результате проведения амплификации со смесями 1 и 2 при режиме 1 четких отличий между образцами, имеющими в своем генотипе целевой ген, и образцами без него не выявлено (рис.1).
|
|
|
Рис. 1. Продукты амплификации, полученные при использовании ДНК образцов В1–В13 и смеси 2, режим амплификации 1. 1–13 – порядковые номера образцов В1–В13. Подписи на рисунке обозначают ген устойчивости и используемый праймер, :10 – ДНК в 10-кратном разведении |
Для оптимизации режима амплификации была рассчитана приблизительная температура плавления праймеров по формуле
Tm (°C) = 2×(nA+nT)+4×(nG+nC),
где nA – количество нуклеотидов аденина; nT – количество нуклеотидов тимина; nG – количество нуклеотидов гуанина; nC – количество нуклеотидов цитозина в праймере [14]. Исходя из полученных значений, был модифицирован режим амплификации. Для праймеров GMI_ES17_c4223_141, GMI_ES01_c10310_366 и GMI_DS_LB_8147 Тm составила 56,5 °С, GMI_DS_A3_340_378 – 58,0 °С, время отжига – 30 с. Остальные значения режима амплификации остались прежними. Использовали смеси 1 и 2. Разделение фрагментов амплификации проводили в 2 % агарозном геле и 8 % ПААГ.
|
|
|
Рис. 2. Продукты амплификации, полученные при использовании ДНК образцов В1–В13, смеси 2, Тm = 56,5 °С. Гель – ПААГ 8 %. 1–13 – порядковые номера образцов В1–В13. Подписи на рисунке обозначают ген устойчивости и используемый праймер |
Благодаря более высокой разрешающей способности полиакриламидного геля по сравнению с агарозным разделение продуктов амплификации в 8 %-м ПААГ позволило отличить несколько фрагментов с близкой молекулярной массой. Однако эти бэнды также были характерны для всей выборки образцов.
Как отмечают П.С. Новиков с соавт. (2011), оптимальная температура плавления праймера может отличаться от теоретически рассчитанной. Например, на значение этой величины могут оказывать влияние соседние азотистые основания, участвующие в стэкинг-взаимодействиях [13]. При этом, подбирая оптимальную Tm, необходимо учитывать все возможные динуклеотиды в конкретной последовательности.
Для того чтобы подобрать оптимальную Tm на примере праймера GMI_DS_LB_459 к гену Pc38, нами был использован температурный градиент 55,0–70,0 °С, режим амплификации 2 и реакционная смесь 3. В результате получено множество неспецифичных фрагментов. Однако электрофореграммы продуктов амплификации образцов В1 и В3, в генотипе которых присутствует ген Pc38, не отличались от электрофореграмм других образцов, в том числе и от отрицательного контроля (В12 и В13) (рис. 3).
|
|
|
Рис. 3. Продукты амплификации с праймером GMI_DS_LB_459, полученные при использовании ДНК в 10-кратном разведении образцов В1–В13, смесь 3, градиент температур. 57,9–70,0 °С – Tm праймера |
Как видно из рисунка 3, с повышением температуры происходит уменьшение эффективности ПЦР-реакции, о чем свидетельствует снижение окраски бэндов. Схожую картину отмечала Г.Д. Абишева с соавт. при разработке протокола амплификации для выявления бруцелл [10].
Установлено, что использование концентрированной ДНК давало более четкие продукты амплификации, поэтому в дальнейших исследованиях разведенную ДНК не применяли. Для анализа ДНК образцов использовали смеси 2, 3 и 4, режимы амплификации 2 и 3. Температуру отжига подбирали для каждого праймера индивидуально.
|
|
|
Рис. 4. Продукты амплификации, полученные при использовании ДНК образцов В1–В13 (1–13) и С1–С20 (14–33), смеси 3, режим амплификации 2, Тm = 56,0 °С. 1–13 – порядковые номера образцов В1–В13, 14–33 – образцов С1–С20. Подписи на рисунке обозначают ген устойчивости и используемый праймер |
В результате были получены продукты амплификации, визуализирующиеся на геле в виде четких бэндов. Однако, несмотря на применение различных смесей и режимов амплификации, нами не был выявлен полиморфизм при использовании анализируемых праймеров. Ни для одного из сортов – источников генов Pc не было получено продуктов амплификации, отличающих их от образцов без данных генов.
Известно, что молекулярные маркеры, разработанные на одной картирующей популяции, могут оказаться неэффективными при использовании их на другой. В связи с этим любые молекулярные маркеры должны быть верифицированы на большом объеме генетически разнообразного материала [8, 15,16]. Праймеры, анализируемые нами в данной статье, были получены на определенных картирующих популяциях овса и показали высокую эффективность при использовании на этих коллекциях. Однако, как показывают полученные нами результаты, эти ДНК-маркеры не подходят для выявления генов устойчивости к корончатой ржавчине в других популяциях и генетических коллекциях. Помимо оценки эффективности других известных праймеров к генам устойчивости к корончатой ржавчине овса, выходом в данной ситуации может стать создание собственной маркерной системы, включающей в себя анализ информации о нуклеотидных последовательностях участка генома, например с использованием молекулярных маркеров, описанных C.P. Wight et al. (2015) [17]; конструирование праймеров; подбор условий амплификации и экспериментальную проверку работоспособности полученных праймеров.
Заключение
1. С использованием генетических коллекций образцов овса сибирской селекции проведена оценка ДНК-маркеров к высокоэффективным генам устойчивости к корончатой ржавчине. Для каждого из праймеров подобраны оптимальные состав реакционной смеси и режим амплификации, позволяющие получать продукты амплификации, визуализирующиеся при разделении в виде четких бэндов.
2. Ни с одним из исследованных праймеров не было получено продуктов амплификации, позволяющих сделать вывод о наличии или отсутствии в анализируемых генотипах определенных генов устойчивости к корончатой ржавчине, что свидетельствует об их неэффективности для оценки генетической коллекции образцов сибирской селекции.
3. Для успешного проведения маркер-ассоциированной селекции овса на устойчивость к корончатой ржавчине в Западной Сибири необходима оценка эффективности других известных праймеров к высокоэффективным генам Pc, а также создание собственных маркерных систем.
1. Nutritional and Functional Characterization of Different Oat (Avena sativa L.) / M.S. Ibrahim [et al.] // Cultivars. Int. J. Food Prop. 2020. 23(1). P. 1373–1385. DOI:https://doi.org/10.1080/10942912. 2020.1806297.
2. The Origin and Resource Potential of Wild and Cultivated Species of the Genus of Oats (Avena L.) / I.G. Loskutov [et al.] // Russian Journal of Genetics. 2021. Vol. 57. № 6. P. 642–661. DOI:https://doi.org/10.1134/S1022795421060065.
3. DNK-markery v selekcii ovsa na ustoychivost' k koronchatoy rzhavchine (obzor) / A.V. Bakulina [i dr.] // Tr. po prikladnoy botanike, genetike i selekcii. 2022. № 183 (1). S. 224–235. DOI:https://doi.org/10.30901/2227-8834-2022-1-224-235.
4. Chromosomal location of the crown rust resistance gene Pc98 in cultivated oat (Avena sativa L.) / J. Zhao [et al.] // Theor Appl Genet. 2020. 133 (4). P. 1109–1122. DOI: 10.1007/ s00122-020-03535-x.
5. Admassu-Yimer B., Bonman J.M., Esvelt Klos K. Mapping of crown rust resistance gene Pc53 in oat (Avena sativa) // PLoS ONE. 2018. 13(12): e0209105. DOI:https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0209105.
6. Sowa S., Paczos-Grzęda E. Identification of molecular markers for the Pc39 gene conferring resistance to crown rust in oat // Theor Appl Genet. 2020. 133(4). P. 1081–1094. DOI:https://doi.org/10.1007/s00122-020-03533-z.
7. Hlestkina E.K. Molekulyarnye markery v geneticheskih issledovaniyah i v selekcii // Vavilovskiy zhurnal genetiki i selekcii. 2013. T. 17, № 4-2. S. 1044–1054.
8. Pavlenko A.A. Otrabotka metodiki mikrosatellitnogo analiza grushi (Pyrus) iz kollekcii VNIISPK // Selekciya i sortorazvedenie sadovyh kul'tur. 2022. T. 9, № 1. S. 78–85. DOI:https://doi.org/10.24411/25000454_2022_ 0115.
9. Admassu-Yimer B., Esvelt Klos K. PCR-Based High-resolution Melt Markers for Pc genes. Part 2: SNPs linked to Pc38, Pc48, Pc68, and Pc71 // Oat Newsletter. 2016. V. 53. № 11.
10. Razrabotka protokola polimeraznoy cepnoy reakcii s detekciey v agaroznom gele dlya vyyavleniya brucell / G.D. Abisheva [i dr.] // Biotehnologiya. Teoriya i praktika. 2014. № 1. S. 57–61.
11. Optimizaciya usloviy amplifikacii metodom PCR v rezhime real'nogo vremeni s primeneniem specifichnyh praymerov dlya opredeleniya patogennyh shtammov Listeria monocytogenes s invazivnoy aktivnost'yu / E.V. Sokolova [i dr.] // Sb. tez. VI Mezhdunar. konf. molodyh uchenyh: biofizikov, biotehnologov, molekulyarnyh biologov i virusologov (Kol'covo, 22–25 oktyabrya 2019 g.) / Novosib. nac. issled. gos. un-t. Kol'covo, 2019. S. 623–626.
12. Raznoobrazie praymerov dlya PCR i principy ih podbora / R.R. Garafutdinov [i dr.] // Biomika. 2019. T. 11, № 1. S. 23–70.
13. Novikov P.S., Milyutina T.N., Sheykina O.V. Optimizaciya provedeniya PCR-reakcii pri ISSR-analize DNK plyusovyh derev'ev sosny obyknovennoy // Plodovodstvo, semenovodstvo, introdukciya drevesnyh rasteniy. 2011. № 14. S. 79–81.
14. Bessolicyna E.A., Koposova O.N. Podbor praymerov dlya identifikacii Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia burgdorferi // Obschestvo. Nauka. Innovacii (NPK-2019): sb. st. XIX Vseros. nauch.-prakt. konf. (Kirov, 1–26 aprelya 2019 g.): v 4 t. / Vyatskiy gos. un-t. Kirov, 2019. T. 1. S. 13–19.
15. Verifikaciya golubiki vysokorosloy (Vaccinium corymbosum L.) s ispol'zovaniem mikrosatellitnyh markerov / A.N. Yuhimuk [i dr.] // Introdukciya, sohranenie i ispol'zovanie biologicheskogo raznoobraziya flory: mat-ly mezhdunar. nauch. konf., posvyasch. 90-letiyu Central'nogo botanicheskogo sada Nacional'noy akademii nauk Belarusi (Minsk, 21–24 iyunya 2022 g.): v 2 ch. / redkollegiya: V.V. Titok [i dr.]. Minsk: Beltamozhservis, 2022. Ch. 2. S. 199–203.
16. Mac'kiv A.O., Koninskaya N.G., Shurkina E.S. Analiz geneticheskogo raznoobraziya populyaciy chaya na Zapadnom Kavkaze // Subtropicheskoe i dekorativnoe sadovodstvo. 2022. № 80. S. 78–85. DOI:https://doi.org/10.31360/2225-3068-2022-80-78-84.
17. Discovery, localization, and sequence characterization of molecular markers for the crown rust resistance genes Pc38, Pc39, and Pc48 in cultivated oat (Avena sativa L.) / C.P. Wight [et al.] // Molecular Breeding. 2004. № 14. P. 349–361. DOI:https://doi.org/10.1007/s11032-004-0148-z.
