UDK 634.74 Прочие ягодные культуры
The aim of the study is to improve the technology of clonal micropropagation of Arctic bramble for mass production of planting material. The studies were conducted in 2022–2023 in the Laboratory of Plant Biotechnology of the N.V. Tsitsin Main Botanical Garden of the Russian Academy of Sciences (MBG RAS). Hybrid varieties of Rubus arcticus L. were used in the experiment: Beata, Sofia, Anna, and Astra. The effect of various growth regulators and their concentrations on the regeneration of R. arcticus L. explants was studied. When cultivating on nutrient media with different concentrations of 6-benzylaminopurine (6-BAP), no significant difference was found in the number of microshoots between Arctic bramble varieties. On a nutrient medium with the addition of 1.0 mg/l 6-BAP, Arctic bramble explants formed the maximum number of microshoots (2.93 pcs.). A significant influence of the type of cytokinin and their combinations on the reproduction rate, height and number of microshoots of Arctic bramble was noted. Cultivation on a nutrient medium with the addition of 1.0 mg/l thidiazuron and 6-BAP contributed to the formation of the greatest number of microshoots (4.33 ± 0.88 pcs.) and the maximum multiplication coefficient (14.33 ± 0.84) in Arctic bramble in vitro. A significant effect of the genotype and growth regulators on the rooting of R. arcticus microshoots was established. The Beata variety had the lowest percentage of rooted microshoots (61.5 %), average values were found in Anna (65 %) and Astra (72 %), and the maximum was found in Sofia (77 %). A nutrient medium with the addition of 0.5 mg/l IAA contributed to the active rooting of Arctic bramble microshoots (82 %).
Rubus arcticus, clonal micropropagation, cytokinins, auxins, multiplication coefficient, rooting
Введение. На сегодняшний день возрастает интерес к малораспространеным культурам с высоким содержанием биологически активных веществ и уникальными вкусовыми качествами. Одной из таких культур является княженика (Rubus arcticus L.).
R. arcticus представляет собой невысокое, до 30 см, многолетнее растение с тонким ползучим корневищем, образующим выводковые почки. Княженика цветет в июне-июле розовыми цветками. Плоды, темно-пурпурные, похожие на малину, созревают в июле-сентябре. Ареал княженики простирается в субарктическом поясе Евразии и Северной Америки [1].
Отличительной особенностью R. arcticus является вкус и аромат плодов, который обусловлен комбинацией из более 60 различных ароматических соединений [2]. Содержащиеся в листьях флавоноиды и сапонины, а в плодах производные фурана, фенолы и антоцианы, и другие биологически активные вещества оказывают противовоспалительное и радиопротектерное действие [3]. Таким образом, растение R. Arcticus является ценным сырьем не только для изготовления продуктов питания и виноделия, но и для фармацевтического производства.
Княженику можно использовать и как декоративную культуру. В естественных условиях произрастания встречаются экземпляры с махровыми светло-лиловыми цветками, которые можно использовать как цветовой акцент в альпийских горках и рокариях. Растение подходит для моновидовых композиций [4].
Несмотря на большое число хозяйственно ценных качеств, промышленные насаждения R. arctica немногочисленны и расположены, преимущественно, в странах Северной Европы. Возможно, это связано с низкой урожайностью и прихотливостью растения вначале введения в культуру. Mespi и Mesma были первыми культиварами, полученными в Финляндии на основе R. arctica. Последующее скрещивание R. arctica с R. arcticus subsp. stellatus (Sm.) B. Boivin позволило создать сорта с большим размером плодов, но все еще уступающих по урожайности другим представителям рода Rubus. Селекция R. arctica ведется и в России. Так, Д.Н. Зонтиковым и другими предложена методика получения гаплоидных растений R. arcticus для последующего создания гибридных линий [5, 6].
Традиционные способы вегетативного размножения княженики не способны удовлетворить повышающийся спрос на посадочный материал. Кроме этого, плантациям R. arcticus свойственно быстро истощаться: через 3–4 года урожайность культуры резко снижается, а осушение ее естественных мест обитания и вытаптывание лесных угодий способствуют постепенному исчезновению княженики из дикой природы [7].
Таким образом, разработка протоколов клонального размножения in vitro княженики, позволяющих получать в относительно короткое время большое количество генетически однородного, оздоровленного посадочного материала становится важной для промышленного производства [8].
Некоторые особенности культивирования R. arcticus in vitro были изучены зарубежными и отечественными учеными. В исследованиях Harri I. Kokko и др. успешно размножали R. Arcticus и R. saxatilis на питательной среде с добавлением 6-бензиламинопурина в концентрации 1,5 мг/л [9]. Этапы собственно клонального микроразмножения и укоренения описаны в работах С.С. Макарова и Д.Н. Зонтикова [10, 11]. Однако данные по оптимальным регуляторам роста для культивирования R. arcticus in vitro не однозначны, что делает актуальным дальнейшее совершенствование протокола клонального микроразмножения княженики.
Цель исследования – усовершенствование технологии клонального микроразмножения княженики для массового получения посадочного материала.
Объекты и методы. Исследования проводили в 2023–2024 гг. в лаборатории биотехнологии растений ГБС РАН. В качестве объектов исследования использованы сорта, относящиеся к гибридам R. Arcticus × R. arcticus subsp. stellatus: Beata, Sofia, Anna и Astra.
На этапе собственно микроразмножения применяли минеральную основу питательной среды Murashige and Skoog (MS).
В первом опыте проводили сравнение различных концентраций 6-БАП: 0,3; 0,5; 1,0 мг/л и безгормональной питательной среды в качестве контрольного варианта.
Во втором опыте оценивали действие различных цитокининов (6-БАП, тидиазурон (ТДЗ), метатополин (мТ)) и их сочетаний в концентрации 1,0 мг/л на морфогенез сортов княженики in vitro. Через 45 дней учитывали высоту микропобегов, число микропобегов и коэффициент размножения. Коэффициент размножения рассчитывали, как произведение среднего числа эксплантов, полученных с одного микропобега, и числа микропобегов, образованных у одного экпланта.
На этапе укоренения микропобеги княженики высаживали на питательную среду 1/2 MS с добавлением 20 г/л сахарозы. В исследовании анализировали влияние ИУК и ИМК в концентрациях 0,3 мг/л и 0,5 мг/л на укореняемость микропобегов.
Экспланты культивировали при температуре (23 ± 2) °С, фотопериоде 16/8 и освещенности 2000 лк. Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета программ SPSS Statistics 23. Для сравнения средних величин и установления статистически значимые различий применяли множественный ранговый критерий Дункана. Варианты опыта, отмеченные одинаковыми буквами, не имеют статистических различий при p < 0,05.
Результаты и обсуждение. Рост и развитие тканей растения на этапе собственно микроразмножения зависит от выбора оптимальных регуляторов роста и их концентрации [12]. При культивировании in vitro наиболее часто используют 6-БАП. В ходе изучении влияния концентраций 6-БАП на биометрические показатели эксплантов княженики, статистически значимые различия выявлены только по числу микропобегов (рис. 1).
Рис. 1. Влияние концентраций 6-БАП на число микропобегов княженики в культуре in vitro
(различными буквами обозначены варианты, имеющие значимые различия по критерию Дункана при p < 0,05)
В ходе дисперсионного анализа установлено существенное различие по числу микропобегов между контрольным вариантом опыта и вариантами с добавлением 6-БАП в различных концентрациях в состав питательной среды. Однако, экспланты, культивируемые на питательных средах с различной концентрацией 6-БАП, статистически не различались по данному показателю. Использование 6-БАП стимулировало образование адвентивных микропобегов при любой концентрации, максимальное число микропобегов получено на питательной среде с добавлением 1,0 мг/л 6-БАП и составило 2,93 шт. При культивировании на питательной среде без добавления 6-БАП экспланты княженики образовывали минимальное число микропобегов – 1,45 шт. Это согласуется с работами других ученых. Для некоторых представителей рода Rubus оптимальной является концентрация в питательной среде 6-БАП в пределах от 0,5 до 1,5 мг/л [13]. Для дальнейшего изучения влияния источников цитокинина на размножение княженики in vitro выбрана концентрация 1,0 мг/л.
Некоторые исследователи отмечали положительный эффект при совместном использовании в питательной среде на этапе микроразмножения двух источников цитокинина [14]. В ходе опыта установлены существенные различия по высоте, числу микропобегов и коэффициенту размножения княженики, при использовании различных цитокининов и их сочетаний (табл.).
Влияние различных цитокининов и их сочетаний
на биометрические показатели эксплантов княженики
|
Источник цитокинина* |
Высота микропобегов, мм |
Число микропобегов, шт. |
Коэффициент размножения |
|
6-БАП |
19,44±0,83а |
2,56±0,73e |
11,11±2,91g |
|
ТДЗ |
14,16±1,07с |
2,70±0,38e |
12,63±1,63fg |
|
мТ |
18,06±0,97ab |
2,12±0,34e |
10,29±0,69g |
|
6-БАП+мТ |
18,05±0,73ab |
2,00±0,28e |
10,80±1,14g |
|
6-БАП+ТДЗ |
13,33±1,67c |
4,33±0,88d |
14,33±0,84f |
|
мТ+ТДЗ |
15,85±0,90bc |
3,11±0,45de |
12,33±1,64fg |
*Концентрация каждого регулятора роста в варианте – 1,0 мг/л. Различными буквами обозначены варианты, имеющие значимые различия по критерию Дункана при p < 0,05.
Однофакторный дисперсионный анализ показал существенные различия по биометрическим показателям эксплантов княженики при использовании различных источников цитокинина в составе питательной среды. При культивировании на питательной среде, содержащей 1,0 мг/л 6-БАП совместно с 1,0 мг/л ТДЗ, выявлено наибольшее число микропобегов (4,33 ± 0,88 шт.) и максимальный коэффициент размножения (14,33 ± 0,84). Стоит отметить снижение высоты микропобегов при культивировании на питательных средах с добавлением ТДЗ, высота микрокропобегов варьировала в пределах от 13,33 до 14,6 мм. Схожие результаты были получены Н.В. Соловых при культивировании малины душистой: ТДЗ способствовал снижению высоты микропобегов [15]. Применение мТ при клональном микроразмножении княженики оказался малоэффективен, но может быть применен совместно с другими цитокининами, так как способствовал увеличению высоты микропобегов.
Этап укоренения важен для последующего культивирования регенерантов в условиях ex vitro. Двухфакторный дисперсионный анализ показал достоверное влияние генотипа и источника ауксина на укореняемость микропобегов различных сортов княженики. Сорта княженики различались по способности к корнеобразованию (рис. 2).
Наибольшим процентом укоренившихся микропобегов характеризовался сорт Sofia (77 %), минимальным – сорта Beata и Anna (62 и 65 % соответственно). Сорт Astra занимал промежуточное значение – 72 %.
В нашем исследовании укореняемость микропобегов княженики зависела от применяемого ауксина и его концентрации (рис. 3).
Рис. 2. Влияние генотипа на укореняемость микропобегов княженики (различными буквами
обозначены варианты, имеющие значимые различия по критерию Дункана при p < 0,05)
Рис. 3. Влияние концентрации регуляторов роста на укореняемость княженики in vitro
(различными буквами обозначены варианты, имеющие значимые различия
по критерию Дункана при p < 0,05)
В исследовании установлены существенные различия по укореняемости микропобегов княженики на питательных средах с 0,3 мг/л и 0,5 мг/л ИУК. В свою очередь, укореняемость эксплантов при использовании 0,3 и 0,5 мг/л ИМК статистически не различалась. Максимальная укореняемость микропобегов отмечена при культивировании микропобегов на питательной среде с 0,5 мг/л ИУК (82 %). Культивирование сортов княженики на питательных средах с добавлением ИМК в различных концентрациях не оказало значительного влияния на образование корней у микропобегов: укореняемость составила 56–61 %. Таким образом, использование 0,5 мг/л ИУК для укоренения сортов княженики повышает эффективность метода клонального микроразмножения.
Заключение. В ходе исследования был оптимизирован протокол культивирования in vitro сортов Rubus arcticus. На этапе собственно микроразмножения оптимально использование питательной среды, сочетающей 6-БАП и ТДЗ в концентрациях 1,0 мг/л.
Укореняемость сортов княженики зависит от генотипа и концентрации регулятора роста в питательной среде. Наибольшим процентом укоренившихся микропобегов характеризовался сорт Sofia, оптимальным ауксином на этапе укоренения является ИУК в концентрации 0,5 мг/л.
1. Hellqvist S. Establishment of hybrid arctic bramble under field conditions // Acta Agriculturae Scandinavica, Section B-Plant Soil Science. 2000. Vol. 50 (3). P. 169–175.
2. Kallio H. Development of volatile aroma compounds in arctic bramble, Rubus arcticus L. // Journal of Food Science. 1976. Vol. 41. P. 563–566.
3. Rastitel'nye resursy Rossii: Dikorastuschie cvetkovye rasteniya, ih komponentnyj sostav i biologicheskaya aktivnost'. Semejstva Actinidiaceae – Malvaceae Euphorbiaceae – Haloragaceae / pod red. A.L. Budanceva. SPb.; M.: KMK, 2009. T. 2. 513 s.
4. Sinel'nikova N.V., Pahomov M.N. Knyazhenika (Rubus arcticus L.) v doline reki Kolyma – sezonnoe razvitie i plodonoshenie // Vestnik KrasGAU. 2023. №. 4. S. 100–105.
5. Yacyna, A.A., Koncevaya I.I. Razmnozhenie i introdukciya polyaniki (Rubus arcticus L.) v Belarusi // Plodovodstvo. 2004. T. 15. S. 207–211.
6. Poluchenie gaploidnyh rastenij Rubus arcticus L. metodom kul'tury mikrospor in vitro / D.N. Zontikov [i dr.] // Sel'skohozyajstvennaya biologiya. 2020. T. 55, № 1. S. 128–136.
7. Gudovskih Yu.V., Egorova N.Yu., Egoshina T.L. Costoyanie cenopopulyacij Rubus arcticus (Rosaceae) v Kirovskoj oblasti // Botanicheskij zhurnal. 2020. T. 105, № 8. S. 779–793.
8. Primenenie biotehnologicheskih metodov dlya sohraneniya genofonda redkih vidov rastenij / O.I. Molkanova [i dr.] // Botanicheskij zhurnal. 2020. T. 105, № 6. S. 610–619.
9. Kokko H. I., Kivineva M., Kärenlampi S.O. Single-step immunocapture RT-PCR in the detection of raspberry bushy dwarf virus // Biotechniques. 1996. Vol. 20(5) P. 842–846.
10. Zontikov D.N., Zontikova S.A., Malahova K.V. Vliyanie rH pitatel'noj sredy na rost i razvitie nekotoryh sortov Vaccinium angustifolium L. i Rubus arcticus L. pri klonal'nom mikrorazmnozhenii // Trudy Sankt-Peterburgskogo nauchno-issledovatel'skogo instituta lesnogo hozyajstva. 2022. № 4. S. 31–41.
11. Makarov S.S., Kuznecova I.B. Korneobrazovanie in vitro i adaptaciya ex vitro knyazheniki arkticheskoj pri klonal'nom mikrorazmnozhenii // Izvestiya Orenbur. gos. agrar. un-ta. 2018. № 6 (74). S. 52–55.
12. Osobennosti regeneracii perspektivnyh sortov Actinidia arguta v kul'ture in vitro / D.A. Semenova [i dr.] // Tavricheskij vestnik agrarnoj nauki. 2023. № 1 (33). S. 93–103.
13. Zontikov D.N., Zontikova S.A., Malahova K.V. Vliyanie sostava pitatel'nyh sred i regulyatorov rosta pri klonal'nom mikrorazmnozhenii nekotoryh hozyajstvenno cennyh predstavitelej roda Rubus L. // Agrohimiya. 2021. № 6. S. 36–42.
14. B`yadovskij I.A. Vliyanie razlichnyh koncentracij 6-benzilaminopurina i tidiazurona na ko`efficient razmnozheniya klonovyh podvoev yabloni i grushi v kul'ture in vitro // Plodovodstvo i yagodovodstvo Rossii. 2013. T. 37, № 1. S. 52–56.
15. Solovyh N.V. Klonal'noe razmnozhenie in vitro maliny dushistoj // Mezhdunarodnyj zhurnal gumanitarnyh i estestvennyh nauk. 2023. № 8-2 (83). S. 22–26.
