The purpose of the study is to assess the prospects of using fatty acid amides as antiprotozoal agents in comparison with known drugs. The paper presents the results of experimental research on the study of the protistocidal action of cationic surfactants synthesized in the laboratory by our creative team of amides of myristic and oleic acids and known in the world on the market of antiprotozoal drugs: trichopolum (metronidazole), toltrazuril, antimalarial drug chloroquine (delagil) and antibiotic bicillin 5. The protistocidal activity of substances was determined in a liquid nutrient medium by the method of serial dilutions according to our method, repeatedly presented in high-ranking literary sources. The test culture for the study was protozoans (ciliates) of the Colpoda steinii species. As a result of the study, it was noted that at a concentration of amidamiristic acid solution of 4.63 μg/ml and higher, the death of protozoa occurred almost immediately (within 1–2 minutes), the minimum protistocidal concentration oleic acid amide for colpods was 9.25 µg/ml at 2 min exposure; chloroquine protistocidal activity appeared after 1 h 30 min at a concentration of 15.63 µg/ml, and after 18 h exposure kolpods died at a concentration of 1.95 µg/ml. The minimum level of protistocidal activity of the reference drug toltrazuril is 22.5 μg/ml at an exposure of 19.5 hours, Trichopolum (metronidazole) and antibiotic bicillin 5 – 250 μg/ml at an exposure of 18 hours and 19 hours, respectively. These results show that myristic amide and oleic acid amide synthesized by us make it possible to use lower concentrations of solutions with a minimum exposure for parasitocidal action in comparison with known protistocidal preparations.
myristic acid amide, oleic acid amide, protistocidal activity, antiprotozoal agents
Введение. Антипротозойные средства (от лат. Protozoa – простейшие) необходимы для подавления жизнедеятельности простейших, их применяют для лечения и профилактики многих протозойных инфекций [1]. Действие антипротозойных средств либо приводит к задержке роста простейших (паразитостатическое действие), либо вызывает их гибель (паразитоцидное действие). Разница между этими формами воздействия на простейших зависит от свойств применяемого препарата, его концентрации, способа введения, условий среды, вида и фазы развития простейших, формы инфекционного процесса и пр.
К антипротозойным средствам относятся представители различных классов химических соединений: противомалярийные препараты – производные хинолина (плазмоцид, хингамин, хиноцид, галохин и др.), акридина (акрихин, аминоакрихин), бигуанида (бигумаль), пиримидина (хлоридин) и др.; противотрихомонадные препараты группы имидазола (метронидазол); ряд алкалоидов растительного происхождения (хинин, эметин, лютенурин); органические соединения мышьяка (осарсол, новарсенол) и сурьмы (солюсурмин); антибиотики (препараты группы тетрациклина), фитонциды и др.
В работе А.А. Дельцова с соавторами (2021) [2] представлен анализ ассортимента ветеринарных противопаразитарных лекарственных средств, зарегистрированных на территории Российской Федерации и применяемых для профилактики и лечения протозоозов. Среднегодовая регистрация производится всего на 5 противопротозойных препаратов в год. По состоянию на 07.08.2021 в Государственный реестр ЛС для ветеринарного применения внесено 54 противопротозойных препарата. Наиболее распространенное действующее вещество, входящее в их состав, – толтразурил, который мы использовали в качестве препарата сравнения (содержится в 12 ТН (торговых наименованиях) – 22,2 %). Российская Федерация является лидером в сфере производства и разработки противопротозойных препаратов, зарегистрированных на ее территории. Установлено, что большинство исследованных препаратов производится в твердых лекарственных формах, эффективных для лечения кокцидиозов у животных и птиц. Для лечения рыб при протозоозах необходимы жидкие лекарственные формы препаратов. Разработка препаратов данной формы ведется в лабораторных условиях творческого коллектива «Химический синтез новых лекарственных соединений» СКЗНИВИ – филиала ФГБНУ ФРАНЦ.
Применение изученных нами ранее в качестве антипрозозойных средств амидов миристиновой и олеиновой кислот на рыбах вида Гуппи (лат. Poecilia reticulata) для профилактических (формалин, аммиак, мышьяковистые препараты и т.д.) и лечебных мер показало, что амиды жирных кислот менее токсичны по сравнению с высокотоксичными препаратами, предлагаемыми различными учеными [7]. Защитное действие амидов жирных кислот (миристиновой и олеиновой) позволяет проводить успешное лечение пресноводных рыб и минимизирует вероятность их гибели от тяжелых протозойных инвазий при соблюдении необходимых концентраций и времени воздействия на рыб. В результате применения антипротозойных препаратов улучшается здоровье рыб, повышается их адаптация к стрессовым условиям выращивания, следовательно, повышается их выживаемость [3, 4].
Цель исследования – оценить перспективность использования амидов жирных кислот в качестве антипротозойных средств в сравнении с известными препаратами.
Материалы и методы. В исследовании были использованы синтезированные в СКЗНИВИ – филиале ФГБНУ ФРАНЦ нашим творческим коллективом новые соединения миристиновой кислоты N- (3-диметиламино-пропиламид) (рис. 1) и олеиновой кислоты N- (3-диметиламинопропиламид) (рис. 2) в виде гидрохлоридов, у которых были обнаружены антибактериальные и протистоцидные свойства.
В соответствии с правилами ИЮПАК («Номенклатурные правила по химии») амид миристиновой кислоты имеет название:
AutoNom Name: Tetradecanoic acid (3-dimethylamino-propyl)-amide
Рис. 1. Структурная формула N- (3-диметиламино-пропиламид)
миристиновой кислоты (n = 12)
Рис. 2. Структурная формула N-(3-диметиламинопропиламид) олеиновой кислоты (n = 14)
В соответствии с правилами ИЮПАК («Номенклатурные правила по химии») амид олеиновой кислоты имеет название:
AutoNom Name: Octadec-9-enoic acid (3-dimethylamino-propyl)-amide
Данные соединения являются катионными поверхностно-активными веществами ряда амидов жирных кислот. Синтезированные соединения обладают выраженной антипротозойной активностью в отношении Colpoda steinii. Для сравнения были взяты противомикробные и противопротозойные препараты известных производителей: трихопол (метронидазол), толтразурил (АДВ кокцидиостатика байкокса), противомалярийный препарат хлорохин (делагил) и антибиотик бициллин 5 (по мнению аквариумистов [5, 6], помимо антибактериального действия, проявляет активность в отношении инфузорий и жгутиконосцев).
Протистоцидную активность веществ определяли в жидкой питательной среде методом серийных разведений по нашей методике (2012 г.) [7, 8]. Тест-культурой для исследования являлись простейшие (инфузории) вида Сolpoda steinii. Руководствуясь требованием экспериментальной химиотерапии об определении дозы, дающей максимально возможный эффект, применяли учет эффективности только по альтернативной форме реакции: протистоцидной считали минимальную концентрацию, при которой погибали все особи простейших.
Результаты и их обсуждение. Для изучения антипротозойной активности провели оценку и сравнение протистоцидной активности водных растворов с различным содержанием амида миристиновой кислоты в отношении простейших вида Colpoda steinii (ресничные). В таблице 1 представлены результаты определения минимальной концентрации амида миристиновой кислоты, вызывающей максимальный эффект – гибель всех простейших.
Таблица 1
Результаты изучения протистоцидной активности водного раствора гидрохлорида
амида миристиновой кислоты в отношении простейших вида Colpoda steinii
|
Экспозиция, мин |
Концентрация раствора амида миристиновой кислоты, мкг/мл |
||||||
|
9,25 |
4,63 |
2,31 |
1,16 |
0,58 |
0,29 |
0,14 |
|
|
2 |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
|
3 |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
|
5 |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
|
10 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
|
15 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
|
20 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
30 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
|
40 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
Здесь и далее: «+» – простейшие погибли; «–» – простейшие живы.
При концентрации раствора амида миристиновой кислоты 4,63 мкг/мл и выше гибель простейших наступала практически сразу (в течение 1–2 мин). В то же время концентрация 0,14 мкг/мл оказывает протистоцидное действие на простейших вида Colpoda steinii при экспозиции 40 мин.
В таблице 2 представлены результаты по определению ингибирующей концентрации водных растворов амида олеиновой кислоты для простейших.
Установлено, что минимальная протистоцидная концентрация амида олеиновой кислоты для колпод составляет 9,25 мкг/мл при экспозиции 2 мин; 2,31 мкг/мл при экспозиции 3 ч и 0,58 мкг/мл при экспозиции 18 ч. Таким образом, при увеличении срока воздействия растворов амидов жирных кислот для проявления протистоцидного эффекта требуется меньшее их количество. Это обстоятельство может оказаться важным при практическом использовании амидов жирных кислот при протозоозах рыб.
Результаты определения губительной концентрации препарата сравнения хлорохина для простейших вида Сolpoda steinii представлены в таблице 3.
Таблица 2
Результаты изучения протистоцидной активности водного раствора гидрохлорида
амида олеиновой кислоты в отношении простейших вида Colpoda steinii
|
Экспозиция |
Концентрация раствора амида олеиновой кислоты, мкг/мл |
||||||||||||
|
151,25 |
75,63 |
37,5 |
18,5 |
9,25 |
4,63 |
2,31 |
1,16 |
0,58 |
0,29 |
0,14 |
0,08 |
0,04 |
|
|
2 мин |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
3 мин |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
5 мин |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
10 мин |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
15 мин |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
20 мин |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
30 мин |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
1 ч |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
2 ч |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
3 ч |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
4,5 ч |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
6 ч |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
18 ч |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
Таблица 3
Результаты изучения протистоцидной активности препарата сравнения хлорохина
в отношении простейших вида Colpoda steinii
|
Экспозиция |
Концентрация раствора хлорохина, мкг/мл |
||||||
|
15,63 |
7,81 |
3,91 |
1,95 |
0,98 |
0,49 |
0,24 |
|
|
2 мин |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
5 мин |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
10 мин |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
15 мин |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
30 мин |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
1 ч |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
2 ч |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
1 ч 30 мин |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
18 ч |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
Протистоцидная активность хлорохина проявилась по истечении 1 ч 30 мин при концентрации 15,63 мкг/мл, а при экспозиции 18 ч гибель колпод наступила при концентрации 1,95 мкг/мл.
Результаты, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что минимальный уровень протистоцидной активности препарата сравнения толтразурила (АДВ некоторых кокцидиостатиков) составляет 22,5 мкг/мл при экспозиции 19,5 ч.
Таблица 4
Результаты изучения протистоцидной активности препарата сравнения толтразурила
в отношении простейших вида Colpoda steinii
|
Экспозиция |
Концентрация раствора толтразурила, мкг/мл |
|||||||||||
|
12500 |
6250 |
3125 |
1565 |
750,3 |
375 |
180 |
90 |
45 |
22,5 |
11,25 |
6,125 |
|
|
19,5 ч |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
|
|
2,25 |
1,121 |
0,56 |
0,28 |
0,14 |
0,07 |
0,035 |
|
|
|
|
|
|
19,5 ч |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
|
|
|
|
В таблицах 5 и 6 представлены результаты определения минимального уровня протистоцидной активности препаратов сравнения трихопола (метронидазола) и антибиотика бициллина 5 (соответственно) в отношении колпод, который составляет 250 мкг/мл при экспозиции 18 и 19 ч. Сравнительные результаты протистоцидной активности изученных соединений представлены в таблице 7.
Таблица 5
Результаты изучения протистоцидной активности препарата сравнения
трихопола (метронидазола) в отношении простейших вида Colpoda steinii
|
Экспозиция |
Концентрация раствора трихопола (метронидазола), мкг/мл |
|||||||||||
|
500 |
250 |
125 |
62,5 |
31,25 |
15,63 |
7,81 |
3,91 |
1,95 |
0,98 |
0,49 |
0,24 |
|
|
5 мин |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
10 мин |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
30 мин |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
18 ч |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
Таблица 6
Результаты определения уровня протистоцидной активности препарата сравнения
бициллина 5 в отношении простейших вида Colpoda steinii
|
Экспозиция |
Концентрация раствора бициллина 5, мкг/мл |
|||||||||||
|
500 |
250 |
125 |
62,5 |
31,25 |
15,625 |
7,81 |
3,91 |
1,95 |
0,98 |
0,49 |
0,244 |
|
|
19 ч |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
Таблица 7
Протистоцидная активность новых катионных ПАВ ряда амидов
жирных кислот и известных препаратов
|
Соединения |
Протистоцидная активность, мкг/мл |
Экспозиция, при которой наступает протистоцидный эффект |
|
1 |
2 |
3 |
|
Метронидазол (трихопол) |
250 |
18 ч |
|
Бициллин 5 |
250 |
18 ч |
|
Толтразурил |
22,5 |
19,5 ч |
|
Хлорохин (делагил) |
15,63 |
1 ч 30 мин |
|
1,95 |
18 ч |
Окончание табл. 7
|
1 |
2 |
3 |
|
Катионное ПАВ – амид олеиновой кислоты |
9,25 |
2 мин |
|
2,31 |
3 ч |
|
|
0,58 |
18 ч |
|
|
Катионное ПАВ – амид миристиновой кислоты |
4,63 |
2 мин |
|
2,31 |
3 мин |
|
|
1,16 |
5 мин |
|
|
0,58 |
10 мин |
|
|
0,14 |
40 мин |
Из данных таблицы 7 видно, что исследованные соединения обладают в той или иной мере антипротозойной активностью. Водные растворы трихопола и бициллина 5 обладают незначительной ингибирующей активностью в отнощении инфузорий. Более заметной активностью обладают толтразурил и хлорохин. Наиболее выраженное антипротозойное действие наблюдалось у водных растворов амидов жирных кислот. Уровень протистоцидной активности амида олеиновой кислоты превышает уровень активности толразурила (22,5 : 0,58) в 38,8 раза; уровень активности хлорохина (1,95 : 0,58) в 3,36 раза при близких по величине экспозициях (18–19,5 ч). Протистоцидная активность амида миристиновой кислоты значительно выше активности препаратов сравнения: толтразурила (22,5 : 0,4) в 160 раз; хлорохина (1,95 : 0,14) в 13,9 раза, при более короткой экспозиции (40 мин).
Заключение. Выявлено, что амид миристиновой и амид олеиновой кислоты позволяют использовать более низкие концентрации растворов с минимальной экспозицией для паразитоцидного действия в сравнении с известными препаратами, такими как трихопол (метронидазол), толтразурил, хлорохин и антибиотик бициллин 5, которые мы изучили в качестве препаратов сравнения на протистоцидную активность.
1. Patent na izobretenie RU 2535138 C1. Sposob lecheniya kokcidioza pticy / Zubenko A.A., Fetisov L.N., Vasilenko V.N., Bodryakov A.N., Klimenko A.I., Soldatenko N.A. № 2013129149/15; zayavl. 25.06.2013, opubl. 10.12.2014.
2. Del'cov A.A., Kosova I.V., Rod'kina O.R. Analiz assortimenta protivoprotozoynyh lekarstvennyh sredstv dlya veterinarnogo primeneniya // Veterinariya, zootehniya i biotehnologiya. 2021. № 10. S. 47–54.
3. Skrining protistocidnoy aktivnosti novyh veschestv iz ryada amidov zhirnyh kislot / M.A. Bodryakova [i dr.] // Izvestiya Orenburgskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2014. № 6 (50). S. 83–85.
4. Toksichnost' kationo-aktivnogo soedineniya amida miristinovoy kisloty dlya akvariumnyh ryb / V.V. Chekrysheva [i dr.] // Izvestiya Nizhnevolzhskogo agrouniversitetskogo kompleksa: Nauka i vysshee professional'noe obrazovanie. 2021. № 3(63). S. 254–262. DOI:https://doi.org/10.32786/2071-9485-2021-03-26.
5. URL: https://fanfishka.ru/akvariumnye-stati/820-bicillin-dlya-ryb-i-akvariuma.html.
6. URL: http://www.biotopimage.ru/lechenie-rybok/ bicillin-5.html.
7. Izyskanie protistocidnyh sredstv / L.N. Fetisov [i dr.] // Voprosy normativno-pravovogo regulirovaniya v veterinarii. 2012. № 4/1. S. 70–73.
8. Ektoparazity, naibolee opasnye dlya ryb v usloviyah prudovyh hozyaystv Belarusi, novye preparaty dlya bor'by s nimi / E.K. Skurat [i dr.] // Voprosy rybnogo hozyaystva Belarusi. Minsk, 2011. Vyp. 27. S. 11.
