Russian Federation
Russian Federation
Russian Federation
The aim of the study is to test the antibiotic activity of representatives of the Bacillaceae family against the mycelial fungus Rhizopus stolonifer Vuillemin (1902). The strains of Bacillus altitudinis, Bacillus atrophaeus, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Peribacillus simplex and Bacillus sp. were used, isolated by the authors from agricultural soils of the Krasnoyarsk Region and in previous studies showing antagonism against phytopathogenic fungi Fusarium spp., Alternaria spp., Sclerotinia sclerotiorum, Geotrichum candidum, as well as against seed mold pathogens of the genus Aspergillus, Penicillium and Mucor. The antibiotic activity of the studied strains against R. stolonifer was assessed in Petri dishes using the counter culture method. The area of the R. stolonifer colony in the presence of the antagonist strain as a percentage of the control variant (without the antagonist) after 10 days of incubation at a temperature of (25 ± 1) °C was used as an indicator of antibiotic activity. Of the 21 tested strains, 4 did not exhibit antagonism towards R. stolonifer; 16 strains showed weak or moderate antibiotic activity (reduction in the area of fungal colonies by 29.1–79.1 % relative to the control); 1 strain showed high antibiotic activity (reduction in the area of R. stolonifer colonies by 92 % relative to the control). No relationship was found between the antibiotic activity of the studied strains towards R. stolonifer and the taxonomically close zygomycete Mucor sp. (Spearman's rank correlation coefficient Rs = 0.272, statistically insignificant). Based on the results of the studies, the B. atrophaeus RSA9 strain can be proposed as an agent for the biological method of controlling R. stolonifer.
Rhizopus stolonifer, biological method, antagonist bacteria, Bacillaceae family, Bacillus atrophaeus
Введение. Мицелиальный гриб Rhizopus stolonifer Vuillemin (1902), относящийся к семейству Mucoraceae (порядок Mucorales, отдел Zygomycota), является одним из наиболее вредоносных и распространенных возбудителей гнилей плодоовощной продукции. Его вредоносность обусловлена широкой распространенностью данного гриба практически во всех наземных экосистемах, а также способностью формировать столоны, обеспечивающие очень быструю колонизацию субстратов [1–3]. Гриб также известен как возбудитель плесневения семян, существенно ухудшающих их посевные качества [4–7]. В первые десятилетия XXI века R. stolonifer получил распространение в качестве возбудителя текучей гнили земляники садовой Fragaria × ananassa (Duchesne ex Weston) Duchesne ex Rozier (1785), поражающий плоды непосредственно на растениях еще до их созревания. Болезнь актуальна для всех производящих землянику регионов, при этом потери урожая могут достигать 50–90 % [8, 9]. В качестве одного из наиболее перспективных методов борьбы с R. stolonifer в настоящее время рассматривается биологический метод, основанный на использовании микроорганизмов-антагонистов R. stolonifer либо их метаболитов [3, 10–13].
Цель исследования – проверка антибиотической активности представителей семейства Bacillaceae в отношении мицелиального гриба Rhizopus stolonifer Vuillemin (1902).
Объекты и методы. Объектами исследования были штаммы Bacillus altitudinis, B. Atrophaeus, B. cereus, B. megaterium, B. simplex, B. subtilis, Peribacillus simplex и Bacillus sp. (в общей сложности 21 штамм), выделенные авторами из сельскохозяйственных почв Красноярского края и ризосферы сельскохозяйственных растений (табл. 1). В предыдущих исследованиях данные штаммы продемонстрировали высокую антибиотическую активность в отношении широкого спектра возбудителей грибных болезней сельскохозяйственных растений, а также в отношении возбудителей плесневения семян р.р. Aspergillus, Penicillium и Mucor.
Таблица 1
Список изучаемых штаммов
List of studied strains
|
Штамм |
Таксономическая принадлежность |
Метод идентификации |
|
RSA2 |
Bacillus altitudinis |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
CX6 |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA1 |
Bacillus atrophaeus |
По нуклеотидной последовательности гена 16SpРНК |
|
RSA16(1) |
Bacillus atrophaeus |
По нуклеотидной последовательности гена 16SpРНК |
|
RSA16(2) |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA18 |
Bacillus atrophaeus |
По нуклеотидной последовательности гена 16SpРНК |
|
RSA19 |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA8 |
Bacillus atrophaeus |
По нуклеотидной последовательности гена 16SpРНК |
|
RSA9 |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
АЛ3 |
Bacillus cereus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA17 |
Bacillus cereus group / Bacillus subtilis |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA4 |
Bacillus megaterium |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA15 |
Bacillus simplex |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
Pa1 |
Bacillus sp. |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
Pa2 |
Bacillus sp. |
Культурально-морфологический |
|
Pa3 |
Bacillus sp. |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
Ал4 |
Bacillus sp. |
Культурально-морфологический |
|
RSA20(1) |
Bacillus subtilis |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA20(2) |
Bacillus subtilis |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA11 |
Bacillus subtilis / Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA12 |
Peribacillus simplex |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
Оценку антибиотической активности изучаемых штаммов в отношении R. stolonifer проводили в чашках Петри методом встречных культур [14]. В качестве показателя антибиотической активности использовали площадь колонии R. stolonifer в присутствии штамма-антагониста в % от контрольного варианта (без антагониста) после 10 сут инкубирования при температуре (25 ± 1) °C. Измерения площади проводили по фотографиям чашек Петри с помощью программы ImageJ; повторность трехкратная.
Статистическую значимость различий между штаммами по антибиотической активности в отношении R. stolonifer проверяли дисперсионным анализом. Связь антибиотической активности изучаемых штаммов с их активностью в отношении родственного R. stolonifer гриба Mucor sp., также относящегося к сем. Mucoraceae, проверяли ранговым коэффициентом корреляции Спирмена. В качестве программного обеспечения использовали пакет StatSoft STATISTICA 8.0.
Результаты и их обсуждение. Влияние изучаемых штаммов на рост R. stolonifer варьировало от полного отсутствия антагонизма до почти полного подавления роста гриба. В ряде случаев после первоначального подавления роста R. stolonifer впоследствии возобновлял свой рост в присутствии бактериального штамма (рис. 1).
Наибольший антагонистический эффект в отношении R. stolonifer проявил штамм RSA9 (рис. 2).
Рис. 1. Примеры воздействия изучаемых штаммов на R. stolonifer:
1 – контроль; 2 – отсутствие антагонизма со стороны изучаемого штамма; 3 – подавление роста R. stolonifer с последующим возобновлением его роста; 4 – практически полное
подавление роста R. stolonifer без возобновления его роста
Examples of the effects of the studied strains on R. stolonifer: 1 – control; 2 – absence of antagonism from the studied strain; 3 – suppression of the growth of R. stolonifer followed by the resumption of its growth; 4 – almost complete suppression of the growth of R. stolonifer without the resumption of its growth
Рис. 2. Площадь колоний R. stolonifer в присутствии изучаемых штаммов, % к контролю
The area of colonies of R. stolonifer in the presence of the studied strains, % of the control
Дисперсионный анализ подтвердил статистическую значимость различий между изучаемыми штаммами по влиянию на R. stolonifer на уровне p < 0,001 (табл. 2).
Не выявлено связи между антибиотическим действием изучаемых штаммов в отношении R. stolonifer и в отношении Mucor sp. (рис. 3). Коэффициент ранговой корреляции Спирмена Rs = 0,272, статистически незначим.
Наибольшую антибиотическую активность в отношении R. stolonifer продемонстрировал штамм RSA9, в присутствии которого площадь колонии гриба составила лишь 8 % от контроля (см. рис. 1, 2).
Таблица 2
Результаты дисперсионного анализа различий между штаммами
по антагонистической активности в отношении R. stolonifer
Results of a variance analysis of differences between strains in antagonistic
activity against R. stolonifer
|
Источник варьирования |
Показатель силы влияния, % |
Статистическая значимость эффекта, p |
|
Все штаммы |
||
|
Штамм |
99,72 |
0,000000 |
|
Ошибка |
0,28 |
|
|
Только штаммы, проявившие антагонизм |
||
|
Штамм |
99,35 |
0,000000 |
|
Ошибка |
0,65 |
|
Рис. 3. Результаты сопоставления антибиотической активности изучаемых штаммов
в отношении R. stolonifer и в отношении Mucor sp.; числа по осям показывают ранг штамма
по антибиотической активности в отношении соответствующего гриба; минимальному
значению ранга соответствует максимальная антибиотическая активность
The results of comparing the antibiotic activity of the studied strains against R. stolonifer and against Mucor sp.; the numbers along the axes show the strain's rank in terms of antibiotic activity against
the corresponding fungus; the minimum value of the rank corresponds to the maximum antibiotic activity
Штамм RSA9 представлен подвижными палочковидными клетками, способными к образованию спор (эндоспор). В молодой культуре размер клеток 102,4–253,3 × 13,9–17,0 мкм, склонны к образованию цепочек. В зрелой культуре клетки 25,0–83,6 × 11,4–17,0 мкм, одиночные и в парах. Эндоспоры овальные, 16,8–26,4 × 9,6–12,9 мкм, образуются субтерминально; при образовании эндоспоры форма клетки не меняется. Прорастание эндоспоры латеральное (рис. 4).
Рис. 4. Штамм RSA9: 1 – прорастание споры (С – спора, В – вегетативная клетка,
прорастающая спора показана стрелкой); 2 – клетки в молодой культуре;
3 – клетки в зрелой культуре; 4 – спорулирующие клетки (показаны стрелкой)
Strain RSA9: 1 – spore germination (C – spore, B – vegetative cell, spore germination is shown
by arrow); 2 – cells in young culture; 3 – cells in mature culture; 4 – sporulating cells (shown by arrow)
Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии штамм идентифицирован как представитель вида Bacillus atrophaeus (см. табл. 1). Следует отметить, что другие штаммы того же вида проявили существенно более слабый антагонизм в отношении R. stolonifer. Площадь колоний гриба в присутствии этих штаммов варьировала от 20,9 % (штамм RSA1) до 62,4 % (RSA16(2) ) от контрольного варианта (см. рис. 2), статистическая значимость различий между штаммами B. atrophaeus по антибиотической активности в отношении R. stolonifer составила p < 0,001.
Заключение. Из 21 штамма сем. Bacillaceae, продемонстрировавших в предыдущих исследованиях антагонизм в отношении фитопатогенных грибов Fusarium spp., Alternaria spp., Sclerotinia sclerotiorum, Geotrichum candidum, а также в отношении возбудителей плесневения семян р.р. Aspergillus, Penicillium и Mucor, лишь 1 штамм (RSA9, идентифицированный как представитель вида B. atrophaeus) показал высокую антибиотическую активность в отношении гриба R. stolonifer. Это проявилось в снижении площади колонии R. stolonifer в присутствии данного штамма на 92 % относительно контрольного варианта. Еще 16 штаммов показали слабую либо умеренную антибиотическую активность (снижение площади колоний гриба на 29,1–79,1 %), 4 штамма не показали антибиотической активности в отношении R. stolonifer. Не выявлено корреляции между антибиотической активностью изучаемых штаммов в отношении R. stolonifer и таксономически близкого представителя р. Mucor. Полученные результаты говорят о том, что для поиска бактерий-антагонистов, активных в отношении R. stolonifer, необходимо дополнительное тестирование штаммов даже в том случае, если они проявили антибиотическую активность в отношении близкородственных зигомицетов. В качестве практической рекомендации штамм B. atrophaeus RSA9 можно предложить в качестве агента для биологического метода борьбы с R. stolonifer.
1. Baggio JS, Hau B, Amorim L. Spatiotemporal analyses of rhizopus rot progress in peach fruit inoculated with Rhizopus stolonifer. Plant Pathology. 2017;66(9):1452-1462. https://doi.org/10.1111/ ppa.12691.
2. Feliziani E, Romanazzi G. Postharvest Decay of Strawberry Fruit: Etiology, Epidemiology, and Disease Management. Journal of Berry Research. 2016;6(1):47-63. https://doi.org/10.3233/JBR-150113.
3. Liu Q, Chen Q, Liu H, et al. Rhizopus stolonifer and related control strategies in postharvest fruit: A review. Heliyon. 2024;10(8). URL: https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e29522.
4. Abdel-Mallek AY. Seed-borne fungi of five cruciferous vegetables and relative efficacy of aqueous seed extracts against some associated fungi. Folia microbiologica. 1995;40:493-498. https://doi.org/https://doi.org/10.1007/BF02814730.
5. Anwar SA, Riaz S, Ahmad CA, et al. Mycoflora associated with stored seeds of soybean. Mycopathologia. 2013;11(2):85-90.
6. Adongo BA, Kwoseh CK, Moses E. Storage rot fungi and seed-borne pathogens of onion // Journal of Science and Technology (Ghana). 2015;35(2):13-21. https://doi.org/10.4314/just.v35i2.2.
7. Khatun A, Shamsi S. Interrelationship Among Seed Quality Parameters and Fungi Associated with Seeds of Cotton (Gossypium Hirsutum L.). Bioresearch Communications-(BRC). 2022;8(1):1061-1067. https://doi.org/10.3329/brc.v8i1.57045 EDN: https://elibrary.ru/WRPUFG.
8. Holod NA. Diseases of strawberries in the south of Russia. Zashchita i karantin rastenij. 2013;(10);28-30. (In Rus.). EDN: https://elibrary.ru/RCJTNT.
9. Lin CP, Tsai N, Ann PJ, et al. First report of rhizopus rot of straw-berry fruit caused by Rhizopus stolonifer in Taiwan. Plant Disease. 2017;101(1):254-255. https://doi.org/10.1094/PDIS-07-16-1033-PDN.
10. Qing F, Shiping T. Postharvest biological control of Rhizopus rot of nectarine fruits by Pichia membranefaciens. Plant disease. 2000;84(11):1212-1216. https://doi.org/10.1094/PDIS.2000.84.11.1212.
11. Bonaterra A, Mari M, Casalini L, et al. Biological control of Monilinia laxa and Rhizopus stolonifer in postharvest of stone fruit by Pantoea agglomerans EPS125 and putative mechanisms of antagonism. International journal of food microbiology. 2003;84(1):93-104. https://doi.org/10.1016/S0168-1605(02) 00403-8.
12. Chávez-Díaza IF, Angoa-Péreza V, López-Díaza S, et al. Antagonistic bacteria with potential for biocontrol on Rhizopus stolonifer obtained from blackberry fruits. Fruits. 2014;69(1):41-46. https://doi.org/10.1051/fruits/2013101.
13. El Arbi B, El Idrissi SBS, Issam MK, et al. Screening of Actinomycete Bacteria Producing Antifungal Metabolites which Could be Used in Biological Control Against a Phytopathogenic Fungus (Rhizopus Stolonifer). American Journal of Biology and Life Sciences. 2014;2(4):84-89.
14. Kim WG, Weon HY, Seok SJ, et al. In vitro antagonistic characteristics of bacilli isolates against Trichoderma spp. and three species of mushrooms. Mycobiology. 2008;36(4):266-269. https://doi.org/10.4489/MYCO.2008.36.4.266.
