Russian Federation
employee
The paper presents scientific approaches to solving a global problem, namely the increasing antibiotic resistance among opportunistic and weakly pathogenic microorganisms, which pose a significant risk both in human medicine and in animal husbandry. In this regard, phenotypic, analytical and molecular methodo-logical methods for determining and studying the antibiotic resistance of microorganisms are presented. Of the phenotypic methods, the method of standard disks and the method of serial dilutions, which are based on the diffusion of antibacterial drugs from the carrier onto a solid nutrient medium and inhibition of the growth of the studied culture of the microorganism, have received wide application. Among the analytical methods for detecting antibiotic resistance, electrophoretic, immunochemical (immunochromatography), UV and mass spectrometry are distinguished. The most promising and effective is mass spectrometry, in particular the MALDI-TOF test, which is the most optimal for routine determination of the sensitivity of a number of cultures of microorganisms. The molecular approach, namely the use of PCR using molecular beacons and DNA genes, expands the possibility of monitoring the resistance of microorganisms, and makes it possible to determine the mechanism of formation of resistance to antibacterial drugs by the presence of resistance genes. The analysis of methodological approaches made it possible to identify the following determinants of resistance: carbapenemase in Enterobacterales spp, P. aeruginosa and Acineto-bacter; Extended-spectrum B-lactamases in Enterobacterales; mcr-mediated encoded resistance to poly-myxins in gram-negative microorganisms; mecA/mecC, mediated resistance to beta-lactams in S.aureus; and vanA/vanB, mediated resistance to glycopeptides in E. faecium and E. faecalis. An analysis of the data of available scientific publications allows us to state that different methodological approaches provide different accuracy in indicating variants of resistance determinants. It should be noted that the presence of several databases of antibiotic resistance genes makes it difficult to use them to determine the phenotype of drug sensitivity. However, the use of genomic data to determine antibiotic resistance is crucial for the development of clinical metagenomics.
microorganisms, phenotype, genotype, antibiotics, resistance determinants, molecular genetic methods, mass spectrometry, monitoring.
Введение. В последние три десятилетия исследователи в разных странах отмечают значительное изменение эпизоотологии инфекционных болезней животных, содержащихся в условиях промышленного животноводства и птицеводства [1–4]. Появляются вновь возникающие или эмерджентные инфекции, а известные ранее условно патогенные и слабопатогенные микроорганизмы изменяют свои основные фенотипические свойства, приобретая новые признаки, в том числе увеличивающие их резистентность к антибиотическим препаратам [5–12].
Возникновение и формирование антибиотикорезистентности у микроорганизмов в настоящее время рассматривается в глобальном плане как значительный фактор риска для здоровья человека и животных [12]. Так, в РФ для разработки мер противодействия антибиотикорезистентных микроорганизмов распоряжением Правительства РФ от 25.09.2017 г. № 2045 утверждена «Стратегия предупреждения распространения антимикробной резистентности на период до 2030 г.».
Необходимо отметить, что чувствительность/резистентность к антибиотикам большинством исследователей рассматриваются как объективные параметры генотипических и фенотипических особенностей изучаемого микроорганизма [13–16].
Исходя из вышесказанного, главной целью оценки резистентности микроорганизмов к антибиотическим препаратам является прогнозирование их адекватности и эффективности при терапии больных животных и человека [3, 7, 13, 14, 17–19]. Кроме того, определение чувствительности бактерий проводят для эпизоотологического и эпидемиологического мониторинга за распространением резистентности среди микроорганизмов, а также для изучения антимикробного действия новых препаратов.
Цель исследования – провести аналитический обзор научной литературы для выявления перспективных направлений определения резистентности микроорганизмов к антибиотическим препаратам.
Материалы и методы. Материалом для исследования послужили научные статьи, представленные в базах, научные данные elibrary.ru, научной библиотеки «КиберЛеника», реферативной базы «Scopus», базы данных PubMed, а также отечественных журналов ветеринарного профиля. Методический подход к изложению материала статьи базировался на анализе, синтезе и обобщении имеющихся научных публикаций.
Результаты и их обсуждение. Установлено, что, исходя из анализа массива научных публикаций, методические подходы для детекции антибиотикорезистентности микроорганизмов можно разделить на три относительно самостоятельные группы, а именно: фенотипические, аналитические и генотипические (молекулярные) [11, 20].
Необходимо отметить, что фенотипические подходы более экономичны и просты, но их выполнение занимает больше времени. Кроме того, некоторые из них, в частности (Ходж-тест), характеризуются большой вероятностью ошибки [11].
Наиболее часто используемыми в ветеринарной науке и практике фенотипическими методами исследования являются:
-метод стандартных дисков, или диффузии антимикробных препаратов в агар Кирби-Байер;
-метод серийных разведений.
В настоящее время самым популярным считается диско-диффузный метод в связи с его дешевизной и простотой выполнения. Иногда в микробиологической практике используют Е-тест. Диско-диффузный метод и Е-тест основаны на диффузии антибактериальных препаратов (АБП) из носителя в плотную питательную среду и ингибировании роста исследуемой культуры микроорганизма в иной зоне, где концентрация антибактериальных препаратов превосходит минимальную подавляющую концентрацию [12].
Е-тест представлен узкой полоской (0,5–6,0 см) полимера, на поверхность которой нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). Появление роста культур микроорганизмов вокруг полоски Е-теста регистрируется только в той зоне, где концентрация АБП выше МПК, при этом наблюдается каплевидная зона ингибиции [4, 21, 22].
Необходимо отметить, что в большинстве случаев рутинные фенотипические методы дают возможность осуществлять эффективную и комплексную оценку резистентности/чувствительности микроорганизмов к антибиотическим препаратам [11, 15].
В то же время в частных случаях стандартные методы детекции чувствительности к антибиотикам могут быть недостаточно эффективны для выявления некоторых механизмов и детерминант устойчивости микроорганизмов по причине вариабельности их фенотипического проявления in vitro или являются трудоемким и длительным процессом, а также связаны с мутационной устойчивостью ряда микроорганизмов, в частности патогенных микоплазм [17, 21, 23–25].
Аналитические методы выявления антибиотикорезистентности микроорганизмов можно разделить на три группы 1) электрофоретические; 2) иммунохимические (иммунохроматография); 3) УФ и масс-спектрометрия.
Некоторые исследователи отмечают, что наиболее перспективными и эффективными необходимо считать методы, основанные на феномене определения масс-спектрометрии, в частности тест MALDI-TOF [15, 26, 27].
Так, выявление гидролиза карбапенемов с помощью MALDI-TOF основано на индикации снижения амплитуды или исчезновения пиков, характерных для карбапенемов, в масс-спектре бактериальной суспензии, предварительно инкубированной в присутствии карбапенема с помощью масс-спектрометра (MALDI-TOF).
Некоторые авторы, в частности M. Vargha et al. (2006), считают, что тест MALDI-TOF является наиболее оптимальным методом для рутинного определения чувствительности некоторых культур микроорганизмов к антимикробным препаратам. Так, А.А.Самойлова и др. (2020) указывают, что MALDI-TOF масс-спектрометрия представляет собой уникальный высокоэффективный, верифицированный и вместе с тем низкозатратный метод для определения резистентности микробных патогенов к антибиотикам.
Анализ литературы показал, что в настоящее время многие ветеринарные лаборатории начинают активно использовать молекулярные методы диагностики, которые позволяют по наличию генов резистентности определить механизм формирования резистентности к антибактериальным препаратам, что позволяет оптимизировать тактику и стратегию антибиотикотерапии [3, 24, 28].
Необходимо отметить, что в настоящее время для осуществления эффективного контроля с целью обеспечения рационального применения антибиотиков в гуманитарной и ветеринарной медицине ВОЗ разработал критерии мониторинга следующих детерминант резистентности микроорганизмов:
-выявление прибретенных карбапенемаз у Enterobacterales spp, P. aeruginosa и Acinetobacter;
-мониторинг В-лактамаз расширенного спектра у Enterobacterales;
-выявление mcr-опосредованной (-плазмидо-кодируемой устойчивости к полимиксинам у грамотрицательных микроорганизмов);
-установление mecA/mecC – опосредованной резистентности к беталактамам у S.aureus;
-выявление vanA/vanB – опосредованной устойчивости к гликопептидам.
Необходимо отметить, что карбапенемазы – очень разнородная группа ферментов, продуцируемая бактериями. Выработка карбапенемаз является наиболее значимым эпизоотологическим механизмом устойчивости к карбапенемам у грам (-) бактерий [9, 12].
Проведенный анализ отечественной и зарубежной литературы показал, что основные методы выявления карбапенемаз можно разделить на 4 группы.
- Определение чувствительности к карбапенемам и их комбинациям с различными ингибиторами («двойные», «комбинированные» диски или определение МПК в присутствии ингибиторов). Ряд авторов отмечают, что указанные методы имеют ограниченное использование, что связано с необходимостью использования различных ингибиторов.
- Иммунохроматографические методы, которые вызывают продуцирование наиболее распространенных типов карбапенемаз у микробных культур.
- Группа методов оценки in vitro гидролиза карбапенемов с участием индикаторного штамма (СJM, eCJM, mCJM) MALDI-TOF масс-спектрометрии, pH-индикаторов (Carba-NP тест и др.), флюорогенных карбапенемов.
- Методы амплификации нуклеиновых кислот (MAНК) и секвенирования.
Некоторые исследователи, в частности
K. Safain et al. (2016), указывают, что применение селективных и хроматогенных сред дает возможность осуществить оценочный мониторинг культур энтеробактерий с предполагаемой продукцией карбапенемаз, но в то же время не является специфическим методом выявления их продукции. Кроме того, ряд авторов отмечают, что многие неферментирующие бактерии (Pseudomonas, Acinetobacter и др.) способны культивироваться на собственных средах для выявления карбапенемазопродуцирующих энтеробактерий [11, 12, 20].
В литературе имеются публикации, указывающие, что при использовании метода амплификации нуклеиновых кислот необходимо учитывать данные распространенности различных типов карбапенемаз, которые сильно отличаются для различных видов бактерий [10, 13, 19, 29].
Необходимо отметить, что анализ публикаций отечественных и зарубежных авторов позволил сделать некоторые обобщения, касающиеся выявления B-лактамаз расширенного спектра (ESBL)-фермента, гидролизующие пенициллины, цефалоспорины, но не гидролизующего цефамицины и карбапенемы. Ряд авторов, в частности E. Zankari et al. (2012), отмечают, что продукция ESBL встречается у большинства значимых видов энтеробактерий [30]. На основании данных ряда публикаций, в частности P. Ruegg et al. (2015), методы выявления B-лактамаз расширенного спектра можно разделить на группы.
- Методы определения чувствительности к оксиминобеталактамам и их комбинациям с клавулановой кислотой.
- Методы оценки in vitro гидролиза оксиминобеталактамов с использованием индикаторного штамма MALDI-TOF масс-спектрометрия.
- Иммунохроматографические методы, которые позволяют выявить продукцию ESBL у наиболее распространенных микробных изолятов.
Известно, что гены mcr участвуют в кодировании фосфоэтанолоамин-трансферазы, осуществляющей модификацию липида А-главного структурного компонента липополисахарида и вызывающей устойчивость к полимиксинам. По данным некоторых авторов, в частности K. Safain et al. (2016), распространенность плазмидных mcr среди клинических штаммов варьирует в разных странах и регионах.
Основные, наиболее часто используемые методы выявления mcr можно разделить на 3 группы.
- Методы амплификации нуклеиновых кислот и методы секвенирования.
- Иммунохроматографические методы, которые позволяют выявлять экспрессию mcr-1 у микробных культур.
- Методы определения резистентности к полимиксинам в присутсвии цинк-хелатинирующих ингибиторов mcr.
По данным некоторых исследователей, другие методические подходы, используемые для ускоренной диагностики резистентности к полимиксинам, в частности рост на селективных средах, а также в присутствии липида А посредством MALDI-TOF масс-спектрометрии, в подавляющем большинстве случаев не являются специфичными для mcr [10, 11, 20].
Рядом авторов установлено, что ген mecA кодирует дополнительный пенициллинсвязывающий белок с низкой активностью к беталактамам [9, 19]. Показано, что, кроме mecA, культуры S.aureus, проявляющие фенотип метициллинрезистентности, изолированные от животных, могут нести ген mecC, кодирующий альтернативный вариант пенициллинсвязывающего белка [24, 28]. Кроме того, некоторые исследователи сообщают, что гены mecA входят в состав генетических структур, известных как стафилококковые хромосомные кассеты mec (SCC mec), и в большинстве случаев ассоциированы с генами резистентности к другим антибиотическим препаратам [12, 15].
В целом, анализируя имеющиеся научные публикации, можно выделить 3 основных метода выявления mecA/mecC – опосредованной резистентности.
- Установление МПК оксацилина или цефокстина, а также скрининг чувствительности к цефокстину с использованием DDM.
- Метод амплификации нуклеиновых кислот и метод секвенирования.
- Латексная агглютинация, которая дает возможность выявить mecC микробных изолятов, выделенных в чистой культуре.
Установлено, что гены vanA и vanB являются главными детерминантами резистентности к гликопептидам (ванкомицину) у культур E.faecium и реже у E.faecalis. Указанные структуры входят в состав мобильных генетических групп, которые кодируют синтез измененных мишеней, а именно пептидных остатков (-D-аланил-D-лактам) с низкой превалентностью связывания ванкомицина [11, 15, 26, 27].
Индикацию vanA/vanB – опосредованной резистентности можно разделить на 2 метода.
1. Определение минимальной подавляющей концентрации ванкомицина.
2. Метод амплификации нуклеиновых кислот и метод секвенирования.
Необходимо отметить, что на территории РФ резистентность к ванкомицину в большинстве случаев встречается у нозокомиальных культур E.faecium [5, 22].
Обобщая данные доступных научных публикаций, можно констатировать, что различные методические подходы обеспечивают разную точность указания вариантов детерминант резистентности. Так, например, ПЦР, как правило, позволяет выявить ген и установить его принадлежность к определенной группе, в то же время методы секвенирования дают возможность определить точный вариант гена. Кроме того, полногеномное секвенирование бактериальных штаммов в настоящее время стало предпочтительным методом для идентификации детерминант устойчивости к антибиотикам. Необходимо отметить, что было выпущено несколько баз данных генов устойчивости к антибиотикам. В то же время на сегодняшний день нет единого мнения о том, какую базу данных следует использовать для определения фенотипа чувствительности к антибиотикам на основе данных полногеномного секвенирования [7, 18, 31].
Однако, несмотря на имеющиеся проблемы, использование данных геномики для определения чувствительности к антибиотикам имеет решающее значение для развития клинической метагеномики.
Заключение. Таким образом, необходимо отметить, что методические подходы, основанные на анализе нуклеиновых кислот для выявления устойчивости микроорганизмов, могут иметь определенное преимущество перед фенотипическими анализами. В то же время молекулярные методы исследования для выявления резистентности имеют ряд ограничений, в частности, количество различных генов делает создание теста слишком дорогостоящим, чтобы конкурировать с фенотипическим методом исследования. Необходимо учитывать, что надлежащий контроль качества молекулярных тестов представляет собой определенную проблему для многих лабораторий, что приводит в лучшем случае к получению сомнительных результатов. В этом плане новое методологическое направление, а именно применение ПЦР с использованием молекулярных маяков и ДНК генов, расширяет возможность мониторинга резистентности. Хотя молекулярные методы обнаружения устойчивости к противомикробным препаратам явно завоевывают себе место в рутинной диагностике, фенотипические методы по-прежнему являются методом выбора для большинства определений резистентности [7, 15–17, 21, 23, 24, 26].
Кроме того, проведенный анализ научной литературы показал, что разработка и практическое использование методических подходов к определению устойчивости микроорганизмов к антибиотическим препаратам является важной задачей современной ветеринарной науки и практики.
1. Fenotip antibiotikorezistentnosti i molekulyarno-geneticheskie harakteristiki uslovno-patogennyh mikroorganizmov – vozbuditeley infekcionnyh processov / N.A. Gorodinskaya [i dr.] // Mat-ly IV Nacional'nogo kongressa bakteriologov. Kazan'. 2021. 29 c.
2. Efimenko T.A., Terehova O.V., Efremenkova O.V. Sovremennoe sostoyanie problemy anti-biotikorezistentnosti patogennyh bakteriy // Antibiotiki i himioterapiya. 2019. № 64 (5-6). S. 64–68.
3. Zabrovskaya A.V. Chuvstvitel'nost' k antimikrobnym preparatam mikroorganizmov, vydelen-nyh ot sel'skohozyaystvennyh zhivotnyh i iz produkcii zhivotnovodstva // J. Vetphrma. 2012. № 5. P. 143–148.
4. Antibiotikorezistentnost' klinicheskih izolyatov Escherichia coli, vydelennyh ot zhivotnyh / M.N. Isakova [i dr.] // Veterinariya segodnya. 2022. № 11 (7). S. 14–19.
5. Monitoring antibiotikorezistentnosti kak ob'ektivnyy diagnosticheskiy i epidemiologiche-skiy kriteriy infekcionnogo processa / S.S. Afanas'ev [i dr.] // Immunologiya, allergolo-giya, infektologiya. 2014. № 4. S. 61–69.
6. Geneticheskie markery ustoychivosti i antibiotikorezistentnost' bakteriy gruppy Strepto-coccus spp. i Staphylococcus spp., izolirovannyh iz razlichnyh biotopov ob'ektov zhivotno-vodstva / N.A. Bezborodova [i dr.] // Trudy Kubanskogo gos. agrarnogo universiteta. 2022. № 54. S 195–202.
7. Sidorenko S.V. Klinicheskoe znachenie rezistentnosti mikroorganizmov k antimikrobnym preparatam // Rossiyskie medicinskie vesti. 1998. № 1. S. 28–34.
8. Solomka V.S. Izuchenie fenotipicheskih i genotipicheskih shtammov N. gonorrhoeae v Rossiy-skoy Federacii // Voprosy kongressa dermatologov i kosmetologov. Kazan', 2013. S. 51–52.
9. Chebotar' I.V. Genotipy i nositel'stvo genov β-laktamaz u karbopenemorezistentnyh shtammov Acinetobacter baumannii, vydelennyh v Moskve // Antibiotiki i himioterapiya. 2017. № 622 (11-12). S. 29–34.
10. Do Nascimento V., Day M. R., Danmith M. et al. Comparison of phenotypic and WGS-derived an-timicrobial resistance profiles of enteroaggredative Escherichia coli isolated from cases of diarrhoeal disease in England, 2015-16. J. Antimicrob Chemolther 2017; 72: 288–3297.
11. Rusenova N., Vasilev N., Rusenov A. et al. Comparison between Some Phenotypic and Genotypic Methods for Assessment of Antimicrobial Resistance rend of Bovine Mastitis Staphylococcus aure-us Jsolates from Bulgaria. Vet Sci, 2022, Jul 31: (8) 401. doi : 10.3390 / vets ci 9080401.
12. Ruegg P., Oliveira L., Jin W. et al. Phenotypic antimicrobial suscephibility from Wisconsin dairy cows. J. dairy Sci. 2015, 98: 4521–4534. doi: 10.3168 / jds. 2014-9137.
13. Botle J., Zheng L., Wente N., et al. Comparison of phenotypic and genotypic antimicrobial re-sistance patterns associated with Staphylococcus aureus mastitis in German and Danish dairy cows. J. Dairy Sci, 2020 Apr; 103 (4) 3554-3564. Doi: 10. 3168/ jds. 20 19-17765. Epub 2020 Feb 20.
14. Yslam S., Aldstadt J., Aga D. Global antimicrobial resistance: a complex and dire threat with few definite answers. Tropical Med Ynt Healtb. 2019: 24 (6) : 658–662.
15. Safain K., Bhuyan C., Hasib S., et al. Genotypic and Phenotypic profiles of antibiotic – resistant bacteria isolated from hospitalized patients in Bangladesh Tropical Medicine and Ynternational Health V. 26 № 07 pp – 720-729, 2021. doi :10.1111 / tmi. 13584.
16. Vargha M., Takats Z., Koroka A. et al. Optimization of MALDJ – TOFMS for strain level differentia-tion of Arthrobacter isolates // J. Microbiol Methods, 2006, Vol. 66. p 399–409.
17. Antonova A.N., Lenchenko E.M. Sravnitel'naya ocenka effektivnosti sposobov izucheniya an-tibiotikorezistentnosti mikroorganizmov // Veterinariya i kormlenie. 2015. № 8. S. 34–37.
18. PCR-detekciya geneticheskih markerov antibiotikorezistentnosti mikroorganizmov, vyde-lennyh iz moloka bol'nyh mastitom korov / O.V. Sokolova [i dr.] // Veterinariya Kubani. 2018. № 2. S. 15–17.
19. Chen M., Li J., Cu W. et al. Molecular mechanism of Staphylococcus xylosus resistance against tylosin and flor fenicol. Ynf. Drug Resist. 2022 Oct 26; 15 : 6165-617. doi :10.2147 / JDR. S 379264.
20. Jhe European Umon summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animas and food in 2014. EFSA J, 2016: 14 (2).
21. Vozmozhnost' ispol'zovaniya disko-diffuzionnogo metoda dlya ocenki chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antibiotikam v veterinarii / B.V. Violin [i dr.] //. Veterinarnyy vrach. 2013. № 6. S. 22–26.
22. Rasprostranenie genov kompleksa Immune evasion cluster i drugih faktorov virulentnosti u Staphylococcus aureus / V.V. Gostev [i dr.] //Antibiotiki i himioterapiya. 2013. № 15 (4). S. 280–285.
23. Sovremennye podhody k kontrolyu i sderzhivaniyu antibiotikorezistentnosti v mire / I.R. Kulmagambetov [i dr.] // Mezhdunarod. Zhurnal prikladnyh i funkcional'nyh issledova-niy. 2015. 9 (Ch.1). S. 54–59.
24. Makavchik S.A., Bocharova D.V., Krotova A.L. Laboratornyy kontrol' ustoychivosti ente-robakteriy, izolirovannyh ot zhivotnyh i ptic k β-laktamam // Veterinarnyy farmakologi-cheskiy vestnik. 2022. № 4 (21). S. 119–124.
25. Muzyka V.P. Ocenka antimikrobnoy chuvstvitel'nosti mikroorganizmov kak odin iz kriteri-ev analiza riska razvitiya antibiotikorezistentnosti // Veterinarnyy vrach. 2013. № 6. S. 16–18.
26. Popov D.A. Sravnitel'naya harakteristika sovremennyh metodov opredeleniya produkcii karbapenemaz // KMAH. 2019. № 21 (2). S. 125–133.
27. Samoylova A.A., Lihachev I.V., Kraeva L.A. Opredelenie chuvstvitel'nosti k antimikrobnym preparatam mikroorganizmov roda Klebsiella metodom MALDJ – TOFMS // Bakteriologiya. 2020. № 5 (3). S. 813.
28. Mehanizmy rezistentnosti k antimikrobnym preparatam u mikroorganizmov, vydelennyh ot krupnogo rogatogo skota / S.A. Makavchik [i dr.] // Voprosy normativno-pravovogo regulirova-niya v veterinarii. 2020. № 4. S 41–46.
29. Ahmad M., Khan A. Global economic impact of antibiotic resistance : Areview. J Global Antimi-crobial Resistance. 2019. 19: 313–316.
30. Zankari E., Hasman H. et al. Ydentifiction of acguired antimicrobial resistance genes J. Antimicrob Chemother, 2012, 67: 2640–2644.
31. Ocenka riska poyavleniya rezistentnosti k antibiotikam uslovno-patogennoy i patogennoy mikroflory, vydelyaemoy iz produktov zhivotnogo proishozhdeniya / A.M. Mendybaeva [i dr.] // Vestnik KrasGAU. 2022. № 2. S. 147–149.
