The purpose of the study is to identify effective types and forms of application of antagonist microorganisms to prevent the development of characteristic diseases that cause spoilage of zucchini, for their further use in the development of biological control technologies. Tasks: to study the composition of the phyllosphere and phytopathogenic microorganisms on it, causing diseases of zucchini; to establish the properties of antagonist microorganisms of B. subtilis strain IPM 215, B. subtilis strain M-22 VIZR, Trichoderma harzianum strain G 30 VIZR in relation to the causative agents of characteristic bacterial and fungal diseases of zucchini – Alternaria radicina, Fusarium culmorum and Pectobacterium carotovora. The objects of the study are zucchini Marsella F1, CA7585, Dasha F1, Nevira F1, Yasna F1, Donya Perfecta F1, grown in 2022 in the Krasnodar Region (Temryuksky District, IP Erokhin); antagonist microorganisms B. subtilis strain IPM 215, B. subtilis strain M-22 VIZR, Trichoderma harzianum strain G 30 VIZR; the mold fungi Alternaria radicina and Fusarium culmorum and the bacterium Pectobacterium carotovora. It has been established that the treatment with culture fluid (CL) of B. subtilis strain IPM 215 of forcibly infected squash discs reduces the damage by an average of 15–35 % compared with control samples; treatment of QOL with B. subtilis strain M-22 VIZR by 25–65 %; treatment of QOL Trichoderma harzianum strain G 30 VIZR – by 65–80 %. It can be argued that the use of CL of mold cells Tr. harzianum strain G 30 VIZR is promising for further research on the storage of various vegetables.
biotechnology, microflora, zucchini, storage, antagonistic activity, microbial spoilage
Введение. По данным продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН – Food and Agriculture Organization (FAO), потери, связанные с заболеваниями и снижением качества сельскохозяйственной продукции в процессе хранения, составляют 30–40 %. Согласно данным за 2021 г., экономические потери от заболеваний продукции растениеводства превышают 220 млрд долларов США в год [1]. Опасность заболеваний сельскохозяйственных культур выражается не только в гибели растений или потерях урожая, но и в снижении его качества из-за загрязнения сельскохозяйственной продукции токсинами бактериального и грибного происхождения.
Кабачки – популярная овощная культура, отличающаяся ранним формированием урожая, ценными диетическими свойствами при высокой урожайности и являющаяся неотъемлемой составляющей рационов питания населения Российской Федерации. Кроме того, кабачки в значительных количествах используются в перерабатывающей промышленности.
Потери выращенных кабачков на стадиях их сортирования, транспортирования, хранения и реализации составляют в среднем 35–40 %.
Причиной потерь чаще всего является микробиологическая порча, для предотвращения которой необходимо учитывать ряд факторов: адаптацию возбудителей микробиологических заболеваний к традиционным средствам защиты, увеличение их активности, расширение видовой структуры и ареала; различный характер взаимодействия штаммов-продуцентов биологических препаратов и патогенных микроорганизмов в зависимости от вида растительного объекта в процессе хранения; снижение адаптивного потенциала объектов хранения к воздействию патогенных микроорганизмов филлосферы [2].
В связи с этим актуально исследование процессов развития и взаимодействия штаммов-продуцентов известных биологических препаратов и патогенных микроорганизмов (бактериальной и грибковой природы), обеспечивающих снижение потерь от микробиологической порчи овощей для совершенствования существующих и разработки новых технологий хранения.
Цель исследования – выявление эффективных видов и форм применения микроорганизмов-антагонистов для предотвращения развития характерных заболеваний, вызывающих порчу кабачков, для их дальнейшего применения при разработке технологий биологического контроля.
Задачи: сравнить обсемененность филлосферы кабачков различных сортов, выращенных в Темрюкском районе Краснодарского края, характерными группами патогенной микрофлоры; установить свойства известных микроорганизмов-антагонистов B. subtilis штамм ИПМ 215, B. subtilis штамм М-22 ВИЗР, Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР по отношению к распространенным фитопатогенам.
Объекты и методы. Объектами исследования являлись кабачки Марселла F1, СА7585, Даша F1, Невира F1, Ясна F1, Донья Перфекта F1, выращенные в 2022 г. в Краснодарском крае (Темрюкский район, ИП Ерохин); микроорганизмы-антагонисты B. subtilis штамм ИПМ 215, B. subtilis штамм М-22 ВИЗР, Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР; плесневые грибы Alternaria radicina и Fusarium culmorum и бактерия Pectobacterium carotovora.
Микробиологические исследования проводились в соответствии со стандартами [3–7] и по методикам, разработанным авторами. Фитопатологические исследования проводили с использованием методов визуальной диагностики, биометрии и микроскопии с помощью микроскопа Axioimager Z2.
При исследовании свойств микроорганизмов-антагонистов к возбудителям бактериальных и грибковых заболеваний кабачков в качестве тестовых микроорганизмов-антагонистов были подобраны культуры бактерий рода Bacillus и почвенного гриба рода Trichoderma: бактерии Bacillus subtilis штамм ИПМ 215 и штамм М-22 ВИЗР, гриб Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР [8–12].
Идентификация культур проводилась с помощью стандартных определителей и вспомогательной литературы [13–21].
Проверку антагонистических свойств выбранных культур проводили по отношению к основным установленным возбудителям бактериальных и грибковых заболеваний кабачков. Для предотвращения перезаселения плодов микроорганизмами-антагонистами был выбран способ обработки искусственно зараженных кабачков культуральной жидкостью (КЖ) исследуемых микроорганизмов-антагонистов.
Для проведения исследований микроорганизмы-антагонисты выращивались на жидкой питательной среде МПБ в течение 48 ч при температуре 27±1 °С, затем клетки микроорганизмов вместе с питательной средой центрифугировали в течение 10 мин при 5000 об/мин для их осаждения. Далее отбирали кабачки без видимых поражений, промывали водопроводной водой и нарезали ломтиками толщиной 5–7 мм; ломтики кабачков дважды промывали в этиловом спирте, затем в стерильной воде. В каждую стерильную чашку Петри на фильтровальную бумагу помещали ломтик кабачков. Для принудительного заражения использовали плесневые грибы Alternaria radicina и Fusarium culmorum и бактерию Pectobacterium carotovora. Культуральную жидкость микроорганизмов-антагонистов и суспензию микроорганизмов-патогенов вносили по 1 капле. Эксперимент проводился в трехкратной повторности. Контроль активности культур-антагонистов в отношении фитопатогенов производили через 7 и 14 дней хранения при температуре 23±2 °С, определяли поражение поверхности дисков кабачков.
Результаты и их обсуждение. Поскольку каждый из органов растений представляет особую эконишу по отношению к распространенным на нем микроорганизмам, определяли микрофлору с поверхности филлосферы, а именно с филлоплана (поверхности листьев) и карпосферы (поверхность плодов) [2]. Был проведен количественный подсчет и анализ состава микробных сообществ филлосферы кабачков (табл. 1).
Таблица 1
Сравнение обсемененности филлосферы кабачков различных сортов,
выращенных в Темрюкском районе Краснодарского края
|
Сорт |
Количество микроорганизмов, КОЕ/г |
|||||
|
Микроорганизмы филлоплана |
Микроорганизмы карпосферы |
|||||
|
МАФАнМ |
Дрожжи |
Плесени |
МАФАнМ |
Дрожжи |
Плесени |
|
|
СА7585 |
9·102 |
12·102 |
85·102 |
41·102 |
11·102 |
32·102 |
|
Даша F1 |
12·103 |
12·102 |
19·103 |
31·102 |
10·102 |
11·103 |
|
Невира F1 |
2·103 |
9·102 |
29·102 |
32·102 |
9·102 |
7·103 |
|
Ясна F1 |
5·102 |
9·102 |
54·102 |
27·102 |
10·102 |
27·102 |
|
Донья Перфекта F1 |
6·103 |
14·102 |
47·102 |
43·102 |
8·102 |
10·103 |
|
Марселла F1 |
15·103 |
22·102 |
20·103 |
59·102 |
12·102 |
13·103 |
На основании исследований было установлено, что сорта Даша F1, Невира F1, Донья Перфекта F1 и Марселла F1 в большей степени подвержены патогенным плесневым и бактериальным заболеваниям. У сортов Даша F1 и Марселла F1 плесневыми микроорганизмами поражаются и листья, и плоды, у сорта Невира F1 и Донья Перфекта F1 – плоды.
Сорта СА7585 и Ясна F1 подвержены плесневым и бактериальным заболеваниям в меньшей степени, листья при этом поражены в большей степени плесневыми микроорганизмами, плоды – бактериальными.
Можно также отметить, что сорт Ясна F1 был поражен фитопатогенными микроорганизмами меньше других, а сорт Марселла F1 оказался наиболее уязвимым к поражению патогенными микроорганизмами.
На исследуемых частях растений всех сортов обнаружено 2 постоянно присутствующих вида плесневых микроорганизмов – Alternaria radicina и Fusarium culmorum. Они известны как потенциальные производители микотоксинов, являющихся биологическими контаминантами (природными загрязнителями) [22–26].
Наиболее распространенный вид патогенной бактерии на всех исследуемых сортах – Peсtobacterium (Erwinia) carotovorum sub sp. (визуально проявляется в виде прозрачных пятен и потрескавшейся кожицы).
Для изучения влияния различных микроорганизмов-антагонистов на фитопатогены, вызывающие заболевания кабачков, использовались микроорганизмы-антагонисты: B. subtilis штамм ИПМ 215; B. subtilis штамм М-22 ВИЗР; Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР.
Известно, что штаммы-антагонисты образуют при культивировании зоны подавления роста и развития культур патогенов, выделяя в среду вещества, ингибирующие развитие конкурирующих с ними патогенов. Подавление роста обусловлено продуцированием антагонистами продуктов обмена в виде перекиси водорода, летучих кислот, эфиров, ферментов, антибиотиков, сидерофоров и других биологически активных соединений, действующих на биологические объекты, в частности на фитопатогены [27–32].
Проверку антагонистических свойств выбранных культур проводили на кабачках сорта Марселла F1 по отношению к основным возбудителям бактериальных (Pectobacterium carotovora) и грибковых (Alternaria radicina и Fusarium culmorum) заболеваний кабачков (табл. 2).
Диски кабачков, принудительно зараженные и обработанные КЖ микроорганизмов-антагонистов и без обработки, через 14 дней хранения при температуре 23 ± 2 °С представлены на рисунке 1.
Таблица 2
Активность культур-антагонистов в отношении фитопатогенов кабачков
|
Вариант опыта |
Поражение поверхности диска, % |
||
|
Срок хранения |
|||
|
Обработка КЖ антагонистов |
Инфицирование |
7 сут |
14 сут |
|
Контроль (без заражения) |
Контроль (без инфицирования) |
50,0 |
85,0 |
|
B.subtilis штамм ИПМ 215 |
Pectobacterium carotovora |
35,0 |
50,0 |
|
B.subtilis штамм ИПМ 215 |
Alternaria radicina |
45,0 |
70,0 |
|
B.subtilis штамм ИПМ 215 |
Fusarium culmorum |
40,0 |
70,0 |
|
B.subtilis штамм М-22 ВИЗР |
Pectobacterium carotovora |
12,0 |
20,0 |
|
B.subtilis штамм М-22 ВИЗР |
Alternaria radicina |
35,0 |
60,0 |
|
B.subtilis штамм М-22 ВИЗР |
Fusarium culmorum |
20,0 |
50,0 |
|
Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР |
Pectobacterium carotovora |
2,0 |
5,0 |
|
Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР |
Alternaria radicina |
10,0 |
20,0 |
|
Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР |
Fusarium culmorum |
2,0 |
10,0 |
Рис. 1. Активность культур-антагонистов в отношении фитопатогенов после 14 сут культивирования: А – контроль (без обработки КЖ микроорганизмов-антагонистов); В – обработка КЖ B. subtilis штамм ИПМ 215; С – обработка КЖ B. subtilis штамм М-22 ВИЗР; D – обработка КЖ Tr. harzianum штамм Г 30 ВИЗР; 1 – с инфицированием Pectobacterium carotovora;
2 – с инфицированием Fusarium culmorum; 3 – с инфицированием Alternaria radicina
Образцы кабачков, не обработанных КЖ, и пространство на фильтровальной бумаге вокруг них через 14 сут были поражены неидентифицированными бактериями и плесенями с мицелием серо-зеленого цвета в среднем на 85 % (рис. 1, А).
В результате исследований наилучшие результаты показала обработка дисков кабачков КЖ Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР по отношению ко всем исследуемым фитопатогенам грибковой (Alternaria radicina и Fusarium culmorum) и бактериальной природы (Pectobacterium carotovora).
Установленная эффективность биологического контроля фитопатогенов с использованием Trichoderma spp. обуславливается способностью триходермы к синтезу ряда вторичных метаболитов с высокой, установленной ранее проведенными исследованиями [33], антибиотической активностью (пептаиболы, поликетиды и терпены).
На образцах кабачков, обработанных КЖ B. subtilis штамм ИПМ 215, уже на четвертые сутки хранения развились признаки порчи (размягчение и побурение поверхности образцов). Можно утверждать, что обработка кабачков КЖ B. subtilis штамм ИПМ 215 для защиты кабачков от фитопатогенов при хранении не является целесообразной.
Бактерии B. subtilis штамм М-22 ВИЗР проявляют незначительный антагонистический эффект по отношению к Alternaria radicina (рис. 1, С-3).
Заключение. Изучен состав филлосферы кабачков, выращенных в мае-июле 2022 г. в хозяйстве ИП «Ерохин Александр Александрович» (Темрюкский район, Краснодарский край). Установлено, что у разных сортов кабачков состав филосферы изменяется мало. Отличия обнаруживаются в количественном соотношении между отдельными группами микроорганизмов, а не в их качественном составе. Характерными представителями микрофлоры кабачков, выращиваемых в Темрюкском районе Краснодарского края, являются бактерии родов Agrobacterium, Bacillus, Clavibacter, Pectobacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, дрожжи рода Zygosaccharomyces, плесневые грибы рода Colletotrichum и грибы Alternaria radicina и Fusarium culmorum.
Изучено взаимодействие B. subtilis штамм ИПМ 215, B. subtilis штамм М-22 ВИЗР; Tr. harzianum штамм Г 30 ВИЗР и патогенных микроорганизмов Alternaria radicina, Fusarium culmorum и Pectobacterium carotovora. Установлено, что обработка КЖ B. subtilis штамм ИПМ 215 принудительно зараженных кабачков позволяет снизить поражение в среднем на 15–35 % в сравнении с контрольными образами; обработка КЖ B. subtilis штамм М-22 ВИЗР – на 25–65 %; обработка КЖ Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР – на 65–80 %.
Таким образом, на основании проведенных исследований можно предположить эффективность использования культуральной жидкости клеток плесневых грибов Trichoderma harzianum штамм Г 30 ВИЗР для дальнейших исследований по разработке технологий хранения овощей.
1. Food and Agriculture Organization of the United Nations. New standards to curb the global spread of plant pests and diseases. URL: https://www.fao.org/news/story/en/item/1187738/icode (data obrascheniya: 02.02.2023).
2. Erina N.V., Kopteva T.S. Mikrobnye soobschestva fillosfery nekotoryh rasteniy semeystva Grossulariaceae // Nauchnyy zhurnal KubGAU. 2015. № 110. S. 660–671.
3. GOST 31904-2012. Produkty pischevye. Metody otbora prob dlya mikrobiologicheskih ispytaniy. Vved. 01.07.2013. M.: Standartinform, 2014. 8 s.
4. GOST 10444.12-2013. Mikrobiologiya pischevyh produktov i kormov dlya zhivotnyh. Metody vyyavleniya i podscheta kolichestva drozhzhey i plesnevyh gribov. Vved. 01.07.2015. M.: Standartinform, 2014. 12 s.
5. GOST 10444.15-94. Produkty pischevye. Metody opredeleniya kolichestva mezofil'nyh aerobnyh i fakul'tativno-anaerobnyh mikroorganizmov. Vved. 01.01.1996. M.: Standartinform, 2010. 7 s.
6. GOST 26669-85. Produkty pischevye i vkusovye. Podgotovka prob dlya mikrobiologicheskih analizov. Vved. 01.07.1986. M.: Izd-vo standartov, 1986. 9 s.
7. GOST 26670-91. Produkty pischevye. Metody kul'tivirovaniya mikroorganizmov. Vved. 01.01.93. M.: Izdatel'stvo standartov, 1992. 8 s.
8. Sidorova T.M., Asaturova A.M., Khomyak A.I. Biologically active metabolites of Bacillus subtilis and their role in the control of phytopathogenic microorganisms // Agricultural Biology. 2018. V. 53. № 1. P. 29–37.
9. Prospects for the use of bacteria – producers of lipopeptides for plant protection (review) / I.V. Maksimov [et al.] // Applied Biochemistry and Microbiology. 2020. V. 56. № 1. P. 19–34.
10. Trichoderma: the “secrets” of a multitalented biocontrol agent / M. Sood [et al.] // Plants (Basel). 2020. V. 9. № 6. Article № 762.
11. Characterisation and antifungal activity of extracellular chitinase from a biocontrol fungus, Trichoderma asperellum PQ34 / N.H. Loc [et al.] // Mycology. 2019. V. 11. № 1. P. 38–48.
12. Changes in peptaibol production of Trichoderma species during in vitro antagonistic interactions with fungal plant pathogens / P.R. Tamandegani [et al.] // Biomolecules. 2020. V. 10. № 5. Article № 730.
13. Paul De Vos. Systematic Bacteriology / M. Garrity George [et al.] // Springer. 2009. Vol. 3. P. 1450.
14. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition / Editor-in-Chief: John G. Holt. Williams and Wilkins, Baltimore, MD. 2009. P. 1450.
15. Srivastava S. Understanding Bacteria / Springer Netherlands. 2014. P. 469.
16. Ivshina I.B., Krivoruchko A.V., Kuyukina M.S. Bioraznoobrazie i sistematika mikroorganizmov: ucheb. posobie / Perm. gos. nac. issled. un-t. Perm', 2019. 304 s.
17. The identification of fatty acids in bacteria / M.S. Da Costa [et al.] // Methods in Microbiology. 2011. Vol. 38. P. 183–196.
18. The all-species living tree project: a 16S rRNA-based phylogenetic tree of all sequenced type strains / P. Yarza [et al.] // Systematic and Applied Microbiology. 2008. Vol. 31. P. 241–250.
19. Zavarzin G.A. Fenotipicheskaya sistematika bakteriy. Prostranstvo logicheskih vozmozhnostey. M.: LENAND, 2018. 152 s.
20. Obobschennaya baza dannyh mikrobnyh genomov Ob'edinennogo instituta genoma. URL: https://img.jgi.doe.gov/cgi-bin/m/main.cgi (data obrascheniya: 01.03.2023).
21. Lukashov V.V. Molekulyarnaya evolyuciya i filogeneticheskiy analiz. M., 2009. 256 s.
22. Fungi of the genus Fusarium on wheat grain in Western Siberia / E.Yu. Toropova [et al.]. URL: https://glavagronom.ru/articles/griby-roda-fusarium-na-zerne-pshenicy-vzapadnoi-sibiri (data obrascheniya: 05.02.2023).
23. Monastyrsky O.A. Mycotoxins – a global problem of food and feed safety // Agrochemistry. 2016. № 6. P. 67–71.
24. Gagkaeva T.Yu., Gavrilova O.P., Orina A.S. Pervoe obnaruzhenie griba Fusarium globosum v mikrobiote zernovyh kul'tur na territorii Urala i Sibiri // Vestnik zaschity rasteniy. 2019. № 1 (99). S. 10–18.
25. Litovka Yu.A., Gromovykh Yu.I. Species composition and pathogenicity of fungi of the genus Fusarium on seedlings of coniferous species in forest nurseries of Central Siberia // Mycology and Phytopathology. 2008. V. 42. № 1. P. 35–42.
26. Allahverdyan V.V., Sidorova T.M., Asaturova A.M. Perspektivnye shtammy bakteriy roda Bacillus v zaschite rasteniy ot vozbuditeley fuzarioza i kontaminacii mikotoksinami // Yug Rossii: ekologiya, razvitie. 2022. № 2 (63). URL: https://cyberleninka.ru/article/n/perspektivnye-shtammy-bakteriy-roda-bacillus-v-zaschite-rasteniy-ot-vozbuditeley-fuzarioza-i-kontaminatsii-mikotoksinami (data obrascheniya: 01.03.2023).
