M.V. Lomonosov Northern (Arctic) Federal University
Moscow, Russian Federation
Russian Federation
Russian Federation
Arkhangelsk, Russian Federation
The purpose of research is to study the characteristics of adaptation of V. macrocarpon plants, varieties of foreign and Russian selection, obtained by the in vitro method, to non-sterile conditions using a peat substrate and using a hydroponic installation. The studies were carried out on the basis of Northern Federal University named after. M.V. Lomonosov and Surgut State University using generally accepted methods in 2021–2023. The objects of the study were plants of V. macrocarpon varieties of North American (Ben Lear, Piligrim) and Russian (Meryanka, Slavyanka) selection, obtained by the method of microclonal propagation. Adaptation of regenerated plants was carried out in a vertical ABS hydroponic installation (manufactured by Active Biological Systems LLC, Russia) in periodic flooding mode. 7, 14, 20, 30, 50 and 70 days after transplantation, the survival rate and morphometric indicators of plant growth (number and length of shoots, number of leaves, number and length of roots) were systematically recorded. The experiments were carried out in 3 replicates with 100 regenerated plants in each. The maximum survival rate of regenerated V. macrocarpon plants when adapted using a hydroponic installation (100 %) was noted on the 50–70th day of cultivation, on a peat substrate (75–80 %) – on the 70th day. The maximum values of morphometric parameters of V. macrocarpon plants on the 70th day of cultivation were noted when using a hydroponic installation (number of shoots – on average 4.1–5.1 pcs.; length of shoots – 24.9–30.2 cm; number of leaves – 84.0–95.4 pcs.; number of roots – 20.4–25.6 pcs.; root length – 21.3–26.1 cm), whereas when adapting to a peat substrate, the length of shoots was shorter on average 1.9–4.2 times, number of leaves – 1.2–1.7 times. Russian varieties had advantages in the number of shoots, number and length of roots compared to North American varieties.
large-fruited cranberry, microclonal propagation, variety, adaptation, ex vitro, substrate, peat, hydroponics, survival rate
Введение. Одним из наиболее распространенных, успешно культивируемых лесных ягодных видов является клюква крупноплодная (Vaccinium macrocarpon Ait.), в природных условиях встречающаяся только в северо-восточной части Северной Америки, в зоне хвойных лесов (преимущественно на сфагновых болотах лесной зоны, лесотундры и тундры). Это эндемичный вечнозеленый кустарничек с системой стелющихся (длиной до 1 м и более) и укороченных прямостоячих побегов. Листья овальные или продолговатые, более крупные, чем у клюквы болотной. Цветки белые или бледно-розовые, поникающие. Корни поверхностные, тонкие, с микоризой. Плоды и листья клюквы обладают высокой пищевой и лекарственной ценностью. Плоды содержат большое количество полезных биологически активных соединений. В медицине клюква может применяться при лечении большого ряда различных заболеваний как антисептическое, противовоспалительное, гипотензивное, противоцинготное, антисклеротическое, гемостатическое средство [1–6].
В природе V. macrocarpon лучше всего растет на открытых и слабо затененных местах, предпочитает очень влажные, кислые, торфянистые почвы. Однако V. macrocarpon является менее зимостойкой и более требовательной к теплообеспеченности вегетационного периода, чем распространенная в Европе и России клюква болотная (V. oxycoccos L.), но при этом более урожайна, менее подвержена угнетению сорными растениями и больше поддается механизированным способам уборки ягодного урожая. Эффективность культивирования клюквы в условиях выработанных торфяников и на других неиспользуемых землях подтверждается мировым опытом [1, 2, 7, 8].
Культивированием клюквы занимаются в США и Канаде со второй половины XIX в. На сегодняшний день плантации клюквы крупноплодной имеются и в ряде других стран: Чили, Нидерланды, Германия, Польша, Ирландия, Россия, Беларусь, страны Прибалтики. Выращивание высокопродуктивных сортов и гибридов клюквы способствует еще большему повышению урожайности плантаций. Если природно-климатические условия относительно теплых регионов России схожи с североамериканскими, то в северных регионах зарубежные сорта клюквы крупноплодной недостаточно устойчивы для выращивания [8, 9]. В результате многолетней селекционной работы на Центрально-европейской лесной опытной станции ВНИИЛМ были созданы первые отечественные зимостойкие сорта – Мерянка, Славянка, Волжанка.
Для более эффективного и ускоренного получения высококачественного оздоровленного и генетически однородного сортового посадочного материала ягодных растений в целях промышленного выращивания на плантациях целесообразно использовать метод микроклонального размножения [10]. При этом самым сложным этапом является адаптация растений к нестерильным условиям ex vitro. Одним из наиболее эффективных способов адаптации является выращивание с использованием системы гидропоники с применением искусственных субстратов различного происхождения. В числе основных преимуществ этого метода перед традиционными: круглогодичное получение растительного сырья независимо от климатических условий и сезона; возможность управления процессами роста и развития растений в течение всего вегетационного периода; возможность использования готовых долговечных гидропонных систем; отсутствие патогенной микрофлоры и вредителей; использование малых площадей для непрерывного культивирования; тщательный контроль качества готовой продукции и др. [11–13].
Цель исследования – изучение особенностей адаптации растений V. macrocarpon сортов зарубежной и российской селекции, полученных методом in vitro к нестерильным условиям с использованием торфяного субстрата и применением гидропонной установки.
Объекты и методы. В качестве объектов исследования рассматривали растения V. Macrocarpon сортов североамериканской (Ben Lear, Piligrim) и российской (Мерянка, Славянка) селекции, полученные методом микроклонального размножения [14]. Исследования по выращиванию растений в культуре in vitro и их адаптации к нестерильным условиям ex vitro проводили на базе САФУ им. М.В. Ломоносова и Сургутского государственного университета с использованием общепринятых методик [10, 15] в 2021–2023 гг.
Для адаптации укорененных in vitro растений с хорошо развитой корневой системой к нестерильным условиям с применением субстратов их вынимали пинцетом из пробирки и промывали корни в 1 % растворе перманганата калия. Далее растения пересаживали в кассеты (объемом 81,7 см3), заполненные предварительно пропаренным при температуре 90 °C торфом верхового типа. Затем проводили опрыскивание растений водой из пульверизатора, после чего надевали колпачки. При этом субстраты предварительно проливали 5 % раствором перманганата калия и оставляли в темном месте на 7 сут.
Адаптацию растений-регенерантов проводили в гидропонной установке вертикального типа ABS (производство ООО «Активные биологические системы», Россия) в режиме периодического затопления. Гидропонная установка представляет собой стеллаж (2,0 × 1,3 м) с двумя поддонами, крышками с отверстиями для горшочков (диаметром по 6 см), баком для питательного раствора (100 л), насосом, питающими и возвратными шлангами (для транспортировки питательного раствора). Преимущество системы затопления заключается в обеспечении хорошей оксигенации корней, когда отработанный воздух вытесняется из корневой зоны путем подъема уровня воды, а поступление нового свежего воздуха обеспечивается его понижением [12, 13].
Укоренившиеся в культуре in vitro растения вынимали из пробирки, промывали в бидистиллированной воде и растворе перманганата калия (рис. 1). После чего растения помещали в горшочки, на 1/3 объема заполненные стерильным керамзитом (размер фракции – 0,5–1,0 см) (рис. 2), и устанавливали их в лотки с прозрачными крышками для поддержания высокой влажности воздуха. Затем горшочки помещали на стеллаж, где они освещались светодиодными лампами белого спектра (световой поток – 8 тыс. лм, РРF – 165 мкмоль/с/м2, цветовая температура – 4 000 K), расположенными на высоте около 50 см до высаженных растений. Растения выращивали при 16-часовом световом режиме на протяжении всего периода вегетации.
|
|
|
|
Рис. 1. Процесс обработки побегов V. macrocarpon в растворе KMnO4 |
Рис. 2. Пересадка побегов V. macrocarpon в горшочки с керамзитом |
Подачу питательного раствора в течение 15 мин проводили 6-кратно за сутки. Для подкормки использовали полностью растворимое комплексное удобрение Yara Ferticare Hydro (производитель – Yara Int., Норвегия) с содержанием микроэлементов (NPK 6:14:30) и кальциевую селитру. Уровень кислотности (pH) – 5,8–6,0. В течение 10 сут увеличивали концентрацию солей до 1,3 мСм/см, после 20 сут – до 1,8 мСм/см. Каждые 12 дней проводили замену питательного раствора. Через 7, 14, 20, 30, 50 и 70 сут после пересадки систематически проводили учет приживаемости и морфометрических показателей роста растений (число и длина побегов, число листьев, число и длина корней). Опыты закладывались в 3-кратной повторности, по 100 растений-регенерантов в каждой.
Результаты и их обсуждение. Анализ результатов проведенных исследований показал, что на этапе адаптации растений-регенерантов V. macrocarpon к нестерильным условиям на субстрате из верхового торфа период культивирования оказывал разное влияние на приживаемость и биометрические показатели надземной части растений. Наибольшая приживаемость растений на верховом торфе отмечалась на 70-е сут выращивания (75–80 %), при этом существенных сортовых различий по этому показателю не выявлено (табл. 1). У всех исследуемых сортов V. macrocarpon увеличение фитомассы наблюдалось на 50–70-е сут, что говорит о правильном физиологическом развитии растений в данных условиях.
Таблица 1
Приживаемость и средние морфометрические показатели растений V. macrocarpon
при адаптации к торфяному субстрату
|
Сорт |
Период адаптации, сут |
Приживаемость, % |
Число листьев, шт. |
Длина побегов, см |
|
Ben Lear |
7 |
18 |
16,2±0,18 |
2,8±0,10 |
|
14 |
26 |
20,1±0,24 |
3,3±0,12 |
|
|
20 |
42 |
28,4±0,11 |
4,4±0,14 |
|
|
30 |
51 |
37,3±0,16 |
4,8±0,17 |
|
|
50 |
70 |
42,6±0,14 |
5,3±0,19 |
|
|
70 |
78 |
50,6±0,21 |
6,8±0,11 |
|
|
Piligrim |
7 |
14 |
12,2±0,17 |
1,9±0,13 |
|
14 |
24 |
17,1±0,18 |
3,6±0,16 |
|
|
20 |
38 |
31,0±0,13 |
4,1±0,14 |
|
|
30 |
48 |
36,9±0,21 |
4,6±0,11 |
|
|
50 |
57 |
48,7±0,10 |
5,7±0,15 |
|
|
70 |
75 |
54,3±0,24 |
6,4±0,12 |
|
|
Мерянка |
7 |
22 |
10,3±0,16 |
2,3±0,09 |
|
14 |
30 |
26,7±0,11 |
2,6±0,12 |
|
|
20 |
46 |
39,8±0,19 |
4,9±0,17 |
|
|
30 |
52 |
48,2±0,23 |
6,3±0,26 |
|
|
50 |
64 |
54,6±0,29 |
7,8±0,29 |
|
|
70 |
78 |
58,3±0,34 |
8,2±0,37 |
|
|
Славянка |
7 |
16 |
8,3±0,09 |
2,8±0,12 |
|
14 |
31 |
19,8±0,17 |
3,9±0,19 |
|
|
20 |
43 |
29,5±0,19 |
4,9±0,21 |
|
|
30 |
54 |
34,9±0,21 |
6,9±0,26 |
|
|
50 |
69 |
56,3±0,30 |
8,1±0,32 |
|
|
70 |
80 |
60,1±0,32 |
8,7±0,34 |
В результате проведенных исследований при использовании гидропонной установки выявлено, что приживаемость регенерантов V. Macrocarpon как зарубежных, так и отечественных сортов была наименьшей при периоде адаптации 7 дней и не превышала 40 %, тогда как при увеличении времени адаптации до 14, 20 и 30 сут наблюдалось увеличение приживаемости соответственно в 1,6–2,0 раза, в 1,8–2,5 и в 2,3–3,1 раза. При периоде адаптации 50 и 70 дней приживаемость всех растений V. macrocarpon составила 100 % (табл. 2).
Таблица 2
Приживаемость растений-регенерантов V. macrocarpon,
адаптируемых на гидропонной установке, %
|
Сорт |
Период адаптации, сут. |
|||||
|
7 |
14 |
20 |
30 |
50 |
70 |
|
|
Ben Lear |
27 |
54 |
67 |
85 |
100 |
100 |
|
Piligrim |
28 |
50 |
64 |
80 |
100 |
100 |
|
Мерянка |
32 |
60 |
72 |
89 |
100 |
100 |
|
Славянка |
40 |
62 |
70 |
92 |
100 |
100 |
Анализ полученных результатов (табл. 3) показал, что ассимиляционный аппарат адаптируемых растений V. macrocarpon начинает заметно развиваться при периоде адаптации от 20 сут, о чем свидетельствуют показатели образования вегетативной массы (число побегов и листьев) (рис. 3, а, б). Наилучшие морфометрические показатели надземной части растений V. macrocarpon отмечены при периоде адаптации 50–70 сут (рис. 3, в, г), при этом значения средних показателей у растений сортов российской селекции незначительно (в 1,1–1,3 раза) превышали аналогичные параметры у зарубежных сортов. Установлено, что у растений V. Macrocarpon сортов Мерянка и Славянка на гидропонной установке может формироваться до 5 побегов на одном растении, тогда как у зарубежных сортов – только до 4 побегов, что говорит о преимуществе использования российских сортов для размножения.
Таблица 3
Средние морфометрические показатели растений-регенерантов V. macrocarpon,
адаптируемых на гидропонной установке
|
Сорт |
Период адаптации, сут |
Число побегов, шт. |
Длина побегов, см |
Число листьев, шт. |
Число корней, шт. |
Длина корней, см |
|
Ben Lear |
7 |
1,0±0,11 |
3,8±0,15 |
20,2±1,02 |
1,8±0,16 |
0,8±0,16 |
|
14 |
2,0±0,18 |
4,2±0,20 |
28,8±0,98 |
2,2±0,12 |
1,3±0,12 |
|
|
20 |
2,4±0,21 |
5,0±0,14 |
38,4±1,01 |
3,9±0,17 |
5,8±0,19 |
|
|
30 |
3,3±0,19 |
7,2±0,24 |
44,5±1,21 |
5,8±0,28 |
7,9±0,44 |
|
|
50 |
3,8±0,26 |
15,3±0,12 |
73,2±1,33 |
19,3±0,64 |
13,2±0,67 |
|
|
70 |
4,3±0,13 |
28,4±0,11 |
84,0±1,26 |
24,3±0,87 |
25,6±0,74 |
|
|
Piligrim |
7 |
1,3±0,20 |
2,5±0,20 |
18,2±1,13 |
2,3±0,34 |
1,2±0,13 |
|
14 |
2,1±0,11 |
4,4±0,23 |
31,3±1,22 |
2,8±0,27 |
1,9±0,18 |
|
|
20 |
3,1±0,17 |
5,2±0,19 |
40,6±1,34 |
4,1±0,21 |
4,9±0,19 |
|
|
30 |
3,9±0,15 |
7,6±0,12 |
46,7±1,45 |
6,9±0,17 |
5,2±0,23 |
|
|
50 |
4,0±0,22 |
13,9±0,29 |
57,9±1,72 |
14,2±0,14 |
12,2±0,24 |
|
|
70 |
4,1±0,17 |
24,9±0,15 |
86,1±1,39 |
20,4±0,18 |
21,3±0,32 |
|
|
Мерянка |
7 |
1,2±0,12 |
3,3±0,18 |
22,3±1,23 |
1,6±0,13 |
1,2±0,31 |
|
14 |
2,2±0,19 |
3,8±0,11 |
30,2±1,18 |
2,6±0,14 |
2,3±0,19 |
|
|
20 |
3,3±0,18 |
5,2±0,30 |
42,4±1,39 |
3,0±0,18 |
5,3±0,32 |
|
|
30 |
4,0±0,11 |
8,3±0,34 |
50,6±1,52 |
7,2±0,13 |
6,8±0,56 |
|
|
50 |
4,5±0,23 |
19,3±0,29 |
66,2±1,73 |
16,3±0,28 |
17,3±0,44 |
|
|
70 |
5,1±0,19 |
30,2±0,44 |
92,4±1,90 |
22,1±0,32 |
24,0±0,52 |
|
|
Славянка |
7 |
1,9±0,09 |
3,0±0,14 |
16,9±1,10 |
2,3±0,21 |
1,0±0,13 |
|
14 |
2,6±0,16 |
4,2±0,19 |
27,4±1,13 |
3,2±0,64 |
2,6±0,24 |
|
|
20 |
3,0±0,20 |
5,8±0,28 |
46,8±1,43 |
7,9±0,72 |
5,5±0,20 |
|
|
30 |
3,9±0,17 |
8,3±0,32 |
58,8±1,64 |
15,8±0,99 |
7,8±0,19 |
|
|
50 |
4,7±0,19 |
15,6±0,40 |
69,4±1,89 |
23,2±0,89 |
18,6±0,13 |
|
|
70 |
5,1±0,23 |
27,4±0,42 |
95,4±2,01 |
25,6±1,01 |
26,1±0,96 |
Похожая тенденция наблюдалась и при развитии корневой системы адаптируемых растений V. macrocarpon на гидропонной установке. При увеличении периода адаптации с 7 до 30 сут число корней растений всех исследуемых сортов увеличилось в среднем в 3,0–6,8 раза. При увеличении периода адаптации до 50–70 сут выявлено значительное увеличение показателей, превышающее аналогичные значения на 7-е сут адаптации: по числу корней – в 6,2–13,8 раза, по длине корней – в 10,2–32,0 раза. При этом максимальные средние значения морфометрических показателей подземной системы адаптируемых растений отмечены у сорта Славянка, незначительно меньше – у сорта Ben Lear.
Сравнительный анализ показал, что растения V. macrocarpon, пересаженные из питательной среды в культуре in vitro в условия ex vitro с помощью гидропонного метода, успешно прижились на выбранном субстрате и активно развивались, при этом активный прирост длины побегов наблюдался после 30 дней культивирования, а суммарный прирост побегов – после 1,5 месяцев выращивания. При этом приживаемость растений V. macrocarpon всех исследуемых сортов, адаптированных на торфяном субстрате без использования гидропонной установки, через 50–70 сут после их пересадки оказалась в 1,3–1,8 раза меньше по сравнению с гидропонным методом выращивания, тогда как значения длины побегов – в среднем в 1,9–4,2 раза меньше, числа листьев – в 1,2–1,7 раза.
|
|
|
|
а |
б |
|
|
|
|
в |
г |
Рис. 3. Адаптируемые растения V. macrocarpon в условиях гидпропоники
при периоде культивирования: а – 7 сут; б – 20 сут; в – 50 сут; г – 70 сут
Заключение. Таким образом, приживаемость растений-регенерантов V. macrocarpon при адаптации к нестерильным условиям с использованием гидропонной установки была максимальной на 50–70-е сут культивирования и составила 100 %, тогда как без использования гидропоники на субстрате из верхового торфа данный показатель не превышал 80 %. Морфометрические показатели растений V. Macrocarpon имели высокие значения также при использовании гидропонной установки, при этом по числу побегов, числу и длине корней сорта российской селекции имеют преимущества по сравнению с зарубежными сортами. Использование гидропонного метода перспективно для адаптации растений V. macrocarpon, полученных методом микроклонального размножения, при получении высококачественного посадочного материала отечественных сортов в целях плантационного выращивания в условиях европейской части России.
1. Eck P. The American Cranberry. New Brunswick & London: Rutgers University Press, 1990. 420 p.
2. Cherkasov A.F. Plantacionnoe vozdelyvanie klyukvy v SShA // Lesnoe hozyaystvo. 2002. № 4. S. 46.
3. Torikov V.E. Lekarstvennaya cennost' ovoschnyh, plodovo-yagodnyh, polevyh rasteniy i dikorosov: monografiya. Bryansk: Izd-vo Bryanskoy GSHA, 2013. 292 s.
4. Kolontarev K.B., Zaycev A.V. Primenenie proantocianidinov klyukvy v terapii recidiviruyuschey mochevoy infekcii // Medicinskiy sovet. 2014. № 19. S. 28–31.
5. Lyutikova M.N., Botirov E.H. Himicheskiy sostav i prakticheskoe primenenie yagod brusniki i klyukvy // Himiya rastitel'nogo syr'ya. 2015. № 2. S. 5–27. DOI: 10.14258/ jcprm.201502429.
6. Gorbunov I.V., Ryazanova L.G. Yagodnye kul'tury: ucheb. posobie. Krasnodar: Kuban. gos. agrarnyy un-t im. I.T. Trubilina, 2017. 198 s.
7. Vilbaste H., Vilbaste J., Ader K. Cranberry – The Grape of the North. Tallinn: Ministry of Environment, Republic of Estonia, Nigula State Nature Reserve, 1995. 16 p.
8. Tyak G.V., Kurlovich L.E., Tyak A.V. Biologicheskaya rekul'tivaciya vyrabotannyh torfyanikov putem sozdaniya posadok lesnyh yagodnyh rasteniy // Vestnik Kazanskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2016. T. 11, № 2. S. 43–46. DOI:https://doi.org/10.12737/20633.
9. Korenev I.A., Tyak G.V., Makarov S.S. Sozdanie novyh sortov lesnyh yagodnyh rasteniy i perspektivy ih intensivnogo razmnozheniya (in vitro) // Lesohozyaystvennaya informaciya. 2019. № 3. S. 180–189. DOI:https://doi.org/10.24419/LHI.2304-3083.2019.3.15.
10. Sel'skohozyaystvennaya biotehnologiya i bioinzheneriya: uchebnik / V.S. Sheveluha [i dr.]; pod obsch. red. V.S. Sheveluhi. M.: URSS, 2015. 715 s.
11. Vahmistrov D.B. Rasteniya bez pochvy. M.: Ripol Klassik, 2013. 118 s.
12. Texier W. Hydroponics for Everybody. All about Home Horticulture. Paris: Mama Publ., 2013. 328 p.
13. Shishkin P.V., Antipova O.V. Bessubstratnaya tehnologiya gidroponnogo vyraschivaniya // Ovoschi Rossii. 2017. № 3 (36). S. 56–61.
14. Primenenie osvescheniya razlichnogo spektral'nogo diapazona pri klonal'nom mikrorazmnozhenii lesnyh yagodnyh rasteniy / S.S. Makarov [i dr.] // Izvestiya vuzov. Lesnoy zhurnal. 2022. № 6. S. 82–93. DOI:https://doi.org/10.37482/0536-1036-2022-6-82-93.
15. Vyraschivanie lesnyh yagodnyh rasteniy v usloviyah in vitro: laboratornyy praktikum / sost. S.S. Makarov [i dr.]. Karavaevo: Kostromskaya GSHA, 2019. 48 s.
