M.V. Lomonosov Northern (Arctic) Federal University
Moscow, Russian Federation
Arkhangelsk, Russian Federation
The purpose of research is to study the characteristics of rhizogenesis in vitro of domestic varieties of P. cerasus and their adaptation to non-sterile conditions ex vitro. The study was carried out on the basis of the Russian State Agrarian University – Moscow Timiryazev Agricultural Academy, Kostroma State Agricultural Academy and Northern Federal University named after M.V. Lomonosov using generally accepted methods for clonal micropropagation of plants. The objects of the study were P. cerasus plants of two Russian varieties of medium ripening – Novella and Shokoladnitsa, which are in great demand in the Non-Chernozem zone of the Russian Federation. The tips of green and woody shoots, apical and lateral buds of plants were used as explants. The influence of auxins, illumination and cultivation temperature on the degree of root formation of regenerated plants was studied. The rooting rate (%) and the number of roots formed (pcs.) were taken into account. The experiment was repeated 3 times, with 10 test tube plants in each. Adaptation of in vitro rooted test tube plants was carried out in a heated room on vertical 4-tier farms (2.22 × 0.7 × 3.5 m) with a photoperiod of 16/8 hours, air temperature 23 ± 2 °C, air humidity – approx. 90–100 %. Indolylbutyric acid at a concentration of 1.0 mg/l in the Murashige-Skoog nutrient medium had the greatest effect (56.2 %) on improving the rooting of P. cerasus microshoots in in vitro culture. The best rooting (44 %) of P. cerasus microshoots in in vitro culture was detected within 2 weeks under illumination conditions of 1500–2000 lux and air temperature 15 °C. The greatest increase in shoots of regenerated plants of the P. cerasus variety Shokoladnitsa (11.3 mm) and Novella (5.13 mm) at the stage of adaptation to non-sterile conditions ex vitro on a substrate of a mixture of peat with sand (2: 1) was noted when illuminated with LED when illuminated by red spectrum lamps, which is 1.8–3.2 times more than when using the white spectrum.
common cherry, variety, clonal micropropagation, in vitro, ex vitro, rhizogenesis, growth regulators, adaptation, lighting
Введение. Вишня обыкновенная (Prunus cerasus L.) – одна из самых популярных универсальных плодовых культур, используемых в пищевой промышленности и фармацевтической отрасли, а также в декоративных целях. В настоящее время она выращивается преимущественно в странах с умеренным климатом. В России на коммерческой основе вишню культивируют в нескольких южных регионах (Краснодарский край, Ставропольский край, Воронежская, Ростовская, области, Республики Адыгея, Крым и др.). При выращивании в почвенно-климатических условиях Нечерноземной зоны европейской части России на хорошем агрофоне и при рациональном подборе ассортимента вишня может давать 40–50 ц/га [1, 2], однако при промышленном возделывании в Центральной части страны культура ее имеет низкий удельный вес, что во многом объясняется массовым вымерзанием косточковых, низким уровнем агротехники, неправильным подбором земель под насаждения, широким распространением грибных болезней и другими причинами [3–5].
В последние десятилетия выведен ряд новых отечественных сортов P. cerasus, которые являются перспективными по сочетанию основных хозяйственно-биологических признаков (зимостойкость, урожайность, самоплодность, вкусовые и технологические качества), превосходя ранее известные районированные в различных регионах Нечерноземья [6–9]. Актуальной проблемой остается необходимое для плантационного выращивания массовое получение корнесобственного посадочного материала этой культуры с использованием традиционных способов размножения [5].
В связи с этим следует использовать метод клонального микроразмножения, который позволяет получать большое количество высококачественного, безвирусного и генетически однородного, корнесобственного посадочного материала за короткий срок в течение круглого года. При этом адаптация укорененных саженцев к нестерильным условиям ex vitro является последним и одним из самых ответственных этапов, и условия освещения здесь также играют не последнюю роль [10, 11]. Многолетним мировым опытом исследований по выращиванию P. cerasus в культуре in vitro подтверждаются генотипические особенности роста и развития растений-регенерантов [12–20]. Однако необходимо совершенствование технологического цикла клонального микроразмножения для некоторых современных сортов отечественной селекции, перспективных для культивирования в средней полосе России, с подбором оптимального состава питательных сред, регуляторов роста и внешних условий окружающей среды.
Цель исследования – изучение особенностей ризогенеза in vitro отечественных сортов P. cerasus и их адаптации к нестерильным условиям ex vitro.
Объекты и методы. В качестве объектов исследования рассматривали растения P. cerasus двух российских сортов среднего срока созревания – Новелла и Шоколадница, пользующихся большим спросом в Нечерноземной зоне Российской Федерации. Исследования проводили на базе РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, Костромской ГСХА и САФУ им. М.В. Ломоносова с использованием общепринятых методик по клональному микроразмножению растений [11]. В качестве эксплантов использовали верхушки зеленых и одревесневших побегов, апикальные и латеральные почки растений. Растения культивировали в стеклянных сосудах объемом 0,25–0,5 л на питательной среде Мурасиге – Скуга (MS), в условиях световой комнаты при поддержании температуры воздуха 23–25 °C, относительной влажности воздуха 80 %, использовании освещения люминесцентными лампами с интенсивностью 1500–2000 лк при фотопериоде 16/8 ч.
На этапе укоренения микропобегов in vitro на твердой питательной среде MS в качестве регуляторов роста ауксиновой группы использовали индолил-3-масляную (ИМК) и индолил-3-уксусную (ИУК) кислоты в концентрации 1,0 мл/л, при этом в качестве контроля рассматривали вариант среды без добавления гормонов. Опыты проводили при 2 вариантах освещенности (нормальная – 1500–2000 лк; пониженная – 500 лк) и температуры воздуха (нормальная 23–25 °C; пониженная 15 °C). Изучали влияние ауксинов, освещенности и температуры культивирования на степень корнеобразования растений-регенерантов. Учитывали укореняемость (%) и число образовавшихся корней (шт.). Повторность опыта 3-кратная, по 10 пробирочных растений в каждой. Для обработки экспериментальных данных по общепринятым методикам [21] применяли метод дисперсионного анализа двухфакторного опыта с использованием критерия Фишера и наименьшей существенной разности на 5 % уровне значимости (НСР05).
Адаптацию укорененных in vitro пробирочных растений проводили в условиях отапливаемого помещения на вертикальных 4-ярусных фермах (2,22 × 0,7 × 3,5 м) при фотопериоде 16/8 ч, температуре воздуха 23 ± 2 °С, влажности воздуха около 90–100 %. Укорененные микрочеренки промывали от питательной среды и высаживали в кассеты 40 × 60 см с дренажными отверстиями, в которые для профилактики засора дренажной системы вкладывали пластмассовые вкладыши, препятствующие вымыванию грунта. В качестве субстрата использовали смесь стерильного торфа верхового типа и песка в соотношении 2 : 1. Посевная площадь составляла 4,8 м2 (1,2 м2 × 4 яруса). Для освещения использовали светодиодные светильники розового и белого спектра с воздушным охлаждением. При этом средняя потребляемая мощность составляла 0,64 кВт (133 Вт на 1 м2 посевной площади); пиковая потребляемая мощность достигалась при включении насоса и была равна 0,8 кВт. Примерный расход воды за 1 пролив – до 0,5 м3. Спустя 2 недели адаптации учитывали прирост укоренившихся побегов (мм).
Результаты и их обсуждение. Статистический анализ данных, полученных в результате исследований, показал, что на укореняемость микропобегов растений-регенерантов P. cerasus в культуре in vitro наибольшее влияние оказывал тип регулятора роста (61 %), наименьшее – взаимодействие двух факторов: внешних условий и регулятора роста (5 %). Доля влияния фактора внешних условий составила 22 %, случайных факторов – 12 %.
Установлено, что наибольшего значения (63,8 %) укореняемость побегов P. cerasus достигала при культивировании эксплантов в течение 2 недель в условиях нормальной освещенности совместно с пониженной температурой, а наименьшего (17,5 %) – при культивировании в условиях пониженной освещенности и нормальной температуры. При культивировании микрорастений P. cerasus сортов Новелла и Шоколадница в условиях пониженной температуры и освещенности укореняемость микропобегов составила 28,6 %, а в условиях нормальной температуры и освещенности – 33,6 % (рис. 1). В условиях пониженной температуры и дефицита освещенности и в условиях нормальной температуры при повышенной и пониженной освещенности не наблюдали существенных различий при культивации. В остальных случаях были выявлены существенные различия (НСР05 = 11,02).
|
|
|
|
а |
б |
Рис. 1. Укоренение микрорастений P. cerasus в культуре in vitro в условиях:
а – нормального освещения в сочетании с понижением температуры;
б – дефицита освещенности и температуры
Процент укореняемости микропобегов P. cerasus при использовании ИМК и ИУК существенно не различаляся и составлял 56,2 и 54,4 % соответственно. В контрольном варианте укореняемость составила лишь 5,7 %. Существенные различия выявлены при культивировании эксплантов на безгормональной питательной среде и средах с добавлением ИМК или ИУК. При культивации эксплантов P. cerasus сорта Шоколадница на питательной среде с добавлением ИУК и ИМК существенных различий не наблюдали (НСР05 = 8,12).
В ходе анализа групповых средних значений укоренеяемости по взаимодействию двух факторов (внешние условия и гормон) оптимальным регулятором роста при культивировании исследуемых сортов P. cerasus в культуре in vitro в условиях пониженной освещенности и нормальной температуры оказался ИУК: процент укореняемости микропобегов на среде с добавлением данного регулятора роста составил 33,3 %. При культивировании P. cerasus в условиях нормальной освещенности при нормальной и пониженной температуре лучшим гормоном оказалась ИМК: укореняемость сорта на среде с добавлением данного гормона при условиях нормальной освещенности и температуре составила 65 %, в условиях нормальной освещенности и при пониженной температуре – 73,8 %. При культивировании растений-регенерантов P. cerasus в условиях пониженной освещенности и температуры укореняемость на средах с добавлением ИМК и ИУК составила 53 %. На безгормональной среде MS (контроль) микропобеги укоренились только в условиях нормальной освещенности при нормальной и пониженной температуре, причем в условиях нормальной освещенности и пониженной температуры процент микропобегов с корнями оказался выше (44 %), в то время как при культивировании P. cerasus в условиях нормальной освещенности и температуры процент укоренившихся эксплантов составил 3,8 % (табл. 1).
Таблица 1
Групповые средние значения укореняемости микропобегов P. cerasus в культуре in vitro
по градациям взаимодействия влияния внешних условий и регулятора роста, %
|
Условия культивирования микропобегов |
Состав питательной среды |
|||
|
MS + ИУК 1,0 мл/л |
MS + ИМК 1,0 мл/л |
MS (контроль) |
||
|
Свет + тепло |
54,7 |
65 |
3,8 |
|
|
Тень + тепло |
33,3 |
30,2 |
0 |
|
|
Свет + холод |
68 |
73,8 |
44,0 |
|
|
Тень + холод |
53 |
53 |
0 |
|
|
НСР05 |
24,16 |
|||
В результате двухфакторного дисперсионного анализа также выявлено, что в большей степени на число корней P. cerasus оказывало влияние регулятора роста (53 %), а в меньшей – внешние условия (17 %). Доля влияния случайного фактора составила 30 %.
Отмечено, что наибольшее число корней P. cerasus на микропобеге (2,38 шт.) наблюдалось при культивировании эксплантов в условиях нормальной освещенности и пониженной температуры, а наименьшее (1,15 шт.) – при культивировании в условиях нормальной температуры и пониженной освещенности. При культивировании растений-регенерантов P. cerasus в условиях пониженной освещенности и температуры число микропобегов с корнями составило 1,63 шт., а в условиях нормальной освещенности и температуры – 1,82 шт. Существенные различия наблюдали при культивировании эксплантов в условиях пониженной температуры и нормальной освещенности и в условиях дефицита температуры и освещенности, тогда как в остальных случаях существенных различий не установлено (НСР05 = 1,05). При этом использование в питательной среде ауксина ИМК способствовало образованию большего числа корней (2,81 шт.) P. cerasus в культуре in vitro, тогда как при использовании ИУК оно составило 1,93 шт. (рис. 2). На контрольном варианте экспланты не образовывали корней. Существенные различия выявлены между всеми представленными вариантами гормонального состава питательной среды (НСР05 = 0,82).
На этапе адаптации растений-регенерантов P. cerasus к нестерильным условиям ex vitro установлено, что наибольшее влияние на длину адаптируемых побегов P. cerasus сортов Новелла и Шоколадница оказывал тип освещения (36 %). Доля влияния фактора сортового различия составила 22 %, взаимодействия этих двух факторов – 25 %, случайных факторов – 17 %. При этом сорт Шоколадница имел наибольший прирост (8,6 см), тогда как наименьший прирост наблюдался у сорта Новелла (4,3 см) (рис. 3). Между исследуемыми сортами наблюдали существенные различия (НСР05 = 3,35).
Выявлено, что наибольший прирост (11,95 мм) наблюдался у микропобегов P. cerasus при адаптации в условиях с красным типом спектра освещения, наименьший (3,18 мм) – в условиях с холодным спектром. Между побегами, проходившими адаптацию на досвечивании лампами красного спектра и холодного спектра, выявлены существенные различия (НСР05 = 3,35).
|
|
|
|
а |
б |
Рис. 2. Число корней P. cerasus в культуре in vitro в условиях пониженной освещенности
и нормальной температуры на питательной среде MS с добавлением: а – ИМК; б – ИУК
|
|
|
|
а |
б |
Рис. 3. Растения-регенеранты P. cerasus на этапе адаптации
к нестерильным условиям ex vitro: а – Новелла; б – Шоколадница
По результатам взаимодействия двух факторов – сорта и типа освещения – отмечено, что максимальные значения прироста побегов P. cerasus достигнуты на красном спектре досвечивания: у сорта Шоколадница – 11,3 мм, у сорта Новелла – 5,13 мм. При использовании белого спектра этот показатель для данных сортов был соответственно в 3,2 и 1,8 раза меньше. Существенные различия были установлены на сорте Шоколадница при красном спектре освещения по отношению к другим исследуемым сортам, в остальных же вариантах существенных различий не наблюдалось (НСР05 = 6,52).
Заключение. Таким образом, в результате проведенного исследования по клональному микроразмножению P. cerasus отмечено, что на этапе укоренения на индукцию ризогенеза эксплантов сортов Новелла и Шоколадница в большей степени оказал ауксин ИМК в концентрации 1,0 мг/л. Лучшая укореняемость микропобегов P. cerasus в культуре in vitro в течение 2 недель выявлена при нормальной освещенности (1500–2000 лк) и пониженной температуре воздуха (15 °C). На адаптацию растений-регенерантов P. cerasus российских сортов к нестерильным условиям ex vitro существенное влияние оказывали тип освещения и сорт. Наибольший прирост побегов наблюдался при освещении лампами красного спектра. Полученные данные могут быть использованы для совершенствования технологии клонального микроразмножения вишни сортов отечественной селекции с целью массового получения высококачественного и оздоровленного посадочного материала.
1. Miheev A.M., Revyakina N.T. Vishnya. Izd. 2-e, pererab. i dop. M.: Agropromizdat, 1991. 40 s.
2. Orlova S.Yu. Biologicheskie osobennosti i selekcionnaya cennost' sortov vishni v usloviyah severo-zapada Rossii: avtoref. dis. … kand. biol. nauk. SPb., 2002. 20 s.
3. Rasprostranennost' virusnyh bolezney kostochkovyh kul'tur v Evropeyskoy chasti Rossii / Yu.N. Prihod'ko [i dr.] // Sel'skohozyaystvennaya biologiya. 2008. № 1. S. 26–32.
4. Monitoring vredonosnyh virusov v nasazhdeniyah vishni i chereshni v Podmoskov'e / K.V. Metlickaya [i dr.] // Plodovodstvo i yagodovodstvo Rossii. 2016. T. 46. S. 227–231.
5. Sharafutdinov H.V. Sazhency vishni i chereshni. Effektivnye sposoby polucheniya privityh rasteniy: monografiya. M.: MESH, 2020. 136 s.
6. Astahov A.A. Novye sorta vishni i chereshni dlya yuga Nechernozem'ya // Sadovodstvo i vinogradarstvo. 2007. № 5. S. 21–23.
7. Kartashova O.N. Zimostoykost' i produktivnost' novyh sortov vishni v usloviyah Nechernozem'ya: avtoref. dis. … kand. s.-h. nauk. M., 2009. 26 s.
8. Solonkin A.V. Strategiya selekcii vishni i slivy dlya sozdaniya sortov v Nizhnem Povolzh'e, vozdelyvaemyh po sovremennym tehnologiyam: dis. … d-ra s.-h. nauk: 06.01.05. Volgograd, 2017. 349 s.
9. Ocenka adaptivnosti sortoobrazcov vishni i chereshni na yuge Nechernozem'ya / M.V. Kan'shina [i dr.] // Selekciya i sortorazvedenie sadovyh kul'tur. 2021. T. 8, № 1-2. S. 45–48. DOI:https://doi.org/10.24411/2500-0454-2021-10114.
10. Butenko R.G. Biologiya kletok vysshih rasteniy in vitro i biotehnologii na ih osnove. M.: FBK-Press, 1999. 160 s.
11. Sel'skohozyaystvennaya biotehnologiya i bioinzheneriya: uchebnik / V.S. Sheveluha [i dr.]; pod obsch. red. V.S. Sheveluhi. M.: URSS, 2015. 715 s.
12. Demenko V.I., Trushechkin V.G. Razmnozhenie vishni metodom in vitro // Sel'skohozyaystvennaya biologiya. M., 1983. № 7. S. 51–53.
13. Vysockiy V.A., Oleshko E.V. Sovershenstvovanie pitatel'noy sredy dlya klonal'nogo mikrorazmnozheniya vishni // Agrotehnika i sortoizuchenie plodovyh kul'tur: sb. nauch. tr. M., 1985. S. 72–76.
14. Cerović R., Ružić D. Micropropagation of Sour Cherry (Prunus cerasus L.) cv. Šumadinka // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1987. Vol. 9. P. 151–157.
15. Mikroklonal'noe razmnozhenie vishni / V.V. Faustov [i dr.]. // Izvestiya TSHA. 1988. Vyp. 5. S. 131–148.
16. Tang H., Ren Z., Krczal G. Somatic Embryogenesis and Organogenesis from Immature Embryo Cotyledons of Three Sour Cherry Cultivars (Prunus cerasus L.) // Scientia Horticulturae. 2000. Vol. 83. P. 109–126.
17. Dzhigadlo M.I. Ispol'zovanie biotehnologicheskih i biofizicheskih metodov v selekcii i sortorazvedenii plodovyh i yagodnyh kul'tur: avtoref. dis. … kand. s.-h. nauk. Michurinsk, 2003. 26 s.
18. Proliferation and Rooting Efficiency Studies in Sour Cherry (Prunus cerasus) Using In Vitro Techniques / S.R. Singh [et al.] // Journal of Horticultural Sciences. 2010. Vol. 5. № 1. P. 48–52.
19. Optimization of Nutrient Media of In Vitro Propagation for Some Cherry Rootstocks (Prunus cerasus) / A. Gashi [et al.] // Anglisticum Journal (IJLLIS). 2017. Vol. 6. Iss. 12. P. 54–61. DOI:https://doi.org/10.5281/zenodo.1134340.
20. Vliyanie sezonnogo faktora na prizhivaemost' eksplantov vishni obyknovennoy v kul'ture in vitro / V.V. Shahov [i dr.] // Mezhdunarodnyy nauchno-issledovatel'skiy zhurnal. 2020. № 11-1 (101). S. 159–162. DOI:https://doi.org/10.23670/IRJ.2020.101.11.027.
21. Dospehov B.A. Metodika polevogo opyta (s osnovami statisticheskoy obrabotki rezul'tatov issledovaniy): uchebnik. 6-e izd. M.: Al'yans, 2011. 350 s.
