Введение. В последнее время у научного сообщества растет интерес к открытию новых биоактивных соединений, которые возможно выделить из пищевых продуктов или веществ, что дает большие возможности к получению новых пептидов с фармакологическими эффектами. Биоактивные пептиды – это молекулы, обладающие потенциальной биологической активностью, которая может оказывать влияние на некоторые функции организма и здоровье человека в целом. Они считаются альтернативой для профилактики различных метаболических заболеваний, так как обладают широким спектром действия, менее аллергенны, проявляют высокую биоспецифическую активность и структурное разнообразие. Ввиду того, что различные сыры являются высокобелковыми продуктами, а большинство из них во время созревания подвергается протеолизу различной степени, их можно рассматривать как альтернативный источник для разработки нового поколения функциональных продуктов или биологически активных веществ.
В настоящее время идентифицированы и выделены сотни пептидов с различной биологической активностью из различных пищевых источников, включая молоко, сыворотку, яйца, рыбу, рис, сою, арахис, нут, кукурузу и водоросли [1, 2]. Однако лишь немногие из них представлены на рынке как функциональные продукты нутрицевтики. Например, биоактивные пептиды, полученные из молока и рыбы, широко представлены на современном рынке пищевых ингредиентов по сравнению с пептидами из других пищевых источников. Антиоксидантные пептиды обычно содержат в своей структуре гидрофобные аминокислоты и остатки гистидина, фенилаланина, триптофана или тирозина [3, 4].
Цель – провести исследование по накоплению биоактивных пептидов и их свойств в зрелых полутвердых сырах методом in silico.
Задачи: провести выработку модельных полутвердых сыров при участии стартерных культур, содержащих штаммы – Lactococcus lactis subspecies lactis (далее Lc. lactis subs. lactis), Lactococcus lactis subspecies cremoris (далее Lc. lactis subs. cremoris) и Lactocaseibacillus casei (далее L. сasei); провести определение химического состава модельных полутвердых сыров в возрасте 90 дней, а также их пептидную последовательность; изучить влияние штаммов старторных культур на биоактивность и другие свойства пептидов модельных полутвердых сыров.
Объекты и методы. Для проведения исследований были использованы модельные образцы полутвердых сыров, полученные в лабораторных условиях. В качестве стартерных культур для контрольного образца сыра (сыр А) использовалась подготовленная бактериальная мезофильная культура МО/032 (фирмы Lyofast), содержащая штаммы – Lc. lactis subs. lactis и Lc. lactis subs. cremoris – 0,5 % от объема молока; для опытного образца (сыр В) дополнительно использовали культуру LC4P1 (фирмы Lyofast), содержащую бактерии L. casei.
Основные параметры производства модельных образцов полутвердого сыра: температура пастеризации нормализованной смеси 74 °С, выдержка 20 с; температура инокуляции 34 °С; время инокуляции 10 мин; мультипликатор флокуляции 3; нарезка кубиков размером 1,0×1,0 см; температура второго нагревания 45 °С; рН при сливе сыворотки 6,2–6,35; стуфатура 1,5 ч; срок аффинажа сыров 90 дней при температуре 12–14 °С и относительной влажности воздуха 80–85 %.
Химический состав молока и сыров определяли по общепринятым методикам: массовую долю жира – кислотным методом Гербера (ГОСТ 5867), массовую долю белка в молоке – рефрактометрическим методом (ГОСТ 251793), массовую долю сухого вещества – по ГОСТ 3623. Массовую долю белка определяли на анализаторе общего азота (белка) RapidN Elementar, работающего по методу Дюма – сжигание пробы с регистрацией общего азота на детекторе теплопроводности. Аминокислотная последовательность пептидов исследуемых образцов гидролизатов была определена методом матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией на приборе MALDI Biotyper, Bruker. Степень биоактивности исследуемых пептидов оценивали методом in silico с помощью онлайн-сервера PeptideRanker, который ранжирует пептиды по прогнозируемой вероятности того, что пептид будет биологически активным. Моделирование структуры проводили с помощью сервиса SWISS-MODEL, который включает в себя репозиторий SWISS-MODEL и рабочее пространство SWISS-MODEL. С помощью базы данных биоактивных пептидов молока MBPDB проводили поиск, идентификацию белка и определение свойств исследуемых пептидов.
Экспериментальные исследования проводились на базе кафедры технологии продуктов питания животного Кемеровского государственного университета.
Результаты и их обсуждение. Для исследований были выработаны несколько модельных образцов полутвердого сыра. Аффинаж модельных сыров протекал при температуре 12–14 °С и относительной влажности 80–85 %. Химический состав сыра и активную кислотность определяли через 90 дней (табл. 1).
Таблица 1
Химический состав модельных сыров в возрасте 90 дней, %
|
Показатель |
Сыр А* (контрольный) |
Сыр В** (опытный) |
|
Массовая доля сухих веществ |
55,16 ± 0,21 |
54,85 ± 0,23 |
|
Массовая доля жира в сухом веществе |
48,93 ± 1,95 |
49,50 ± 1,04 |
|
Массовая доля общего белка |
20,23 ± 0,28 |
21,23 ± 0,31 |
|
Массовая доля соли |
2,34 ± 0,72 |
3,13 ± 0,55 |
*Сыр А – использовали закваску, в состав которой входили штаммы микроорганизмов Lc. lactis subs. lactis, Lc. lactis subs. Cremoris.
**Сыр В – использовали закваску, в состав которой входили штаммы микроорганизмов Lc. lactis subs. lactis, Lc. lactis subs. cremoris – и L.casei в соотношении 0,5 + 0,5 %.
Анализ результатов, представленных в таблице 1, показал, что химический состав сыров практически одинаков в модельных образцах. Активная кислотность была ниже у опытных образцов сыра В и составила 4,13 ± 0,06 ед., где дополнительно к основной культуре вносили бактерии L. casei, в образцах сыра А активная кислотность составляла 4,74 ± 0,18 ед.
Протеолитическая активность при созревании сыра зависит от нескольких факторов, таких как тип используемого коагулянта; нативная микрофлора молока и штаммы микроорганизмов, входящих в заквасочные культуры; остаточное действие коагулянта и нативных молочных протеаз, на которые может влиять содержание влаги в сыре, а также температура и относительная влажность сыра, условия аффинажа.
После 90-суточного аффинажа в исследуемых сырах проводили определение пептидных последовательностей и их биоактивности. В результате определения аминокислотной последовательности всего выявлено 115 пептидных последовательностей, в т. ч. в образце А – 91 пептидная последовательность, в образце В – 64, при этом потенциально биоактивных 20. Данные образцы имеют биоактивность от 0,547239 до 0,870583 единиц. Далее проводили проверку биоактивных свойств выявленных пептидных последовательностей с помощью доступных онлайн-серверов, основанных на общедоступных данных по биоактивным свойствам известных пептидов.
Дальнейшие исследования проводили методом in silico с помощью онлайн-ресурсов. В таблице 2 представлена характеристика биоактивных пептидов.
Таблица 2
Характеристика потенциальных биоактивных пептидов
|
Вид сыра |
Пептидная последовательность |
Биоактивность* |
Потенциальные биоактивные свойства** |
|
A, B |
PSGAW |
0,870583 |
Ингибиторы АПФ |
|
A, B |
MKPWI |
0,853622 |
Ингибиторы АПФ |
|
B |
SCDKFL |
0,844337 |
Ингибиторы АПФ |
|
A, B |
PPTVMF |
0,826762 |
Ингибитор DPP-IV |
|
A |
TFPGPIP |
0,774112 |
Ингибитор DPP-IV |
|
A |
PSYGL |
0,748397 |
Опиоид |
|
A |
MMKSF |
0,730558 |
Ингибиторы АПФ |
|
A |
PEWVCTTF |
0,703949 |
Ингибиторы АПФ |
|
A |
NNQFL |
0,693175 |
Ингибитор DPP-IV |
|
A |
PKYPVEPF |
0,630562 |
Антиоксидант |
|
A, B |
GGVSLPEW |
0,628953 |
Ингибиторы АПФ |
|
B |
SFNPTQL |
0,619614 |
Ингибиторы АПФ |
|
B |
CKDDQNPHSSNICNI |
0,61108 |
Антимикробный |
|
A |
PVEPF |
0,604782 |
Опиоид, ингибитор DPP-IV, антиоксидант |
|
A |
QWQVL |
0,584037 |
Иммуномодулирующие |
|
A, B |
SDIPNPI |
0,573163 |
Стимулирующие рост |
|
A |
PSFSDI |
0,547239 |
Противораковый, антимикробный |
* Оценивали методом in silico с помощью онлайн-сервера PeptideRanker.
** Базы данных биоактивных пептидов молока MBPDB.
Из результатов оценки биоактивных пептидов (табл. 2) видно, что исследуемые образцы обладают следующими основными свойствами: ингибиторы АПФ, ингибитор DPP-IV и антиоксидантные свойства. Можно отметить, что по результатам исследований in silico исследуемые штаммы микроорганизмов Lc. lactis subs. lactis и Lc. lactis subs. cremoris, которые использовались для производства контрольного образца сыра, в большей степени влияют на образование биоактивных пептидов. Так, у сыров контрольного образца было образованно 13 биоактивных пептидных последовательностей, при этом у сыра опытного образца В, содержащего бактерии L. Casei, – 7. Анализируя данные биоактивности пептидов в зрелых образцах модельного сыра можно остановиться на пептидной последовательности SCDKFL с высокой биоактивностью пептидов 0,8444337, которая встречается только в сыре В, где наряду с традиционными штаммами микроорганизмов использовали «сырную палочку» L. casei. Для сравнения интерес представляли также пептидные последовательности, которые встречались в контрольных (А) и опытных (В) образцах сыра и имели высокую биоактивность пептидов – MKPWI и PSGAW, с активностью 0,853622 и 0, 870583 соответственно.
Далее, с помощью онлайн-ресурсов, были разработаны модели структуры белков исследуемых сыров (рис.). Также на рисунке представлены обнаруженные участки структуры биоактивных пептидов исследуемых образцов сыра A и B.
|
|
|
|
Образец А |
Образец B |
Обнаруженные участки структуры биоактивных пептидов
(стрелки указывают на расположение пептидной последовательности
в общей структуре белковой молекулы)
Оценивая структуру данных пептидов, можно сделать вывод о том, что выявленные биоактивные пептиды имеют ароматические кольца, которые в основном представлены аминокислотами триптофан, тирозин и фенилаланин.
Примечательно то, что все эти последовательности по своим биоактивным свойствам являются ингибиторами ангиотензин-превращающего фермента (АПФ). Для организма человека ингибиторы АПФ обладают многофакторными действиями, такими как, например, расслабление кровеносных сосудов, что снижает артериальное давление.
В медицинской практике доказано, что применение ингибиторов АПФ снижает частоту случаев госпитализации при сердечной недостаточности, повышает продолжительность жизни, переносимость физической нагрузки и качество жизни в целом [5].
Заключение. В связи с этим можно предположить, что биоактивные пептиды, находящиеся в зрелом сыре, могут выполнять роль ингибиторов АПФ. В свою очередь, при регулярном употреблении зрелых сыров в рационе питания можно избежать приема фармакологических препаратов. Принадлежность к функциональным продуктам самих сыров можно рассматривать в другом разрезе, что и попытались отразить в данной работе. Представленное направление вызывает научный интерес и возможность прогнозировать накопление биоактивных пептидов в разных группах сыров за счет использования различных штаммов микроорганизмов в заквасочных культурах.
