Введение. Основным этапом в производстве бактериальных заквасок является консервирование. Замораживание является распространенным способом длительного сохранения жизнеспособности микробиологических препаратов. Воздействие низких температур может привести к повреждению плазматической мембраны, клеточной оболочки, денатурации белков, изменению ДНК микроорганизмов из-за внутри- и внеклеточного образования льда. Это ведет к денатурации белков и нарушению барьеров проницаемости [1]. На устойчивость микроорганизмов к замораживанию влияют условия и стадия развития, температура и скорость замораживания, среда замораживания. Повышают выживаемость клеток внесением различных защитных сред для замедления процессов внутриклеточного льдообразования [2–6].
Для сохранения высокой жизнеспособности микроорганизмов используют различные питательные среды: желатин, глицерин, обезжиренное молоко, пептон, сахарозу, сорбит, поливинилпирролидон, глутамат натрия и их комбинации [7].
Цель исследования – изучение протеолитической активности замороженного бактериального концентрата (ЗБК) курунговой закваски.
Задачи: определение температуры и продолжительности замораживания бактериального концентрата; изучение влияниz криопротекторов на протеолитическую активность размороженного бактериального концентрата; анализ аминокислотного состава курунги, полученной сквашиванием молока размороженным бактериальным концентратом.
Материалы и методы. Для исследования использовали общепринятые, стандартные и оригинальные методы биохимического, физико-химического и микробиологического анализа.
Для оценки протеолитической активности бактериального концентрата 1 мл исследуемого продукта вносили пипеткой в чашки Петри и заливали 10–15 мл расплавленного и охлажденного до 40–45 °С молочного агара. Посевной материал тщательно перемешивали с молочным агаром. Пробы термостатировали при температуре 30 °С в течение 48 ч. Гидролиз казеина обнаруживали по зоне просветления среды вокруг колонии [8].
Аминокислотный анализ образцов проводился методом ионной хроматографии с постколоночной дериватизацией аминокислот нингидрином в кислотном гидролизате образца на аминокислотном анализаторе INGOSААА-400.
Оценку биологической ценности проводили по методике И.А. Рогова и Н.Н. Липатова по коэффициентам различий аминокислотного скора (КРАС) и биологической ценности (БЦ).
Результаты и их обсуждение. На этапе замораживания формируются кристаллы льда и определяется микроструктура бактериального концентрата. При разработке технологии замороженного бактериального концентрата необходимо определить криоскопическую температуру – температуру начала кристаллизации содержащейся в ней влаги. Динамика изменения температуры при замораживании бактериального концентрата представлена на таблице 1.
Таблица 1
Динамика температуры при замораживании бактериального концентрата
|
Показатель |
Значение |
||||||||||||
|
Продолжительность замораживания, мин |
0 |
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
100 |
110 |
120 |
|
Температура, °С |
10 |
–2,8 |
–1,3 |
–1,5 |
–2,6 |
–9,5 |
–20 |
–23 |
–24 |
–25 |
–25 |
–25 |
–25 |
Из данных таблицы 1 видно, что полученный температурный профиль замораживания бактериального концентрата можно разделить на три участка. В течение 10 мин наблюдается резкое снижение температуры с постоянной скоростью до 2,8 °С. Затем наблюдается повышение температуры и равновесное состояние в течение 30 мин. В течение этого времени происходит кристаллизация влаги, снижение температуры замедляется. Известно, что при зарождении кристаллов происходит выделение скрытой теплоты [9]. Потом температура умеренно уменьшается и через 90 мин наступает полное замораживание льда при температуре минус 25 °С.
При замораживании необходимо обеспечить защиту микроорганизмов от криоповреждений. В качестве криопротекторов использовали глицерин, сахарозу, желатин, широко применяемые для консервирования микроорганизмов и обеспечивающие их высокую выживаемость.
В таблице 2 представлены данные сравнительного анализа протеолитических свойств исследуемых образцов. В качестве контроля использовали исходный инокулят – жидкую курунговую симбиотическую закваску на обезжиренном молоке.
Таблица 2
Влияние криопротекторов на протеолитическую активность
бактериального концентрата при замораживании
|
Образец |
Диаметр зоны просветления вокруг колоний через 48 ч культивирования, мм |
|
Контроль – исходный инокулят |
32+5 |
|
Бактериальный концентрат + желатин |
20+5 |
|
Бактериальный концентрат + глицерин |
45+5 |
|
Бактериальный концентрат + сахароза |
3+2 |
Из представленных в таблице 2 данных следует, что бактериальный концентрат, замороженный с глицерином, проявляет большую протеолитическую активность. Вероятно, это связано с высокой концентрацией микроорганизмов в бактериальном концентрате и смешанным эндо-экстрацеллюлярным действием глицерина на клетки при замораживании.
От протеолитической активности заквасочных культур зависит аминокислотный состав готового продукта [10, 11]. В таблице 3 представлены результаты оценки аминокислотного состава молока, заквашенного бактериальным концентратом с глицерином. Для сравнения использовали образец, заквашенный исходной жидкой курунговой закваской на обезжиренном молоке.
Сквашивание молока проводили в течение 8–10 ч до достижения титруемой кислотности в образцах курунги 120 °Т. Результаты исследования аминокислотного состава образцов представлены в таблице 3.
Таблица 3
Содержание незаменимых аминокислот
|
Аминокислота |
Количество, мг/100 г продукта |
|
|
Курунга на жидкой закваске |
Курунга на ЗБК |
|
|
Валин |
126 |
129 |
|
Лейцин |
218 |
227 |
|
Изолейцин |
148 |
140 |
|
Фенилаланин + тирозин |
179 |
168 |
|
Метионин + цистин |
87 |
84 |
|
Лизин |
218 |
216 |
|
Триптофан |
22 |
22 |
|
Треонин |
112 |
115 |
|
Общее количество незаменимых аминокислот |
1110 |
1101 |
Из данных таблицы 3 видно, что количественное соотношение незаменимых аминокислот в курунге, заквашенной ЗБК и жидкой курунговой закваской, практически не отличается.
Результаты расчета аминокислотного скора исследуемых образцов представлены в таблице 4.
Таблица 4
Аминокислотный скор белков кисломолочных продуктов
|
Аминокислота |
Рекомендуемое кол-во по ФАО/ВОЗ, мг/г белка |
Значение аминокислотного скора, % |
|
|
Курунга на жидкой закваске |
Курунга на ЗБК |
||
|
Валин |
39 |
115 |
117 |
|
Лейцин |
59 |
132 |
137 |
|
Изолейцин |
30 |
176 |
166 |
|
Фенилаланин + тирозин |
38 |
168 |
157 |
|
Метионин + цистин |
22 |
140 |
136 |
|
Лизин |
45 |
173 |
171 |
|
Триптофан |
6 |
133 |
133 |
|
Треонин |
23 |
173 |
178 |
Из таблицы 4 видно, что белки исследуемых кисломолочных продуктов характеризуются полноценным аминокислотным составом. По всем незаменимым аминокислотам во всех образцах наблюдается избыток относительно физиологических потребностей организма человека.
Коэффициент различия аминокислотного скора (КРАС) и биологическая ценность белка (БЦ) указывают предельно возможный уровень использования азота белка на пластические цели (табл. 5).
Таблица 5
Показатели сбалансированности аминокислотного состава
кисломолочных продуктов, %
|
Показатель |
Курунга на жидкой закваске |
Курунга на БКМК |
|
КРАС |
36,5 |
35,37 |
|
БЦ |
63,5 |
64,6 |
Из таблицы 5 видно, что сбалансированность состава незаменимых аминокислот в обоих образцах курунги имеет почти одинаковые значения. Полученные данные свидетельствуют о соответствии биохимической активности бактериального концентрата микробного консорциума естественной курунговой закваске и возможности получения продукта с биологически ценным
составом белка, характерным для традиционного напитка.
Заключение. В результате проведенного исследования установлено, что замораживание бактериального концентрата в течение 90 мин до температуры минус 25 °С с глицерином позволяет сохранить высокую протеолитическую активность закваски и производить курунгу с высокой биологической активностью.
