сотрудник
Омск, Омская область, Россия
Омск, Омская область, Россия
сотрудник
Омск, Омская область, Россия
Омск, Омская область, Россия
ВАК 4.1.1 Общее земледелие и растениеводство
ВАК 4.1.2 Селекция, семеноводство и биотехнология растений
ВАК 4.1.3 Агрохимия, агропочвоведение
ВАК 4.1.4 Садоводство, овощеводство, виноградарство и лекарственные культуры
ВАК 4.1.5 Мелиорация, водное хозяйство и агрофизика
ВАК 4.2.1 Патология животных, морфология, физиология, фармакология и токсикология
ВАК 4.2.2 Санитария, гигиена, экология, ветеринарно-санитарная экспертиза и биобезопасность
ВАК 4.2.3 Инфекционные болезни и иммунология животных
ВАК 4.2.4 Частная зоотехния, кормление, технологии приготовления кормов и производства продукции животноводства
ВАК 4.2.5 Разведение, селекция, генетика и биотехнология животных
ВАК 4.3.3 Пищевые системы
ВАК 4.3.5 Биотехнология продуктов питания и биологически активных веществ
УДК 63 Сельское хозяйство. Лесное хозяйство. Охота. Рыбное хозяйство
УДК 619 Сравнительная патология. Ветеринария
УДК 636.91 Морские свинки
УДК 578.828 Retroviridae. Ретровирусы. РНК-содержащие опухолевые вирусы
УДК 615.281.8 Противовирусные средства
ГРНТИ 68.41 Ветеринария
ОКСО 36.05.01 Ветеринария
ББК 48 Ветеринария
ТБК 5623 Ветеринария
BISAC MED089000 Veterinary Medicine / General
Цель исследования – изучить эффективность иммунных реакций у морских свинок, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, после введения амида бетулиновой кислоты. Проведен эксперимент на 25 морских свинках, разделенных на 5 групп по 5 животных в каждой. Особей 1–4-й групп подвергли инфицированию ВЛКРС внутрибрюшинно взвесью лимфоцитов, выделенных от больной лейкозом коровы. Животным 1–3-й групп вводили производное бетулиновой кислоты подкожно в дозе 40 мкг/мл: 1-й группе – за 2 ч до заражения, 2-й – за 2 ч до и через 7 сут после инфицирования, 3-й группе – за 2 ч до и через 7 и 14 сут после инокуляции патогена. 4-я группа служила в качестве позитивного контроля (без введения препарата), а 5-я – в качестве негативного контроля (интактные). На 45-е и 90-е сут от начала эксперимента производили отбор проб крови для оценки иммунного статуса, а также постановки реакции иммунофлюоресценции (РИФ) прямым и непрямым методом. Иммунологическая перестройка на инфицирование морских свинок ВЛКРС сопровождалась достоверным увеличением к 90-м сут от начала эксперимента числа лейкоцитов в 1,25 раза, а также лимфоидных клеток за счет размножения В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов в 1,5–5,5 раза. Введение до инфицирования животных экспериментального препарата способствовало ингибированию клеточной пролиферации В-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов, усилению деятельности аэробной и анаэробной бактерицидных систем нейтрофилов в 1,18–1,68 раза, а также снижению титров антител в непрямой РИФ. Иммуномодулирующий эффект был наиболее выражен при трехкратном введении препарата, что подтверждалось отсутствием ВЛКРС у 80 % морских свинок, а также уменьшением среднегеометрического титра антител в 1,86 раза. Полученные положительные результаты позволяют предположить возможное использование амида бетулиновой кислоты в области ветеринарии для разработки новых способов неспецифической профилактики лейкоза крупного рогатого скота.
морские свинки, вирус лейкоза крупного рогатого скота, реакция иммунофлюоресценции, иммунный статус, амид бетулиновой кислоты, противовирусная активность
Введение. Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) является онкогенным В-лимфоцитотропным ретровирусом, который можно идентифицировать у 70 % инфицированных этим патогеном только по наличию антител и/или провирусной ДНК, а также по некоторой степени иммунной дисрегуляции, приводящей к значительным экономическим потерям в животноводстве вследствие снижения надоев молока, высокой частоты инфекционных заболеваний и репродуктивной неэффективности [1–3]. Помимо этого, ВЛКРС генетически родственен вирусу Т-клеточного лейкоза человека 1-го типа (HTLV-1), вызывающему у людей злокачественные новообразования лимфоидной и кроветворной тканей, что позволяет рассматривать его как модель для разработки профилактических и терапевтических стратегий против ретровирусных инфекций человека [4, 5].
Несмотря на широкое распространение лейкозной инфекции во многих странах мира и значительный экономический ущерб, наносимый этой болезнью, способов терапевтической элиминации вируса до сих пор не разработано. Осложняет применение лечения, а также традиционных стратегий вакцинации такая особенность цикла репликации ретровируса, как интеграция провируса в клеточный геном, обеспечивающая длительную экспрессию вирусных генов в инфицированных клетках и их потомках [6]. Поэтому для борьбы с этой инфекцией необходима разработка новых различных мер противодействия.
В настоящее время ведется активный поиск химических соединений из природных источников, обладающих противовирусной активностью в отношении ВЛКРС. В одном из таких исследований было показано, что violaceoid E (vioE), обнаруженный в грибах Aspergillus violaceofuscus, препятствует репликации и ингибирует транскрипцию вируса бычьего лейкоза, зависимую от белка Tax посредством прямого взаимодействия [7]. Для борьбы с лейкозной инфекцией могут быть также полезны компоненты, извлеченные из гриба Talaromyces sp., продуцирующего Vanitaracin A и другие вещества [8, 9]. Все это свидетельствует о том, что отдельные метаболические продукты могут служить эффективной структурой для конструирования новых противолейкозных средств.
Привлекательным в этом плане объектом также может служить получаемая из бетулина бетулиновая кислота, которая, как и ее предшественник, присутствует в основном в коре березы, но в меньших количествах – от 0,002 до 2 % в зависимости от метода экстракции [10]. Интерес к данному природному метаболиту вызван его мощными разнообразными биологическими и фармакологическими эффектами, из которых можно выделить противовирусную, противоопухолевую, противовоспалительную и иммуномодулирующую активность [11, 12], а также возможностью усиления выявленных свойств как в комбинации с другими средствами, так и посредством введения в их молекулы фармакофорных группировок [13–15].
В некоторых исследованиях было показано усиление противовирусной активности бетулиновой кислоты при лечении вирусного гепатита С в комбинации с α-интерфероном, телапревиром или софосбувиром [16], а также в отношении вируса гриппа при сочетании производных бетулина с римантадином [17]. Все это указывает на огромный научный интерес к осуществлению целенаправленной химической модификации бетулиновой кислоты.
В недавней нашей работе было продемонстрировано выраженное ингибирующее действие на ВЛКРС при сочетании в одной молекуле бетулиновой кислоты и 1-(адамантан-1-ил)этан1-амина, при этом выбор в качестве фармакофора аминопроизводного адамантана (римантадина) был связан не только с его противовирусной активностью, но в большей степени с антитоксическим и иммуномодулирующим действием, в частности с индукцией выработки α- и γ-интерферонов и усилением функциональной активности T- и B-лимфоцитов [18]. Однако для оценки влияния экспериментального препарата на организм животных необходимо более детальное изучение иммунобиологических реакций.
Цель исследования – изучить эффективность иммунных реакций у морских свинок, инфицированных вирусом бычьего лейкоза, после введения амида бетулиновой кислоты.
Задачи: анализ количественного содержания иммунокомпетентных клеток и функционального состояния нейтрофилов у морских свинок, инфицированных ВЛКРС; оценка иммунологической перестройки на однократное, двукратное и трехкратное введение амида бетулиновой кислоты морским свинкам, инфицированным ВЛКРС; оценка влияния производного бетулиновой кислоты на гуморальный иммунный ответ.
Объекты и методы. Объектом исследования являлись 4–5-месячные морские свинки линии агути, массой 400–500 г, с которыми проводился эксперимент в соответствии с требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.
Бетулиновая кислота и ее амидное производное были получены на кафедре органической и экологической химии Тюменского государственного университета (проф., д-р хим. наук И.В. Кулаков) и предоставлены нам для изучения биологической активности. Общая методика синтеза исследуемого соединения представлена в работе К.А. Barmina et al. (2025) [18].
Для инфицирования животных использовали 1 мл взвеси лимфоцитов, выделенной из свежеполученной стабилизированной крови больной лейкозом коровы центрифугированием на градиенте плотности 17 %-го раствора рентгеноконтрастного вещества (титр вируса в прямой реакции иммунофлюоресценции (РИФ) составил 1 : 2048), внутрибрюшинно.
С целью изучения эффективности иммунных реакций было отобрано 25 клинически здоровых морских свинок, не имеющих по результатам диагностического исследования в прямой РИФ ВЛКРС, для формирования 5 групп по 5 особей в каждой. Животных 1–4-й групп подвергали инфицированию вирусом бычьего лейкоза, а 5-й группы использовали в качестве негативного контроля. Введение химического соединения 1-й опытной группе производили однократно, подкожно в дозе 40 мкг/кг за 2 ч до инокуляции патогена; 2-й – двукратно, за 2 ч до и через 7 сут после инфицирования тем же способом; 3-й – трехкратно, за 2 ч до, а затем на 7-е и 14-е сут после заражения. 4-я опытная группа не была подвергнута обработке экспериментальным препаратом и служила в качестве позитивного контроля. Через 45 и 90 сут от начала эксперимента осуществляли отбор проб крови из ретроорбитального венозного сплетения для диагностических и иммунологических исследований.
Оценку количественного состава цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), Т-, В-лимфоцитов и постановку теста с нитросиним тетразолием в спонтанном (НСТСП) и стимулированном (НСТСТ) вариантах с подсчетом коэффициента стимуляции (КС НСТ) осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями по оценке иммунного статуса при лейкозе крупного рогатого скота [19], а активность внутриклеточных компонентов нейтрофилов (миелопероксидаза (МПО), катионные белки (КБ)) – согласно методам Грэхем-Кнолля с использованием бензидина [20] и М.Г. Шубича с бромфеноловым синим [21]. При анализе мазков подсчитывали процент положительно прореагировавших клеток и в соответствии со стандартными методиками рассчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК).
Для постановки прямой РИФ готовили мазки из взвеси лимфоцитов, выделенных из крови морских свинок центрифугированием в градиенте плотности тразографа®, и окрашивали их сконструированными нами диагностическими флуоресцирующими иммуноглобулинами против ВЛКРС [22]. Непрямую РИФ проводили путем микротитрования сыворотки крови в 96-луночных планшетах (с разведения 1 : 2 до 1 : 4096) с использованием компонентов из набора для диагностики лейкоза в реакции иммунодиффузии (антиген ВЛКРС, положительная сыворотка крови крупного рогатого скота в титре 1 : 2, отрицательная сыворотка крови крупного рогатого скота, ФКП «Курская биофабрика» – «Биок», Россия) и люминесцирующую сыворотку кролика против глобулинов морской свинки (НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). За титр антител принимали предельное разведение сыворотки крови, при котором обнаружены антитела. Учет реакций осуществляли по 4-крестовой системе на микроскопе Axsiostar plus (Carl Zeiss, Германия). За положительный результат принимали специфическое свечение комплекса антигена – антитела с оценкой в 3–4 креста.
Расчет средней геометрической величины титра антител проводили в соответствии с МУ 3.1.2943-11 [23].
Для статистической обработки цифрового материала применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с оценкой значимости различий между группами с помощью F-критерия, а также последующим post-hoc анализом по критерию Тьюки для проведения множественных сравнений. Различия считали достоверными при p < 0,05.
Результаты и их обсуждение. Оценка статистически значимых различий средних значений иммунологических параметров у морских свинок 5-й группы с помощью однофакторного дисперсионного анализа на 45-е сут после введения экспериментального препарата показала наличие неоднородности всех анализируемых показателей: лейкоцитов (F = 11,36; р < 0,001), лимфоцитов (F = 13,91; р < 0,001), Т-лимфоцитов (F = 3,34; р < 0,05), В-лимфоцитов (F = 61,75; р < 0,001), цитотоксических Т-лимфоцитов (F = 26,66; р < 0,001), спонтанного НСТ-теста (F = 13,58; р < 0,001), стимулированного НСТ-теста (F = 4,06; р < 0,05), коэффициента стимуляции НСТ (F = 7,92; р < 0,001), СЦК катионных белков (F = 27,19; р < 0,001) и СЦК миелопероксидазы (F = 5,31; р < 0,001).
Концентрация лейкоцитов была в 1,44 раза (р1 < 0,01) выше у морских свинок, инфицированных ВЛКРС (4-я группа), относительно этого показателя в контрольной группе, тогда как у животных, подвергнутых трехкратной обработке производным бетулиновой кислоты, уровень клеток белой крови был ниже соответственно в 1,50 раза (р2 < 0,01) по сравнению с особями, которым был введен экспериментальный препарат однократно; в 1,46 раза (р3 < 0,01) против соответствующего параметра у морских свинок после двукратного его введения и в 1,68 раза (р4 < 0,001) относительно значений у животных 4-й группы (табл. 1).
Таблица 1
Иммунологические параметры у морских свинок
через 45 сут после инфицирования ВЛКРС, M ± m
Immunological parameters in guinea pigs 45 days after infection with BLV, M ± m
|
Показатель |
Контроль |
1-я группа |
2-я группа |
3-я группа |
4-я группа |
|
Лейкоциты, 109/л |
8,87±0,05 |
11,38±0,71 |
11,04±0,71 |
7,58±0,212,3 |
12,76±0,841,4 |
|
Лимфоциты, 109/л |
5,72±0,34 |
6,37±0,48 |
4,71±0,452 |
4,42±0,222 |
7,94±0,361,3,4 |
|
Т-лимфоциты, 109/л |
1,02±0,04 |
0,79±0,14 |
0,85±0,13 |
0,89±0,06 |
0,52±0,051 |
|
В-лимфоциты, 109/л |
0,47±0,07 |
0,47±0,09 |
0,73±0,09 |
0,33±0,043 |
2,01±0,131,2,3,4 |
|
ЦТЛ, 109/л |
0,74±0,12 |
0,61±0,10 |
0,77±0,08 |
0,30±0,004 |
2,12±0,251,2,3,4 |
|
НСТСП., ед. оп. пл. |
0,15±0,004 |
0,15±0,007 |
0,15±0,008 |
0,15±0,009 |
0,25±0,021,2,3,4 |
|
НСТСТ, ед. оп. пл. |
0,18±0,01 |
0,20±0,02 |
0,15±0,009 |
0,14±0,0062 |
0,20±0,03 |
|
КС НСТ |
1,19±0,13 |
1,38±0,12 |
1,01±0,042 |
0,95±0,022 |
0,82±0,031,2 |
|
СЦК МПО, у.е. |
1,07±0,09 |
1,70±0,151 |
1,52±0,101 |
1,29±0,07 |
1,45±0,02 |
|
СЦК КБ, у.е. |
1,06±0,03 |
1,47±0,061 |
1,29±0,031 |
1,26±0,021,2 |
1,71±0,061,2,3,4 |
Здесь и далее: статистически значимое различие (р1234 < 0,05 и ниже) по критерию Тьюки: 1 – относительно контрольной группы; 2 – относительно 1-й опытной группы; 3 – относительно 2-й опытной группы; 4 – относительно 3-й опытной группы.
Содержание лимфоцитов у особей, инфицированных ВЛКРС, показало выраженные изменения относительно контрольной, а также 2-й и 3-й опытных групп, в которых наблюдали снижение уровня этого параметра соответственно в 1,39 (р1 < 0,01), в 1,68 (р3 < 0,001) и в 1,8 раза (р4 < 0,001). Помимо этого, по сравнению с морскими свинками, подвергнутыми однократному введению производного бетулиновой кислоты, у животных 2-й и 3-й опытных групп, где была предусмотрена неоднократная инокуляция препарата, также происходило снижение концентрации лимфоцитов соответственно в 1,35 (р2 < 0,05) и в 1,44 раза (р2 < 0,05).
У морских свинок, инфицированных ВЛКРС (4-я группа), число лимфоидных клеток увеличивалось за счет пролиферации В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов. В частности их концентрация по сравнению с контрольной группой возрастала соответственно в 4,28 и 2,86 раза (р1 < 0,001), с 1-й группой – в 4,28 и 3,47 раза (р2 < 0,001), со 2-й группой – в 2,75 раза (р3 < 0,001) и по сравнению с 3-й группой – в 6,09 и 7,06 раза (р4 < 0,001). Следует также отметить снижение в 2,1 раза (р3 < 0,05) числа В-лимфоцитов у особей, подвергнутых трехкратной обработке препаратом, относительно этого параметра у животных, которым был введен иммуномодулятор двукратно.
В отличие от других иммунокомпетентных клеток число Т-лимфоцитов подвергалось снижению, но статистически достоверной разницы оно достигало только в группе инфицированных без предварительной обработки препаратом (4-я группа), где относительно контроля их концентрация уменьшалась в 1,96 раза (р1 ˂ 0,05).
Наиболее выраженные изменения иммунной функции нейтрофилов также были зарегистрированы в 4-й опытной группе, в которой наблюдали увеличение спонтанной НСТ активности. Так, относительно значений этого показателя у интактных животных, а также 1–3-х опытных групп, наблюдали усиление тетразолиевой деятельности в 1,67 раза (р1234 ˂ 0,001). Следует отметить, что в случае стимуляции клеточной взвеси антигеном интенсивность внутриклеточного метаболизма не претерпевала существенных изменений, за исключением морских свинок, подвергнутых трехкратной обработке производным бетулиновой кислоты (3-я группа), где уровень генерации активных форм кислорода относительно 1-й опытной группы был ниже в 1,43 раза (р2 ˂ 0,05).
Коэффициент стимуляции НСТ, характеризующий готовность нейтрофилов к завершенному фагоцитозу, относительно контрольной группы имел статистически значимое различие только с группой инфицированных ВЛКРС без введения препарата (4-я группа), в которой этот показатель снижался в 1,45 раза (р1 ˂ 0,05). Помимо этого, относительно значений морских свинок, подвергнутых однократной обработке производным бетулиновой кислоты (1-я группа), зарегистрировано снижение КС НСТ во 2-й группе в 1,37 раза (р2 ˂ 0,05), в 3-й группе – в 1,45 раза (р2 ˂ 0,01) и в 4-й группе в – 1,68 раза (р2 ˂ 0,001).
Ферментная активность миелопероксидазы нейтрофилов, так же, как и НСТ-тест, характеризующая кислород-продуцирующую деятельность бактерицидных систем, имела тенденцию к усилению, особенно это касалось 1-й и 2-й опытных групп, в которых после введения препарата наблюдали возрастание СЦК МПО относительно контроля соответственно в 1,59 (р1 ˂ 0,01) и в 1,42 раза (р1 ˂ 0,05).
Более выраженная трансформация была выявлена при анализе содержания катионных белков нейтрофилов – показателя, ответственного за кислород-независимый внутриклеточный метаболизм. В частности СЦК КБ достигал самых высоких значений у животных, инфицированных ВЛКРС (4-я группа), и был выше в 1,61 раза (р1 ˂ 0,001) по сравнению с интактными особями, а также в 1,16–1,32 раза (р2 ˂ 0,01; р34 ˂ 0,001) относительно 1–3-х групп, в которых была предусмотрена обработка морских свинок препаратом.
Необходимо также отметить, что уровень СЦК КБ в 1–3-х группах относительно контрольной группы также имел значимый рост соответственно в 1,39 (р1 ˂ 0,001), в 1,21 (р1 ˂ 0,05) и 1,19 (р1 ˂ 0,05) раза. Помимо этого, у особей, подвергнутых трехкратному введению экспериментального соединения (3-я группа), активность антимикробных пептидов была в 1,17 раза ниже (р2 ˂ 0,05), чем в группе животных, обработанных однократно (1-я группа).
В соответствии с результатами однофакторного дисперсионного анализа иммунологических параметров морских свинок на 90-е сут эксперимента выявлены статистически значимые различия между группами по содержанию лейкоцитов (F = 6,2; р < 0,01), лимфоцитов (F = 12,99; р < 0,001), В-лимфоцитов (F = 61,6; р < 0,001), цитотоксических Т-лимфоцитов (F = 18,8; р < 0,001), а также по показателям, характеризующим функциональное состояние нейтрофилов, в частности спонтанного НСТ-теста (F = 7,43; р < 0,001), стимулированного НСТ-теста (F = 2,95; р < 0,05), коэффициента стимуляции НСТ (F = 10,8; р < 0,001), СЦК катионных белков (F = 18,6; р < 0,001) и СЦК миелопероксидазы (F = 18,2; р < 0,001).
Анализ иммунологических параметров, представленный в таблице 2, показал, что на 90-е сут после инокуляции патогена наблюдалось значимое повышение численности клеток белой крови только в группе особей, инфицированных ВЛКРС (4-я группа), относительно показателей у интактных животных в 1,25 раза (р1 < 0,05), а также по сравнению с 1-й группой в 1,21 раза (р2 < 0,05) и с 3-й группой в 1,35 раза (р4 < 0,01), в которых была произведена обработка морских свинок амидом бетулиновой кислоты соответственно 1 и 3 раза.
Идентичная тенденция изменений была также характерна для числа лимфоцитов. Так, в 4-й группе морских свинок относительно контроля наблюдалось повышение их количества в 1,53 раза (р1 < 0,001), 1-й группы – в 1,66 раза (р2 < 0,001), 2-й – в 1,32 (р3 < 0,05) и 3-й групппы – в 1,66 раза (р4 < 0,001). Необходимо также отметить, что концентрация лейкоцитов и лимфоцитов у особей, подвергнутых трехкратному введению препарата, в отличие от животных остальных групп имела некоторую тенденцию к снижению по сравнению с контрольными значениями.
Таблица 2
Иммунологические параметры у морских свинок через 90 сут
после инфицирования ВЛКРС, M ± m
Immunological parameters in guinea pigs 90 days after infection with BLV, M ± m
|
Показатель |
Контроль |
1-я группа |
2-я группа |
3-я группа |
4-я группа |
|
Лейкоциты, 109/л |
11,60±0,28 |
12,00±0,56 |
12,62±0,36 |
10,76±0,84 |
14,58±0,60124 |
|
Лимфоциты, 109/л |
6,07±0,31 |
5,59±0,31 |
7,04±0,47 |
5,60±0,63 |
9,29±0,311234 |
|
Т-лимфоциты, 109/л |
0,99±0,05 |
1,09±0,13 |
0,83±0,09 |
1,44±0,35 |
0,81±0,17 |
|
В-лимфоциты, 109/л |
0,76±0,14 |
0,69±0,12 |
1,50±0,052 |
0,90±0,22 |
4,16±0,291234 |
|
ЦТЛ, 109/л |
1,14±0,06 |
0,55±0,02 |
0,71±0,08 |
0,81±0,16 |
2,32±0,301234 |
|
НСТСП., ед. оп. пл. |
0,18±0,005 |
0,21±0,02 |
0,14±0,0072 |
0,18±0,01 |
0,22±0,013 |
|
НСТСТ, ед. оп. пл. |
0,17±0,006 |
0,22±0,02 |
0,16±0,0092 |
0,18±0,007 |
0,20±0,01 |
|
КС НСТ |
0,99±0,04 |
1,04±0,02 |
1,13±0,021 |
0,99±0,023 |
0,91±0,0223 |
|
СЦК МПО, у.е. |
1,17±0,05 |
1,58±0,101 |
1,38±0,08 |
1,94±0,06123 |
1,20±0,0524 |
|
СЦК КБ, у.е. |
1,16±0,08 |
1,59±0,071 |
1,56±0,091 |
1,95±0,0613 |
1,10±0,07234 |
Статистически значимых изменений на 90-е сут, в отличие от предыдущего срока исследования, в содержании Т-лимфоцитов нами не было выявлено, что было связано с усилением пролиферации лейкоцитов и лимфоцитов. Тем не менее следует выделить недостоверное увеличение количества Т-клеток при трехкратном введении экспериментального препарата (3-я группа), несмотря на то, что, как было отмечено ранее, только в этой группе прослеживалось снижение концентрации лейкоцитов и лимфоцитов по сравнению с интактными особями.
Как и в предыдущий срок исследования, происходило выраженное увеличение концентрации В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Так, относительно контрольных значений их количество возросло соответственно в 5,47 (р1 < 0,001) и 2,03 раза (р1 < 0,01), 1-й групппы – в 6,03 и 4,22 раза (р2 < 0,001), 2-й – в 2,77 и 3,27 раза (р3 < 0,001) и 3-й группы – в 4,62 и 2,86 раза (р4 < 0,001). Помимо этого, выявлена достоверная разница в содержании В-лимфоцитов между 1-й и 2-й опытными группами, где у последних наблюдали повышение числа этих клеток в 2,17 раза (р2 < 0,05).
Уровень спонтанной генерации активных форм кислорода приобретал максимальные значения у морских свинок, инфицированных вирусом лейкоза, и был выше в 1,57 раза относительно показателей 2-й группы (р3 < 0,01).
Животные, подвергнутые двукратному введению препарата (2-я группа), также имели более низкую тетразолиевую активность как при постановке спонтанного, так и стимулированного НСТ-теста относительно 1-й опытной группы, в которой эти параметры были выше соответственно в 1,5 (р2 < 0,01) и 1,37 раза (р2 < 0,05).
Наиболее высокие значения коэффициент стимуляции НСТ приобретал у особей, обработанных производным бетулиновой кислоты двукратно (2-я группа), и был выше в 1,14 раза по сравнению с контрольной и 3-й опытными группами (р13 < 0,01), а также в 1,24 раза по сравнению с 4-й группой (р3 < 0,001). Помимо этого, у морских свинок, инфицированных ВЛКРС, этот показатель снижался в 1,14 раза относительно 1-й группы (р2 < 0,05).
В отличие от предыдущего срока исследования уровень СЦК МПО, и особенно СЦК КБ, у особей, инфицированных ВЛКРС (4-я группа), подвергался существенному снижению до уровня контрольной группы, что связано с угнетением деятельности внутриклеточных бактерицидных компонентов нейтрофилов. В то же время независимо от кратности введения экспериментального препарата происходило усиление функциональной активности лейкоцитов. Так, эти два параметра относительно контроля в 1-й группе увеличивались соответственно в 1,35 (р1 < 0,01) и 1,37 раза (р1 < 0,05), во 2-й – в 1,18 и 1,34 раза (р1 < 0,05) и в 3-й – в 1,66 (р1 < 0,001) и 1,68 раза (р1 < 0,001).
Необходимо отметить, что максимальной активности бактерицидные компоненты нейтрофилов достигали в случае трехкратного введения производного бетулиновой кислоты (3-я группа), в значительной мере превышая значения, установленные в других группах. В частности по сравнению с животными 1-й группы СЦК МПО был выше в 1,23 раза (р2 < 0,05), а относительно 2-й группы – в 1,4 раза (р3 < 0,001). Аналогичная траектория изменений была также характерна и для СЦК КБ, но достоверная разница в 1,25 раза была выявлена только относительно 2-й группы (р3 < 0,05).
У морских свинок, инфицированных ВЛКРС, ферментная активность миелопероксидазы была снижена в 1,32 раза относительно 1-й группы (р2 < 0,05) и в 1,62 раза по сравнению с 3-й группой (р4 < 0,001). В свою очередь содержание катионных белков нейтрофилов уменьшалось относительно соответствующего показателя в 1–3-х группах соответственно в 1,44 (р2 < 0,01), в 1,42 (р3 < 0,05) и в 1,77 раза (р4 < 0,001).
По результатам диагностических исследований в прямой РИФ к 90-м сут от начала эксперимента у 100 % особей 4-й опытной группы, у 80 % – 1-й группы и у 20 % животных 2-й и 3-й групп был выявлен ВЛКРС. У морских свинок контрольной группы реакция была отрицательной.
Следует отметить, что в непрямой РИФ у инфицированных морских свинок, которым не был введен препарат, титр антител варьировал от 1 : 128 до 1 : 2048, тогда как при двукратном и трехкратном введении производного бетулиновой кислоты эти значения были ниже. Так, во 2-й опытной группе при обнаружении антигена в прямой РИФ титр антител составил 1 : 128, а при его отсутствии – от 1 : 8 до 1 : 64, а в 3-й опытной группе – 1 : 64 и 1 : 8 соответственно.
В таблице 3 представлены среднегеометрические титры антител у животных 1–4-х групп.
Таблица 3
Влияние амида бетулиновой кислоты на титр антител
в реакции непрямой иммунофлюоресценции, M ± m
Effect of betulinic acid amide on the antibody titer in the indirect immunofluorescence reaction, M ± m
|
Срок исследования, сут |
Титры антител в непрямой РИФ, log2 |
|||
|
1-я опытная группа |
2-я опытная группа |
3-я опытная группа |
4-я опытная группа |
|
|
45 |
7,60±0,93 |
7,20±0,97 |
4,40±0,68 |
9,00±0,712 |
|
90 |
7,00±0,77 |
5,80±0,37 |
4,20±0,731 |
7,80±0,372 |
Примечание: статистически значимое различие (р12 < 0,05 и ниже) по критерию Тьюки: 1 – относительно 1-й опытной группы; 2 – относительно 3-й опытной группы.
Однофакторный дисперсионный анализ среднегеометрических титров антител выявил статистически значимые различия между группами по их содержанию как на 45-е сут (F = 5,38; р < 0,01), так и на 90-е сут эксперимента (F = 6,91; р < 0,01).
Наблюдалось значимое снижение титров антител в 3-й опытной группе относительно особей, инфицированных ВЛКРС (4-я группа), в 2 раза (р1 < 0,01) на 45-е сут и в 1,86 раза (р1 < 0,01) на 90-е сут после инокуляции патогена. Помимо этого статистически достоверная разница среднегеометрических титров антител отмечена между 3-й и 1-й опытными группами, где у животных, подвергнутых однократной обработке препаратом, выявлено их увеличение в 1,67 раза (р2 < 0,05).
Таким образом, инфицирование морских свинок вирусом бычьего лейкоза сопровождалось выраженными изменениями подавляющего большинства анализируемых параметров иммунного статуса. Выявленные отклонения патогномоничны для лейкозной инфекции крупного рогатого скота, в частности ранее в других работах также были описаны пролиферация клеток, несущих рецепторы к С3 компоненту комплемента у коров, инфицированных ВЛКРС [24], цитотоксических Т-лимфоцитов – при экспериментальном заражении овец [25], а также дефекты аэробных и анаэробных бактерицидных систем нейтрофилов [26, 27]. Введение морским свинкам амида бетулиновой кислоты перед инокуляцией патогена способствовало ингибированию клеточного размножения В-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов, а также усиливало деятельность бактерицидных систем нейтрофилов, что связано с иммунологической перестройкой, направленной на снижение вирусной нагрузки, индуцированной действием препарата. Эффективность иммунных реакций повышалась при трехкратной обработке химическим соединением, о чем также свидетельствовало наиболее выраженное снижение титров антител в непрямой РИФ.
Заключение. На основании полученных результатов можно прийти к выводу, что при трехкратном введении с интервалом 7 сут амида бетулиновой кислоты в дозе 40 мкг/кг морским свинкам, инфицированным ВЛКРС, был наиболее выражен иммуномодулирующий эффект, который характеризовался нормализацией числа лейкоцитов, лимфоидных клеток за счет подавления размножения В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов, восстановлением параметров тетразолиевой активности нейтрофилов, а также увеличением количества Т-лимфоцитов в 1,45 раза и нарастанием интенсивности деятельности внутриклеточных компонентов фагоцитов миелопероксидазы и катионных белков в 1,66 и 1,68 раза.
Диагностическое исследование иммунофлюоресцентным методом также указывало на более высокую эффективность трехкратного введения экспериментального препарата, о чем свидетельствовало отсутствие ВЛКРС у 80 % морских свинок, а также снижение среднегеометрического титра антител в 1,86 раза.
1. Polat M., Takeshima S.N., Aida Y. Epidemiology and genetic diversity of bovine leukemia virus // Virol. J. 2017. Vol. 14, N 1. Art. 209. DOI:https://doi.org/10.1186/s12985-017-0876-4.
2. Nekouei O., Van Leeuwen J., Stryhn H., et al. Lifetime effects of infection with bovine leukemia virus on longevity and milk production of dairy cows // Prev. Vet. Med. 2016. Vol. 133. P. 1–9. DOI:https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2016.09.011.
3. Bartlett P.C., Norby B., Byrem T.M., et al. Bovine leukemia virus and cow longevity in Michigan dairy herds // J. Dairy Sci. 2013. Vol. 96. P. 1591–1597. DOI:https://doi.org/10.3168/jds.2012-5930.
4. Nishimori A, Konnai S., Okagawa T., et al. In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection // PLoS One. 2017. Vol. 12, N 4. Art. e0174916. DOI:https://doi.org/10.1371/journal.pone.0174916.
5. Rodríguez S.M., Florins A., Gillet N., et al. Preventive and therapeutic strategies for bovine leukemia virus: lessons for HTLV // Viruses. 2011. Vol. 3, N 7. P. 1210–1248. DOI:https://doi.org/10.3390/v3071210.
6. Altanerova V., Holicova D., Kucerova L., et al. Long-term infection with retroviral structural gene vector provides protection against bovine leukemia virus disease in rabbits // Virology. 2004. Vol. 329, N 2. P. 434–439. DOI:https://doi.org/10.1016/j.virol.2004.09.001.
7. Murakami H., Murakami-Kawai M., Kamisuki S., et al. Specific antiviral effect of violaceoid E on bovine leukemia virus // Virology. 2021. Vol. 562. P. 1–8. DOI:https://doi.org/10.1016/j.virol.2021.06.010.
8. Kamisuki S., Shibasaki H., Murakami H., et al. Isolation, structural determination, and antiviral activities of metabolites from vanitaracin A-producing Talaromyces sp. // J. Antibiot (Tokyo). 2023. Vol. 76, N 2. P. 75–82. DOI:https://doi.org/10.1038/s41429-022-00585-9.
9. Murakami H., Fujikawa Y., Mori M., et al. Development of a novel fluorogenic assay method for screening inhibitors of bovine leukemia virus (BLV) protease and identification of mitorubrinic acid as an anti-BLV compound // Bioscience-Biotechnology-and-Biochemistry. 2023. Vol. 87, N 9. P. 946–953. DOI:https://doi.org/10.1093/bbb/zbad073.
10. Lou H., Li H., Zhang S., et al. A Review on preparation of betulinic acid and its biological activities // Molecules. 2021. Vol. 26, N 18. Art. 5583. DOI:https://doi.org/10.3390/molecules26185583.
11. Renda G., Gökkaya İ., Şöhretoğlu D. Immunomodulatory properties of triterpenes // Phytochem. Rev. 2022. Vol. 21, N 2. P. 537–563. DOI:https://doi.org/10.1007/s11101-021-09785-x.
12. Amiri S., Dastghaib S., Ahmadi M., et al. Betulin and its derivatives as novel compounds with different pharmacological effects // Biotechnol Adv. 2020. Vol. 38. Art. 107409. DOI:https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.06.008.
13. Kutkowska J., Strzadala L., Rapak A. Synergistic activity of sorafenib and betulinic acid against clonogenic activity of non-small cell lung cancer cells // Cancer Sci. 2017. Vol. 108, N 11. P. 2265–2272. DOI:https://doi.org/10.1111/cas.13386.
14. Jaroszewski B., Jelonek K., Kasperczyk J. Drug Delivery Systems of Betulin and Its Derivatives: An Overview // Biomedicines. 2024. Vol. 12, N 6. Art. 1168. DOI:https://doi.org/10.3390/biomedicines12061168.
15. Wimmerová M., Bildziukevich U., Wimmer Z. Selected Plant Triterpenoids and Their Derivatives as Antiviral Agents // Molecules. 2023. Vol. 28, N 23. Art. 7718. DOI:https://doi.org/10.3390/molecules28237718.
16. Lin C.K., Tseng C.K., Chen K.H., et al. Betulinic acid exerts anti-hepatitis C virus activity via the suppression of NF-κB- and MAPK-ERK1/2-mediated COX-2 expression // Br. J. Pharmacol. 2015. Vol. 172, N 18. P. 4481–4492. DOI:https://doi.org/10.1111/bph.13233.
17. Савинова О.В., Павлова Н.И., Бореко Е.И. Использование новых производных бетулина в комбинации с ремантадином для ингибирования репродукции вируса гриппа // Антибиотики и химиотерапия. 2009. Т. 54, № 5-6. С. 16–20. EDN: https://elibrary.ru/RWZXUH.
18. Barmina K.A., Kulakov I.I., Vlasenko V.S., et al. Synthesis and Anti-Leukemia Activity of N-[1-(1-Adamantile)ethyl]-3-hydroxylup-20(29)-en-28-amide // Russ. J. Bioorg. Chem. 2025. Vol. 51, N 4. P. 1715–1724. DOI:https://doi.org/10.1134/S1068162025600473.
19. Власенко В.С., Бажин М.А., Дудоладова Т.С., и др. Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе. Омск: Вариант-Омск, 2010. 31 с. EDN: https://elibrary.ru/SIHVTB.
20. Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. М.: Медицина, 1983. 318 с.
21. Шубич М.Г. Выявление катионного белка в цитоплазме лейкоцитов с помощью бромфенолового синего // Цитология. 1974. № 10. С. 1321–1322. EDN: https://elibrary.ru/QBTHXD.
22. Новикова Н.Н., Власенко В.С., Вишневский Е.А. Прямая реакция иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота // Ветеринария. 2024. № 6. С. 17–21. DOI:https://doi.org/10.30896/0042-4846.2024.27.6.17-21.
23. МУ 3.1.2943-11. Организация и проведение серологического мониторинга состояния коллективного иммунитета к инфекциям, управляемым средствами специфической профилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, корь, краснуха, эпидемический паротит, полиомиелит, гепатит В). Доступно по: https://docs.cntd.ru/document/1200088401. Ссылка активна: 21.10.2025.
24. Surovas V.M., Tamoshiunas V.I. Immunological study of the T- and B-lymphocytes in normal cows and in chronic lympholeukemia // Tsitologiia. 1986. Vol. 28, N 4. P. 437–442.
25. Ward W.H., Dimmock C.K., Eaves F.W. T lymphocyte responses of sheep to bovine leukaemia virus infection // Immunol. Cell Biol. 1992. Vol. 70, N 5. P. 329–336. DOI:https://doi.org/10.1038/icb.1992.42.
26. Narciso V.B., Collet S.G., Girardini L.K., et al. Influence of the Bovine Leukemia Virus on the Immunological Activity by the Neutrophilic Function // Acta Scientiae Veterinariae. 2020. Vol. 48. Art. 1745. DOI:https://doi.org/10.22456/1679-9216.102520.
27. Власенко В.С., Вишневский Е.А. Сравнительная характеристика кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидных систем нейтрофилов при лейкозной инфекции // Вестник КрасГАУ. 2020. № 11. С. 170–174. DOI:https://doi.org/10.36718/1819-4036-2020-11-170-174.
