сотрудник с 01.01.2018 по 01.01.2025
«Федеральный научный центр агробиотехнологии Дальнего Востока им. А.К. Чайки» (лаборатория сельскохозяйственной биотехнологии, ведущий научный сотрудник)
сотрудник
Уссурийск, Приморский край, Россия
Владивосток, Приморский край, Россия
Цель исследования – изучить влияние токсического действия высоких доз цинка (808–1313 мг/л) на жизнеспособность пробирочных растений-регенерантов Fagopyrum esculentum Moench и получить in vitro исходный материал с использованием селективных сред с Zn2+. Объекты исследования – регенеранты гречихи сорта Изумруд, полученные в результате их культивирования на средах с сульфатом меди (161 и 184 мг/л) и микроклонально размноженные на питательных средах Мурасиге-Скуга (МС). Морфологический анализ исследуемых пробирочных микрорастений проводили по показателям: высота растения, длина листовых пластинок, число междоузлий, число листьев, наличие или отсутствие корней, окраска листьев. На 21-е сут выращивания микроклонов на селективных средах с Zn2+ высота растения в среднем составила 0,38–2,01 см (в 3,5–14,1 раза меньше, чем на контроле), длина листовых пластинок уменьшилась до 3,78–8,70 мм, а их количество снизилось на 21,6–66,6 %. Сократилось в 1,9–3,8 раз количество междоузлий. Микрорастения приобрели желто-зеленую окраску, полностью отсутствовал ризогенез. Максимальное негативное воздействие оказали условия с концентрацией 909–1313 мг/л ZnSO4 × 7H2O. Генотипы, полученные в результате отбора с использованием повышенной дозы соли меди (184 мг/л), характеризовались наибольшей стрессоустойчивостью к цинку – корнеобразование наблюдалось на двух исследуемых вариантах последействия соли цинка – 808–909 мг/л (I пассаж на МС), выживаемость регенерантов составила 100 %; после 161 мг/л соли меди корнеобразование отмечено на варианте 808 мг/л ZnSO4 × 7H2O, нежизнеспособным оказалось 3 % микрорастений. Последующий пассаж (II) на МС позволил растениям восстановиться, на всех вариантах возобновился ризогенез. Отобраны наиболее толерантные к тяжелым металлам линии F. esculentum.
гречиха посевная, селективные среды, тяжелые металлы, in vitro
Введение. Гречиха посевная Fagopyrum esculentum Moench – культура многоцелевого использования. Из нее получают продукты питания, лекарства, зеленое удобрение, это прекрасный медонос и богатый источник рутина, катехинов и других флавоноидов [1]. Она обладает высокой пластичностью и большим потенциалом в селекционных программах [2]. Применение биотехнологических методов в выведении новых сортов считается перспективным направлением сельскохозяйственной науки. Селекция F. esculentum с использованием тяжелых металлов (ТМ) в качестве селективных фонов in vitro может быть новым инструментом создания растений с улучшенными показателями и высоким потенциалом устойчивости к средовым абиотическим стрессорам [3].
Влияние селективных сред, содержащих повышенные дозы солей цинка (46–606 мг/л) и меди (6–230 мг/л), на рост и развитие микропобегов гречихи посевной исследовано в более ранних наших работах [4]. Однако существует мнение, что повышение жесткости селективных систем является весьма эффективным методом селекции [5], поэтому изучение токсического воздействия более высоких доз тяжелых металлов на культуру гречихи посевной in vitro может быть перспективным направлением решения селекционных задач.
Цель исследования – изучить влияние токсического действия высоких доз цинка (808–1313 мг/л) на жизнеспособность пробирочных растений-регенерантов Fagopyrum esculentum Moench и получить in vitro исходный материал гречихи с использованием селективных сред с Zn2+.
Объекты и методы. Объектами исследования являлись одноузловые черенки (длина 1,0–1,5 см) регенерантов гречихи посевной сорта Изумруд селекции ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки, которые получали в результате деления стебля пробирочных микрорастений (2–3 нижних междоузлия), ранее прошедших отбор в селективных условиях с CuSO4 × 5H2O в концентрации 161 и 184 мг/л [4]. Изолированные in vitro объекты культивировались в пробирках с ватно-марлевыми пробками при освещенности 4 тыс. лк, температуре 22–25 °С, фотопериоде 16 ч в условиях культуральной комнаты. Приготовление и стерилизация бокса, посуды, инструментов проводились по общепринятым методикам.
Для создания селективных условий использовали соль цинка (ZnSO4 х 7H2O). В основную питательную среду Мурасиге-Скуга [6] (далее МС), содержащую 20 г/л сахарозы и 6 г/л агара, вносили соли цинка в следующих количествах по вариантам опыта: 808, 909, 1010, 1111, 1212 и 1313 мг/л. Контрольным вариантом являлась среда МС с сахарозой и агаром и со стандартным содержанием сульфата цинка 8,6 мг/л. Число пробирок по каждому варианту – 20. Повторение – 5.
Морфологические показатели определяли на 21-е сут культивирования растений на контроле и селективных средах с цинком, а также по окончании последующих пассажей (каждый пассаж длительностью 33 сут) на питательных средах МС. Измеряли высоту каждого пробирочного растения и длину его листовых пластинок, которые выражали соответственно в см и мм, считали число междоузлий и число листьев (шт.), отмечали наличие (+) или отсутствие (-) корней. Окраску листьев определяли визуально по преобладающему цвету всех листовых пластинок растения.
Для ввода данных, обработки исходных данных и статистического анализа использовали пакет программ Microsoft Excel 2010. Программное обеспечение Statistica 6 [7] использовали для выполнения однофакторного дисперсионного анализа. Тест множественного рангового критерия Дункана (p < 0,05) применяли для измерения значимости различий. Результаты выражаются в виде средних значений ± стандартное отклонение.
Результаты и их обсуждение. Исследование устойчивости пробирочных растений-регенерантов линий гречихи сорта Изумруд, полученных в результате отбора после обработки CuSO4 × 5H2O, к высоким дозам цинка и их морфологический анализ проводили на 21-й день культивирования микроклонов на селективных средах (табл. 1).
Все испытуемые линии существенно отставали в развитии по сравнению с контролем, особенно по показателю высота растения, которая в среднем составила 0,38–2,01 см (в 3,5–14,1 раза меньше, чем у растений контрольной группы), и приобретали желто-зеленую окраску. Листовые пластинки стали более мелкими, длиной 3,78–8,70 мм, а их количество снизилось на 21,6–66,6 % по сравнению с контролем. Количество междоузлий уменьшилось в 1,9–3,8 раз. Максимальное негативное воздействие на микроклоны оказали селективные условия с концентрацией от 909 до 1313 мг/л ZnSO4 × 7H2O. Сильная токсическая нагрузка повлияла на корнеобразование (важнейший показатель, отражающий состояние растений в условиях стресса) – ризогенез отсутствовал на всех вариантах. По мнению многих исследователей, токсичность тяжелых металлов, приводящая к снижению роста и развития растений, обусловлена в первую очередь окислительным стрессом, индуцируемым ТМ; в итоге нарушается работа фотосинтетического аппарата и всего растительного организма в целом [8, 9].
Таблица 1
Влияние селективных сред с ZnSO4 × 7H2O на развитие микрорастений гречихи,
толерантных к повышенному содержанию меди, на 21-е сут культивирования
|
Вариант содержания соли цинка |
Высота растения, см |
Число междоузлий, шт. |
Число листьев, шт. |
Длина листовой пластинки, мм |
Наличие корней, +/- |
Окраска листьев |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
Изумруд in vitro после CuSO4 х 5H2O 161 мг/л |
||||||
|
Контроль |
7,03±2,60 c |
3,78±0,44 c |
5,11±0,78 c |
11,33±2,45 c |
+ |
Зеленые |
|
808 мг/л |
2,01±1,32 b |
2,00±0,67 b |
3,80±1,23 b |
7,90±1,66 b |
– |
Зелено-желтые |
|
909 мг/л |
1,44±0,56 b |
1,38±0,52 a |
3,50±1,31 а |
8,13±1,36 b |
– |
Желто-зеленые |
|
1010 мг/л |
0,69±0,28 a |
1,00±0,00 a |
2,80±1,23 a |
6,50±2,17 b |
– |
Желто-зеленые |
|
1111 мг/л |
0,43±0,23 a |
1,00±0,00 a |
2,86±0,69 a |
6,43±1,99 b |
– |
Желто-зеленые |
|
1212 мг/л |
0,56 ±0,40 a |
1,00±0,00 a |
2,60±0,70 a |
4,50±2,99 a |
– |
Желто-зеленые |
|
1313 мг/л |
0,51±0,37 a |
1,00±0,00 a |
2,89±0,93 a |
3,78±2,54 a |
– |
Желто-зеленые |
Окончание табл. 1
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
Изумруд in vitro после CuSO4 х 5H2O 184 мг/л |
||||||
|
Контроль |
6,64±2,75 b |
3,8±0,42 c |
5,10±0,74 b |
11,1±2,42 d |
+ |
Зеленые |
|
808 мг/л |
1,18±0,81 а |
1,60±0,70 b |
3,00±0,67 а |
8,70±2,31 c |
– |
Зеленые |
|
909 мг/л |
0,90±0,62 а |
1,56±0,53 b |
2,33±0,50 a |
7,56±2,40 bс |
– |
Зелено-желтые |
|
1010 мг/л |
0,82±0,29 a |
1,11±0,33 a |
2,67±0,71 a |
7,33±1,80 аbс |
– |
Зелено-желтые |
|
1111 мг/л |
0,47±0,39 a |
1,11±0,32 a |
2,60±0,52 a |
5,70±1,16 ab |
– |
Желто-зеленые |
|
1212 мг/л |
0,56±0,27 a |
1,11±0,33 a |
2,44±0,73 a |
6,89±2,09 аbс |
– |
Желто-зеленые |
|
1313 мг/л |
0,38±0,28 a |
1,11±0,32 a |
2,50±0,71 a |
5,30±2,54 a |
– |
Желто-зеленые |
Здесь и далее: разные строчные буквы (а, b, с, d) в одном и том же столбце по каждому опыту указывают на значимые различия между вариантами при P < 0,05.
При дальнейшем культивировании микроклонов на питательной среде МС со стандартным содержанием ZnSO4 × 7H2O (8,6 мг/л) (I пассаж) в течение 33 сут выявлено, что токсическое влияние тяжелого металла сохранилось, однако растения выглядели менее угнетенными, что выразилось в увеличении показателей морфологического развития (табл. 2). Некоторое превышение над контролем числа междоузлий и листьев по исследуемым вариантам связано с тем, что у многих испытуемых растений на данном этапе опыта появились морфологические изменения: нижние листья были собраны в розетку, при этом наблюдалось уменьшение листовых пластинок в размере, а стебли укорачивались.
Таблица 2
Морфологические показатели регенерантов гречихи
на питательных средах МС после меди и цинка
|
Вариант содержания соли цинка |
Высота растения, см |
Число междоузлий, шт. |
Число листьев, шт. |
Длина Листовой пластинки, мм |
Наличие корней, +/- |
Окраска листьев |
|
Изумруд in vitro после CuSO4 × 5H2O 161 мг/л |
||||||
|
Контроль |
17,1±2,4 c |
5,9±0,9 ab |
6,9±0,9 a |
10,6±1,2 c |
+ |
Зеленые |
|
808 мг/л |
14,2±4,1 bc |
6,9±2,1 b |
9,8±3,3 a |
10,0±1,8 c |
+ |
Зеленые |
|
909 мг/л |
10,7±6,0 b |
7,4±1,5 b |
12,8±5,4 a |
7,6±1,9 b |
– |
Зелено-желтые |
|
1010 мг/л |
8,6±4,3 ab |
6,8±1,0 b |
13,0±5,4 a |
7,5±1,8 b |
– |
Зелено-желтые |
|
1111 мг/л |
10,1±3,9 b |
7,3±1,4 b |
11,5±3,9 a |
7,3±2,0 b |
– |
Зелено-желтые |
|
1212 мг/л |
7,3±5,6 ab |
6,5±2,5 ab |
12,6±5,6 a |
6,2±2,3 ab |
– |
Зелено-желтые |
|
1313 мг/л |
4,2±3,4 a |
4,9±2,8 a |
9,7±6,1 a |
4,8±1,9 a |
– |
Зелено-желтые |
|
Изумруд in vitro после CuSO4 × 5H2O 184 мг/л |
||||||
|
Контроль |
16,5±2,8 c |
5,8±1,0 b |
6,8±1,1 a |
12,8±0,8 d |
+ |
Зеленые |
|
808 мг/л |
16,3±3,4 c |
7,2±1,1 b |
10,1±2,4 abc |
11,0±1,2 cd |
+ |
Зеленые |
|
909 мг/л |
16,0±4,8 c |
7,9±1,2 b |
13,6±6,7 d |
9,2±1,8 bc |
+ |
Зеленые |
|
1010 мг/л |
13,6±3,3 c |
7,8±0,6 b |
12,6±2,2 cd |
7,9±1,9 b |
– |
Зелено-желтые |
|
1111 мг/л |
7,7±4,2 b |
7,3±1,7 b |
11,5±3,6 bcd |
7,5±1,4 b |
– |
Зелено-желтые |
|
1212 мг/л |
8,9±5,6 b |
6,8±2,2 b |
9,3±3,7 ab |
8,5±2,9 b |
– |
Зелено-желтые |
|
1313 мг/л |
5,3±4,0 a |
5,0±3,1 a |
8,6±4,4 ab |
5,3±2,5 a |
– |
Зелено-желтые |
Необходимо отметить, что у линий, полученных в результате последовательного отбора на средах с ТМ при использовании более высокой дозы CuSO4 × 5H2O (184 мг/л), ризогенез наблюдался на двух исследуемых вариантах последействия соли цинка (808–909 мг/л). В то же время у регенерантов, созданных на селективных средах со 161 мг/л соли меди, выявлена меньшая устойчивость к металлическому стрессу – корнеобразование наблюдалось только после культивирования на средах с 808 мг/л сульфата цинка. В итоге выживаемость генотипов, прошедших отбор в селективных системах с более высокой дозой соли меди (184 мг/л), на всех вариантах опыта с Zn2+ составила 100 %, а после 161 мг/л Cu2+ – не выжило 3 % микрорастений. Таким образом, подтверждается факт, что повышенная резистентность к одному стрессору может приводить к увеличению устойчивости к другому [10].
Проявления токсического стресса у полученных микрорастений полностью исчезли при последующем культивировании на питательных средах без токсиканта (II пассаж на МС) (рис.). Морфологические показатели регенерантов по вариантам слабо различались от контроля и между собой. Ризогенез у растений наблюдался на всех вариантах.
Рис. 1. Морфологические показатели регенерантов гречихи, полученных в результате
последовательного отбора на селективных средах с медью и цинком (II пассаж на МС)
Ранее нами указывалось на толерантность клеточно-тканевых культур и микропобегов гречихи посевной к повышенным концентрациям сульфатов меди и цинка in vitro [4]. По мнению N.K. Chrungoo et al. [11], гречиха имеет широкий экологический диапазон пластичности, и, следовательно, она может хорошо расти практически при любых неблагоприятных условиях.
Заключение. Гречиха посевная является культурой весьма пластичной и устойчивой к длительному воздействию высокотоксичных доз цинка, о чем свидетельствует большой процент выживших на селективных средах растений (97–100 %) и быстрое послестрессовое восстановление исследуемых микроклонов. Регенеранты, полученные в результате последовательного отбора на средах с использованием более высоких концентраций меди, показывают повышенную устойчивость к цинку. Отобраны толерантные к токсической нагрузке Cu2+ и Zn2+ генотипы F. еsculentum, которые в дальнейшем могут быть использованы для создания сортов регенерантного происхождения с индуцированными новыми хозяйственно полезными признаками, в т. ч. адаптированных к неблагоприятным условиям почвенного стресса, обусловленного токсичностью тяжелых металлов.
1. Zielińska D., Turemko M., Kwiatkowski, J., Zieliński H. Evaluation of flavonoid contents and antioxidant capacity of the aerial parts of common and Tartary buckwheat plants // Molecules. 2012. Vol. 17 (8). Р. 9668–9682. DOI:https://doi.org/10.3390/molecules17089668.
2. Lee D.-G., Woo S.H., Choi J.-S. Biochemical Properties of Common and Tartary Buckwheat: Centered with Buckwheat Proteomics // Molecular breeding and nutritional aspects of buckwheat. London: Elsevier, Academic Press, 2016. Р. 239–259. DOI:https://doi.org/10.1016/B978-0-12-803692-1.00019-5.
3. Использование методов биотехнологии в селекции гречихи на Дальнем Востоке / Е.Н. Барсукова [и др.] // Вестник ДВО РАН. 2020. № 4 (2012). С. 58–66. DOI: 10.37102/ 08697698.2020.212.4.010.
4. Барсукова Е.Н., Клыков А.Г., Чайкина Е.Л. Использование метода культуры ткани для создания новых форм Fagopyrum esculen-tum Moench // Российская сельскохозяйственная наука. 2019. № 5. С. 3–6. DOI:https://doi.org/10.31857/S2500-2627201953-6.
5. Шуплецова О.Н. Клеточная селекция ячменя на устойчивость к эдафическим стрессам // Биология клеток растений in vitro и биотехнологии: сб. науч. ст. IХ Междунар. конф. М., 2008. С. 444–445.
6. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tussue cultures // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. Р. 473–497. DOI:https://doi.org/10.1098/rstb.2000.0713.
7. Халафян А.А. STATISTICA 6. Статистический анализ данных. М.: Бином-Пресс, 2007.
8. Kaznina N.M., Titov A.F. Effect of Zinc Deficiency and Excess on the Growthand Photosynthesis of Winter Wheat // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. 2017. Vol. 13 (4). Р. 88–94.
9. Effect of copper and zinc on the in vitro regeneration of Rauvolfia serpentine / N. Ahmad [et al.] // Biologia Plantarum. 2015. Vol. 59 (1). Р. 11–17. DOI:https://doi.org/10.1007/s10535-014-0479-5.
10. Зинченко М.А., Дубровная О.В., Бавол А.В. Клеточная селекция мягкой пшеницы на устойчивость к комплексу стрессовых факторов и анализ полученных форм // Изв. Самарского научного центра Российской академии наук. 2013. № 15 (3). С. 1610–1614.
11. Chrungoo N.K., Dohtdong L., Chettry U. Phenotypic Plasticity in Buckwheat // Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. London: Elsevier, Academic Press, 2016. Р. 137–149. DOI:https://doi.org/10.1016/B978-0-12-803692-1.00010-9.
