Последовательной иммобилизацией компонентов сконструирована надмолекулярная индикаторная сис- тема биохимического определения мочевины: целлюло- за - наноалмаз - уреаза. Модифицированные наноалма- зы (МНА) ковалентно иммобилизованы на полимерный носитель (гранулы ДЭАЭ-целлюлозы) с помощью реак- ции нуклеофильного присоединения. Установлено, что данная реакция, проводимая при весовом соотношении компонентов 4:1 (ДЭАЭ-целлюлоза : МНА), позволяет иммобилизовать до 110 мкг наночастиц на 1 мг полиме- ра. Биомаркер (фермент уреаза) был иммобилизован с помощью ковалентной пришивки на полученный компо- зит «полимер - МНА», поверхность которого была предварительно активирована бензохиноном. В срав- нительных экспериментах фермент иммобилизовали на исходные гранулы полимера с помощью неспецифиче- ской адсорбции и ковалентной пришивки. Активность фермента в полученных надмолекулярных комплексах определяли уреазным салицилат-гипохлоритным ме- тодом по образованию окрашенного продукта, который оценивали спектрофотометрически. Показано, что молекулы уреазы могут быть иммобилизованы на гра- нулы ДЭАЭ-целлюлозы посредством адсорбции и кова- лентной пришивки, проявляя после этого функциональ- ную активность в обоих случаях. Однако было показано, что при многоразовом использовании этих индикатор- ных систем для тестирования аналита наблюдается заметная инактивация фермента, что сопровождается снижением выхода окрашенного продукта. В то же вре- мя в сравнительных экспериментах было установлено, что фермент, ковалентно иммобилизованный на компо- зит «ДЭАЭ-целлюлоза - МНА», обладает большей функциональной эффективностью и обеспечивает бо- лее стабильный выход цветного продукта при много- кратном тестировании мочевины. Сравнительные ис- следования показали, что фермент, ковалентно при-шитый на композит «ДЭАЭ-целлюлоза - МНА», облада- ет также большей термостабильностью и значитель- но медленнее теряет активность при многоразовом использовании индикаторной системы для тестирова- ния мочевины при температуре 37 °C по сравнению с ферментом, ковалентно иммобилизованным на поли- мер. Результаты проведенных исследований открыва- ют перспективы конструирования нового класса мно- горазовых систем индикации (надмолекулярных ком- плексов «полимерный носитель - наноалмаз - биомар- кер») для биомедицинской аналитики.
наноалмаз, целлюлоза, уреаза, иммобилизация, надмолекулярный комплекс, индикатор- ная система
1. Artiles M., Rout C.S., Fisher T.S. Graphene-based hy- brid materials and devices for biosensing // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2011. - V. 63. - P. 1352-1360.
2. Fisher P., Fadley C.S. Probing nanoscale behavior of magnetic materials with soft X-ray spectroscopy // Nan- otech. Rev. - 2012. - V. 1. - P. 5-15.
3. Lad A., Agrawal Y.K. Nanodevices for monitoring toxi- cological behavior of therapeutic agent // Rev. Nanosci. Nanotech. - 2012. - V. 1. - P. 217-227.
4. Nanodiamond-based tests systems for biochemical determination of glucose and cholesterol / N.O. Ronzhin, A.V. Baron, E.S. Mamaeva [et al.] // J. Biomater. Nanobiotech. - 2013. - V. 4. - P. 242-246.
5. Yin M., Zhao L., Wei Q., Li H. Rapid colorimetric detec- tion of melamine by H2O2-Au nanoparticles // RSC Adv. - 2015. - V. 5. - P. 32897-32901.
6. Wang Y., Hu S. Applications of carbon nanotubes and graphene for electrochemical sensing of environmental pollutants // J. Nanosci. Nanotech. - 2016. - V. 16. - P. 7852-7872.
7. Bondar V.S., Puzyr A.P. Nanodiamonds for biological investigations // Phys. Solid State. - 2004. - V. 46. - P. 716-719.
8. Physical and chemical properties of modified nanodiamonds / A.P. Puzyr, V.S. Bondar, A.A. Bukayemsky [et al.] // NATO Sci. Ser. II: Math. Phys. Chem. - 2005. - V. 192. - P. 261-270.
9. Colloidal stability of modified nanodiamond particles / N. Gibson, O. Shenderova, T.J.M. Luo [et al.] // Diam. Relat. Mater. - 2009. - V. 18. - P. 620-626.
10. Puzyr A.P., Burov A.E., Bondar V.S. Modification and comparative study of commercial nanodiamonds // Full. Nanotub. Carb. Nanostr. - 2015 - V. 23. - P. 93-97.
11. Nanodiamonds with novel properties: a biological study / A.P. Puzyr, A.V. Baron, K.V. Purtov [et al.] // Diam. Relat. Mater. - 2007. - V. 16. - P. 2124-2128.
12. Nanodiamonds as carriers for address delivery of bio- logically active substances / K.V. Purtov, A.I. Petunin, A.E. Burov [et al.] // Nanoscale Res. Lett. - 2010. - V. 5. - P. 631-636.
13. Оценка активности лизоцима после его ковалентной иммобилизации на наноалмазы детонационного синтеза / Н.О. Ронжин, Е.Д. Посохина, А.В. Барон [и др.] // Вестн. КрасГАУ. - 2016. - № 8. - С. 38-44.
14. Puzyr A.P., Bondar V.S. Method of production of nanodiamonds of explosive synthesis with an increased colloidal stability // RU Patent No. 2252192. - 2005, Bull. № 14.
15. Марч Д. Органическая химия: реакции, механизмы и структура. - М.: Мир, 1988. - Т.3. - 456 с.
16. Конструирование композиционных материалов на основе наноалмазов и разрушаемых биополимеров / В.С. Бондарь, А.П. Пузырь, А.В. Горева [и др.] // Журнал Сибирского федерального университета. Биология. - 2013. - Т. 6. - № 2. - С. 163-174.
17. Brandt J., Andersson L.O., Porath J. Covalent attachment of proteins to polysaccharide carriers by means of benzoquinone // Biochim. Biophys. Acta. - 1975. - V. 386. - P. 196-202.
18. Ready to use p-benzoquinone-activated supports for biochemical coupling, with special applications for laccase immobilization / M.-A. Mateescu, G. Weltrowska, E. Agostinelli [et al.] // Biotechnol. Tech. - 1989. - V. 3. - P. 415-420.
19. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985. - 536 с.
20. Яковлева Г.Е. Ферменты в клинической биохимии: пособие для врачей. - Новосибирск: Вектор-Бест, 2005. - С. 28-29.
21. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material / D. Klemm, B. Heublein, H.P. Fink [et al.] // Angew. Chem. Int. Ed. - 2005. - V. 44. - P. 3358- 3393.
