Россия
УДК 616.98 Специфические инфекции
УДК 579.842 Грамотрицательные факультативные аэробные палочковидные бактерии
УДК 578.347 Сложные вирионы. Вирионы бактериофагов
Цель исследования – научное обоснование и экспериментальное подтверждение комплексного подхода к применению антимикробных препаратов на основе бактериофагов и препарата серебра. Работа выполнена в условиях лаборатории и птицеводческого хозяйства Омской области. Исследования были проведены в два этапа. На первом этапе проводили микробиологическое исследование проб патологического материала, фекалий и элементов технологического оборудования на птицеводческом предприятии. Идентификацию изолированных культур микроорганизмов устанавливали с помощью метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-ассоциированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) с использованием масс-спектрометра VITEK NS и программного обеспечения «Biotyper RTS» (Германия). Чувствительность выделенных микроорганизмов к антибиотикам определяли диско-диффузионым методом. Для экспериментальных исследований использовали противосальмонеллезный штамм Phagum Salmonella enteritidis DS-1, депонированный в коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, и препарат «Арговит» (ООО НПЦ «Вектор-Вита»). На втором этапе исследований было сформировано три опытных группы по 10 гол. цыплят-бройлеров в каждой. Цыплятам первой опытной группы выпаивали суспензию сальмонеллезного бактериофага DS-1 в дозе 0,5 мл. Птице второй опытной группы сальмонелезный бактериофаг DS-1 применяли совместно с препаратом «Арговит» в дозе 0,5 и 1,5 мл соответственно. Третьей группе вводили антибиотик энрофлоксацин, рекомендованный при сальмонеллезах птицы согласно инструкции фирмы-производителя. Моделирование сальмонеллезной инфекции у цыплят-бройлеров проводили посредством заражения 10-суточных цыплят суспензией сальмонелл, перорально из расчета 1•109 КОЕ/мл на 1 голову. Проведенные исследования позволяют констатировать, что сальмонеллезный бактериофаг и препарат «Арговит», созданный на основе кластерного серебра, обладают хорошо выраженными противомикробными характеристиками в отношении бактерий рода Salmonella spp. in vitro. Кроме того, комплексное использование препаратов при лечении экспериментального сальмонеллеза у цыплят-бройлеров способствовало оптимизации энтеромикробиома, снижая уровень условно-патогенных и патогенных бактерий, в частности Salmonella spp.
антибиотикорезистентность, сальмонеллы, бактериофаги, препарат серебра, антибиотики, цыплята-бройлеры
Введение. На протяжении последних десятилетий во многих странах мира регистрируют достаточно высокий уровень рисков, связанных с распространением резистентности возбудителей инфекционных болезней к антибактериальным препаратам [1–5]. Данная тенденция требует системных и безотлагательных исследований по решению проблемы на мировом уровне, что подтверждается принятием Генеральной Ассамблеей ООН Глобального плана действий по борьбе с устойчивостью к противомикробным препаратам. В это же время в Российской Федерации также была утверждена «Стратегия предупреждения и преодоления устойчивости микроорганизмов и вредных организмов растений к лекарственным препаратам, химическим и биологическим средствам на период до 2030 г.». Проведенный анализ показал, что отечественные мероприятия Стратегии отличаются от других национальных программ формированием комплексного подхода к организации межведомственного и междисциплинарного взаимодействий.
К основным задачам отечественной Стратегии относятся:
- совершенствование мер по предупреждению и ограничению распространения и циркуляции возбудителей с антимикробной резистентностью;
- обеспечение системного мониторинга распространения антимикробной резистентности;
- изучение механизмов возникновения антимикробной резистентности и разработка противомикробных препаратов и альтернативных методов для профилактики и лечения инфекционных болезней человека и животных.
Применение препаратов вирулентных (литических) бактериофагов для профилактики и лечения заболеваний, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, является одним из возможных подходов к решению проблемы антибиотикорезистентности [6–10].
В настоящее время доказано, что бактериофаги обладают рядом биологических особенностей, которые дают возможность использовать их в качестве эффективных биологических организмов для терапии заболеваний бактериальной этиологии [10–12].
По мнению ряда ученых, основным механизмом антимикробного действия бактериофагов является лизис бактериальных клеток в результате трансформации метаболизма зараженных клеток на синтез фаговых частиц, которые впоследствии разрушаются за счет активации бактериальных аутолизинов [13].
Неорганические вещества в виде наночастиц, в частности серебра, по данным ряда исследователей, также являются одним из перспективных направлений при разработке антимикробных агентов [14–16].
Современная ветеринарно-санитарная ситуация в птицеводстве, связанная со снижением эффективности применения антимикробных препаратов, выдвигает на первый план поиск новых средств и методов борьбы с инфекциями бактериальной этиологии [16–18].
Анализ литературы показал, что бактериофаги и производные нанокластерного серебра можно применять для профилактики и лечения ряда бактериальных инфекций птиц, в частности сальмонеллеза [19].
Цель исследования – научное обоснование и экспериментальное подтверждение комплексного подхода к применению антимикробных препаратов на основе бактериофагов и препарата серебра.
Материалы и методы. Работа выполнена на кафедре ветеринарной микробиологии инфекционных и инвазионных болезней Омской областной лаборатории и в птицеводческом хозяйстве Омской области. Комплексные микробиологические исследования проводили согласно общепринятым методам. На основании морфологических и культурально-биохимических характеристик, используя определитель бактерий Берджи (1997) и справочник зоопатогенных микроорганизмов (Сидоров М.А. и др. (1995)), проводили таксономическую идентификацию изолированных культур микроорганизмов. Также использовали «Методические указания 4.2.2.723-10. Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды» и руководство «Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды» (1990). Видовую идентификацию выделенных культур проводили с помощью метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-ассоциированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) с использованием масс-спектрометра VITEK NS и программного обеспечения Biotyper RTS (Германия). При этом учитывали, что значение Score ³ 2,0 является критерием надежной видовой идентификации микроорганизмов. Для определения чувствительности выделенных микроорганизмов (Salmonella spp.) к антимикробным препаратам применяли диско-диффузионный метод в соответствии с рекомендациями «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (версия 2021-01). Кроме того, клинические категории устойчивости тестируемых изолятов определены в соответствии с рекомендациями EUCAST раздела «Breakpoint tables for interpretation of MICS and zore diameters» (версия 10,0 от 01.01.2020).
Для экспериментальных исследований использовали противосальмонеллезный штамм Phagum Salmonella enteritidis DS-1, полученный нами из сточных вод и фекалий птиц и депонированный в коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером Ph-1343.
Препарат «Арговит» синтезирован на основе высокодисперсного (кластерного) серебра, стабилизированного низкомолекулярным поливинил-пирролидоном (ООО НПЦ «Вектор-Вита»).
Антагонистическую активность препарата «Арговит» изучали в отношении к выделенным патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Для этого изолированные культуры культивировали на скошенном мясо-пептонном агаре. Затем готовили ряд серийных разведений в стерильной воде до 106 мк/мл. Диски (d = 8 мм), пропитанные раствором препарата «Арговит», размещали на поверхность питательной среды в чашках Петри. Концентрация препарата находилась в пределах от 10 до 100 мкг/мл. В качестве контроля использовали диски, пропитанные стерильной водой.
Для статистической обработки полученных в ходе исследований экспериментальных данных использовали Т-критерий Манна–Уитни с применением прикладного программного пакета MS Exel. Допустимый уровень статистической значимости составил 5 %.
Результаты и их обсуждение. В результате проведенного ретроспективного статистического анализа и собственных исследований установлено, что наиболее часто из проб патологического материала, фекалий, элементов технологического оборудования были изолированы микроорганизмы следующих родов и видов: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa. Также необходимо отметить, что данные микроорганизмы были выделены не только в монокультуре, но и в различных ассоциациях, в частности E. coli + Proteus vulgaris (21,4 %); E. coli + Salmonella spp. (15,9 %); E. coli + Staphylococcus aureus (26,4 %); Salmonella spp.+ Staphylococcus aureus (18,6 %).
Проведенные исследования показали, что культуры Salmonella spp., выделенные из патологического материала, в большинстве случаев проявляли множественную антибактериальную устойчивость к 80 % препаратов от числа активно применяемых в условиях птицеводческих хозяйств региона (табл. 1).
Таблица 1
Определение чувствительности выделенных культур Salmonella
к антибактериальным препаратам
|
Культура микроорганизмов |
Антибактериальные препараты |
|||||||||
|
Т |
К |
Ф |
||||||||
|
Доксилокс ОР |
Каридокс |
Долинк |
Авиамутин |
Трифлон |
Карифлокс |
Энроксил |
Колмик Е |
Энрофлон |
Коноэкс-10 |
|
|
Salmonella enteritidis |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
Ч |
R |
Ч |
R |
|
Salmonella gallinarum |
R |
R |
Ч |
R |
Ч |
R |
Ч |
Ч |
Ч |
R |
|
Salmonella typhimorium |
R |
R |
R |
R |
R |
R |
Ч |
R |
Ч |
R |
Примечание: R – резистентные; Ч – чувствительные; Т – тетрациклины; К – комплексные антибактериальные препараты; Ф – фторхинолоны.
Так, все три вида Salmonella были резистентными к тестируемым антимикробным препаратам тетрациклинового ряда (доксилокс-ОР, каридокс), в несколько меньшей степени к комплексным препаратам из группы фторхинолонов.
В рамках изучения морфологии фага DS-1 методом агаровых слоев установлено, что образуемые негативные колонии диаметром от 1,0 до 3,0 мм имели округлую форму, ровные контурированые края; центральная часть колоний фагов, как правило, прозрачная. На газоне тестируемых культур обнаруживали вокруг зон лизиса просветленные участки размером около 0,5 мм.
При изучении литической активности выделенного сальмонеллезного бактериофага (DS-1) установлено, что она составляет по методу Апельмана 1010, по методу Грациа 2,0·1010. Кроме того, анализ данных, полученных при изучении специфичности бактериофага, показал, что он обладал литическим действием в отношении культур S. enteritidis.
Тестовые исследования препарата «Арговит» показали, что он обладает выраженным антимикробным действием.
Установлено, что препарат «Арговит» уже при концентрации 10 мкг/мл обладал ингибирующим действием в отношении выделенных бактерий (табл. 2).
Таблица 2
Ингибирование роста микроорганизмов препаратом «Арговит»
|
Радиус зоны ингибирования (R)* мм |
Концентрация препарата «Арговит», мкг/мл |
Культура микроорганизмов |
||||
|
Salmonella enteritidis |
Pseudomonas aeroginosa |
Proteus vulgaris |
Escherichia coli |
Staphylococcus aureus |
||
|
10 |
12,0±2,0 |
9,0±0,6 |
10,0±0,5 |
11,0±0,6 |
12,0±2,3 |
|
|
20 |
14,0±1,3 |
13,3±1,2 |
14,0±0,7 |
12,3±0,8 |
13,3±2,2 |
|
|
30 |
15,0±0,6 |
14,0±0,8 |
13,6±0,9 |
13,9±1,2 |
14,3±2,1 |
|
|
40 |
17,0±1,8 |
16,6±1,1 |
15,3±2,0 |
15,0±1,6 |
14,0±2,0 |
|
|
50 |
19,0±0,8 |
17,7±1,6 |
15,9±1,6 |
16,8±2,0 |
15,3±1,9 |
|
|
60 |
20,0±2,3 |
19,1±1,6 |
17,0±2,1 |
16,3±1,9 |
15,8±1,6 |
|
|
70 |
21,0±1,8 |
19,6±1,8 |
17,8±1,7 |
16,9±1,6 |
16,0±1,9 |
|
|
80 |
23,0±2,1 |
22,7±2,2 |
20,3±2,0 |
17,7±1,2 |
17,1±1,6 |
|
|
90 |
24,0±2,6 |
26,0±1,9 |
23,0±2,2 |
21,0±1,6 |
23,0±2,0 |
|
|
100 |
24,0±2,2 |
|
|
|
|
|
Примечание: * – среднее значение 5 наблюдений, P £ 0,05.
На втором этапе исследований было сформировано три опытных группы цыплят-бройлеров по 10 гол. в каждой. Моделирование сальмонеллезной инфекции у цыплят-бройлеров проводили посредством заражения
10-суточных цыплят перорально, суспензией сальмонелл из расчета 1 · 109 КОЕ/мл на 1 голову. Культура Salmonella была предварительно выделена из патологического материала павших цыплят на предприятии. Птице первой опытной группы выпаивали суспензию сальмонеллезного бактериофага DS-1 в дозе 0,5 мл. Цыплятам второй опытной группы сальмонеллезный бактериофаг DS-1 применяли совместно с препаратом «Арговит» в дозе 0,5 и 1,5 мл
соответственно. Третьей группе вводили антибиотик энрофлоксацин, рекомендованный при сальмонеллезах птицы согласно инструкции фирмы-производителя.
Анализ результатов экспериментальных исследований показал, что у цыплят в первой и второй группах установлено достоверное увеличение лактобактерий до 6,27 ± 0,17 и 7,35 ± 0,10 lg КОЕ/г соответственно.
Кроме того, зарегистрировано достоверное увеличение количества бифидобактерий как в первой, так и во второй опытных группах до 6,53 ± 0,09 и 7,01 ± 0,06 lg КОЕ/г соответственно. Указанную тенденцию наблюдали и в отношении лактозопозитивных энтеробактерий. Вместе с тем и в первой, и во второй опытных группах установлено достоверное снижение количества лактозоотрицательных энтеробактерий. Необходимо отметить, что после первого комплексного применения сальмонеллезного бактериофага и препарата «Арговит» экспериментально зараженным цыплятам-бройлерам только в трех из 10 проб фекалий были выделены культуры S. enteritidis.
После второго сочетанного введения указанных препаратов (на 22-е сут) сальмонеллезные культуры не выделяли.
Кроме того, установлено, что сочетанное применение сальмонеллезного бактериофага и препарата «Арговит» у цыплят-бройлеров при экспериментальной сальмонеллезной инфекции увеличивает на 60 % терапевтическую эффективность по сравнению с традиционной схемой с использованием антибиотиков.
Таким образом, проведенные исследования позволяют констатировать, что сальмонеллезный бактериофаг и препарат «Арговит», созданный на основе кластерного серебра, обладают хорошо выраженными противомикробными характеристиками в отношении бактерий рода Salmonella spp. in vitro. Кроме того, комплексное использование препаратов при лечении экспериментального сальмонеллеза у цыплят-бройлеров способствовало оптимизации энтеромикробиома, снижая уровень условно-патогенных и патогенных бактерий, в частности Salmonella spp.
1. Андрюков Б.Г., Недашковская Е.П. Вступая в пост-антибиотиковую эру: перспективные стратегии поиска новых альтернативных стратегий борьбы с инфекционными заболеваниями // Здоровье : Медицинская экология. Наука. 2018. № 3. С. 36–50.
2. Желябовская Д.А. Антибиотикочувствительность и антибиотикорезистентность патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из кишечника новорожденных телят // Вестник КрасГАУ. 2017. № 11(134). С. 27–33.
3. Мурленков Н.В. Проблемы и факторы развития антибиотикорезистентности в сельском хозяйстве // Биология в сельском хозяйстве. 2019. № 4 (25). С. 11–16.
4. Маркелова Н.Н., Семенова Е.Ф. Возможные пути преодоления антибиотикорезистентности нозокомиальных патогенов Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas mal¬tophilia // Антибиотики и химиотерапия. 2018. № 63. С. 11–12.
5. Панин А.Н. Проблема резистентности к антибиотикам возбудителей болезней, общих для человека и животных // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2017. № 5. С. 18–24.
6. Артемов А.В. Биоцидные свойства класс-терного серебра и перспективы его использования в ветеринарии // Ветеринарная патология. 2011. № 3. С. 117–119.
7. Назаров П.А. Альтернативы антибиотикам: литические ферменты бактериофагов и фаговая терапия // Вестник РТМУ. 2018. № 1. С. 5–15.
8. Laverty G., Gorman S.P., Gilmore B.F. The potential of antimicrobial peptides as biocides // Jnt J. Mol Sci 2011, 2(10), 6566–6596.
9. Levin B., Bull J.J., Phage therapy revisited: the population biology of a bacterial infection and its treatment with bacteriophage and antibio¬tics // Am Naturalist, 1996, 147, 881–98.
10. Степанов Д.Н. Обоснование комплексного применения бактериофагов и препарата Агровит для профилактики и лечения сальмонеллеза кур в промышленном птицеводстве: дис. … канд. ветеринар. наук: 06.02.02. Омск, 2017. 133 с.
11. Introducing yesterday’s phage therapy in today’s medicine / J. Pirnay [et al.] // Future Virol 2012, 7(4), 379–390.
12. Use of bacreriophage in the treatment of experimental animal bacteremia from imipenem – resistant Pseudomonas aeruginosa / I. Wang [et al.] // Intern. J Molecul Med 2006, 17 (2), 309–317.
13. Wittebole X., de Roock S., Opal S.M. A historical overview of bacteriophage therapy as an alternative to antibiotics for the treatment of bacterial pathogens // Virulence 2013, 4(8), 1–10.
14. Шульга Н.Н., Шульга И.С., Плавшак Л.П. Антибиотики в животноводстве – пути решения проблемы // Тенденции развития науки и образования. 2018. № 35-4. С. 52–55.
15. Пискаева А.И., Дымлюк Л.С., Сидорин Ю.Ю. Влияние кластерного серебра на патогенную микрофлору органических отходов агропромышленного комплекса // Техника и технология пищевых производств. 2016. Т. 41, № 2. С. 132–141.
16. Савинова Е.П. Бактерицидная и дезинфицирующая активность препаратов кластерного серебра // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологию. 2014. № 11. С. 44–48.
17. Неклюдов Н.А., Чепелова Н.К. Антибиотикорезистентность у бактерий: поиск инновационных методов преодоления // World science: problems and innovations: сб. ст. XIX Междунар. науч.-практ. конф. Пенза, 2018. С. 287–289.
18. Плешакова В.И., Степанов Д.Н., Золотова Н.С. Лечение и профилактика сальмонеллеза кур // Вестник Омского государственного аграрного университета. 2015. № 1(17). С. 51–54.
19. The potential of nitric oxide releasing therapies as antimicrobial agents / D.O. Schairer [et al.] // Virulence 2012, 3(3), 271–278.
