Цель – обзор отечественного и зарубежного опыта изучения и производства заквасочных культур методом сублимационной сушки. Молочнокислые бактерии являются одними из наиболее распространенных микроорганизмов, используемых в пищевой промышленности. Они иг¬рают важную роль в производстве кисломолочных продуктов, сыров, творога и других молочных продуктов. Однако для их использования необходимо культивировать и сохранять заквасочные культуры, что требует определенных технологических процессов. Существует несколько методов культивирования и хранения молочнокислых бактерий, одним из которых является метод сублимационной сушки. Этот метод позволяет сохранять заквасочные культуры в течение длительного времени без потери их жизнеспособности и активности. Основная задача исследования заключается в анализе научных статей, публикаций и отчетов о применении метода сублимационной сушки для производства заквасочных культур. В ходе исследования выявлены основные преимущества и недостатки данного метода, а также определены условия культивирования и сублимации заквасочных культур. Важным результатом исследования является создание базы данных, которая поможет оптимизировать производство заквасочных культур и создать новые логистические сети в пищевой промышленности. База данных будет содержать информацию о применении метода сублимационной сушки для производства различных видов заквасочных культур, а также о режимах культивирования и сублимации. Результаты исследования могут быть использованы в пищевой промышленности для создания новых продуктов на основе заквасочных культур, а также для оптимизации производства существующих продуктов. Кроме того, исследование может быть полезным для научных работников, занимающихся изучением заквасочных культур и методов их производства.
закваски, криоконсервация, молочнокислые бактерии, криопротектор
Введение. Пищевые продукты и биологически активные вещества производятся с помощью таких микроорганизмов, как вирусы, бактерии, дрожжи, споры грибов и простейшие. В свою очередь, молочнокислые бактерии используются для производства кисломолочных продуктов, таких как сыры, творог и многие другие. Совершенствование технологий для организации производства культур – одно из наиболее перспективных направлений пищевой промышленности [1–5].
В последнее время в российском пищевом бизнесе наблюдается множество технологических изменений. Нарушение сложившихся цепочек поставок заквасок, реагентов, оборудования в результате пандемии коронавируса в 2019 г. оказало существенное влияние на развитие отрасли.
Недостаточность отечественной технологии производства заквасочных культур и производителей оборудования, необходимость развития технологических процессов, создание новых логистических сетей – актуальные проблемы пищевой отрасли
Цель исследования – обзор отечественного и зарубежного опыта изучения и производства заквасочных культур методом сублимационной сушки.
Задачи: изучение технологии и методики лиофилизации заквасочных культур, используемых в различных странах; определение основных параметров и условий лиофилизации, которые влияют на качество заквасочных культур.
Объекты. Объектом настоящего обзора является технология культивирования и лиофилизации молочнокислых бактерий, применяемых в пищевой промышленности.
Результаты и их обсуждение
Накопление бактериальной массы
Накопление бактериальной массы является важным этапом культивирования бактерий и является необходимым для получения достаточного количества бактерий для дальнейших исследований или производства биологических продуктов. Факторы, влияющие на накопление бактериальной массы при культивировании, могут быть различными и зависят от условий, в которых происходит культивирование.
Один из основных факторов, влияющих на накопление бактериальной массы, – это тип и состав питательной среды [7]. Различные виды бактерий могут требовать разных компонентов питательной среды для роста и размножения. Некоторые бактерии могут производить экзотоксины, которые убивают другие виды бактерий [8], что может привести к низкому накоплению бактериальной массы. В промышленности существует риск контаминации и поражения заквасочных культур бактериофагами, способными привести к гибели молочнокислых бактерий [9].
Температура также является важным фактором, влияющим на накопление бактериальной массы. Различные виды бактерий имеют оптимальные температуры для роста и размножения. Если температура слишком высокая или низкая, это может привести к замедлению роста бактерий и низкому накоплению бактериальной массы.
К другим факторам, влияющим на накопление бактериальной массы, относятся pH питательной среды, содержание кислорода в среде, наличие антибиотиков или других ингибиторов роста, а также интенсивность перемешивания и аэрации в культуре. Все эти факторы могут оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на накопление бактериальной массы. Анализ открытых источников литературы выявил 15 наиболее важных факторов, представленных на рисунке 1, способных повлиять как на накопление биомассы, так и на конечный результат лиофилизации – выживаемость бактерий [10–13].
Рис. 1. Факторы, влияющие на накопление бактериальной массы при культивировании
Кроме вышеперечисленных факторов, при культивировании бактерий также необходимо учитывать состав мембраны бактерий, поскольку он может влиять на проницаемость и способность бактерий к поглощению питательных веществ. Также важен выбор правильного метода пассажа, который позволяет сохранить стабильность генетического материала бактерий при последовательных пересевах. Вид и штамм бактерий также могут влиять на эффективность культивирования, поскольку различные виды и штаммы могут иметь разные требования к условиям культивирования и чувствительность к антибиотикам и ингибиторам роста [14].
При культивировании бактерий необходимо учитывать все эти факторы для достижения максимального эффекта и получения качественной бактериальной массы.
Известно, что при снижении температуры большинство биологических и химических реакций замедляется, что и приводит к консервации процессов. Анабиотическое состояние, в которое возможно искусственно ввести микроорганизмы, является основой всех эффективных методов хранения образцов [11, 15–23]. Однако процесс заморозки зачастую губителен для клеток, органелл и других структур ввиду образования интра- и экстраклеточных кристаллов воды [15].
Лиофилизация бактериальной массы
Для сохранения видового состава и разнообразия, стабилизации бактериальных клеток, уменьшения энергозатрат при хранении проводят лиофильную сушку. Лиофильная сушка является наиболее распространенным методом сохранения биологических объектов, в том числе молочнокислых бактерий, что облегчает их хранение и транспортировку без трудоемкой и дорогостоящей холодильной цепи. В основе лиофильного высушивание лежит двойной фазовый переход: вода–лед (замораживание) и лед–пар (сублимация) [11, 16, 20]. На процесс лиофилизации влияет множество факторов: скорость заморозки, тип криопротектора, изначальная концентрация микроорганизмов и другие, представленные на рисунке 2. В рамках работы было изучено более трехсот публикаций отечественных и зарубежных исследовательских групп, из которых было отобрано 16 наиболее важных факторов, влияющих на выживаемость бактерий при лиофилизации. Для успешной выживаемости бактерий следует не только учитывать вышеупомянутые факторы, но также условия хранения высушенных образцов, например температуру хранения. Более того, следует принять во внимание степень обезвоживания образцов [18, 24–26].
Рис. 2. Факторы, влияющие на выживаемость бактерий при лиофилизации
В основе низкотемпературного хранения образцов лежит процесс замерзания воды и концентрации растворенных веществ в незамерзшей жидкой фазе. Считается, что механическое повреждение вызвано кристаллами льда, образованными при снижении температуры [18]. Ввиду этого необходимым является использование веществ, предотвращающих формирование льда, – антифризов или криопротекторов. Процесс криозащиты заключается в способности реагента предотвращать нуклеацию. Это необходимо, поскольку нуклеация вызывает разрушение таких структур, как лизосомы. Более того, нуклеация часто приводит к летальному исходу [24]. Криоконсервация является эффективным методом долгосрочного хранения образцов. Благодаря данному методу не только снижаются временные и финансовые затраты, но также обеспечивается стабильность образцов, поскольку риски генетических изменений снижаются [12].
В качестве лиоопротекторов могут выступать многие вещества: углеводы (трегалоза, сахароза), полисахариды, спирты (глицерин), натуральные биополимеры (белки, полисахариды) и другие [12, 14, 15, 18, 27, 28]. Однако не все традиционно используемые криопротекторы (например, ДМСО) могут быть применены в пищевой промышленности ввиду их токсичности. Зачастую для лиофилизации создают многокомпонентный криопротектор, используя комбинацию соединений с различными защитными свойствами [7, 10, 12].
Действие криопротектора обусловлено предотвращением физико-химических и фазовых превращений вследствие осмотического обезвоживания бактериальных клеток – предупреждением образования внутриклеточных кристаллов льда, органических и минеральных солей, которые вызывают разрыв клеточной стенки. Наличие криопротектора также определяет процесс оттаивания, который может сопровождаться перекристаллизацией [23]. При медленном подводе тепла меньшие по размеру кристаллы льда могут перекристаллизовываться в более крупные, неоднородные по форме, что может вызвать разрыв клеточных структур и повреждение клеточной стенки.
Разработка композиций криопротекторов и изучение взаимодействия их молекул с клеточной стенкой бактерий позволит оптимизировать разработку криозащитных добавок для заквасок молочнокислых бактерий, применяемых в пищевой промышленности, а также создание базы данных для дальнейшего изучения данной области с применением алгоритмов и методов машинного обучения [29].
Заключение. В рамках данной работы был проведен обширный анализ отечественной и зарубежной литературы по культивированию молочнокислых бактерий и их дальнейшей лиофилизации. Целью данного анализа являлось определение параметров для создания базы данных, которая будет способствовать развитию цифровой модели процесса лиофилизации бактерий. Для достижения цели были изучены различные источники информации, включая научные статьи, книги, патенты и другие материалы. Были проанализированы различные аспекты процесса культивирования молочнокислых бактерий, такие как условия роста, состав среды, температура, pH и другие факторы. Также были изучены факторы, влияющие на дальнейшую лиофилизацию молочнокислых бактерий, такие как методы замораживания, тип сушки, скорость замораживания и другие параметры. В результате анализа была создана база данных, которая включала информацию о наиболее эффективных методах культивирования молочнокислых бактерий и их последующей лиофилизации. Эта база данных может быть использована для разработки новых методов культивирования молочнокислых бактерий и их дальнейшей обработки, а также для оптимизации существующих процессов. Кроме того, она может быть полезна для исследователей, занимающихся различными аспектами молочнокислых бактерий, включая их использование в пищевой промышленности, медицине и других областях.
1. Изучение влияния БАВ лекарственных растений на рост и развитие молочнокислых микроорганизмов и бифидобактерий / Т.В. Герасимова [и др.] // Техника и технология пищевых производств. 2012. № 1 (24). С. 26–30.
2. Ноговицина Е.М. Использование бактерий для получения биологически активных сое-динений на основе растительных стеролов // Вестник Пермского федерального исследовательского центра. 2013. № 2. С. 4–12.
3. Носов А.М. Использование клеточных технологий для промышленного получения биологически активных веществ растительного происхождения // Биотехнология. 2010. № 5. С. 8–28.
4. Biologically active metabolites of Bacillus subtilis and their role in the control of phytopa-thogenic microorganisms / T.M. Sidorova [et al.] // Agricultural biology. 2018. Т. 53, № 1. P. 29–37.
5. A review of the microbial production of bioactive natural products and biologics / J.V. Pham [et al.] // Frontiers in microbiology. 2019. Т. 10. P. 449147.
6. Трифонова Е.Н. Взаимосвязь темпов роста отечественной пищевой и перерабатывающей промышленности и тенденций развития государственной денежно-кредитной политики // International agricultural journal. 2020. № 2. С. 25–35.
7. David P.R. Cryocrystallography: basic theory and methods // Practical protein crystallo-graphy, 2nd edn. Academic Press, San Diego, CA. 1999. P. 409–443.
8. Effects of lyoprotectant and encapsulated Lactobacillus acidophilus KBL409 on freeze-drying and storage stability / J. Lee [et al.] // LWT. 2023. Т. 182. P. 114846.
9. Сорокина Н.П., Перфильев Г.Д. Активность заквасочной микрофлоры: причины снижения и способы повышения. Методы предотвращения поражения молочнокислых бактерий бактериофагами // Молочная промышленность. 2013. № 11. С. 32–35.
10. Pegg D.E. Principles of Cryopreservation // PreservAtion of HumAn oocytes. 2009. С. 34–46.
11. Кириленко М.А., Кузнецов О.Ю., Дмитриева Ж.М. Влияние криоконсервации на выживаемость комплекса аутоштаммов лактобактерий при хранении и процессах биотехнологического масштабирования // Вест¬ник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2019. Т. 15, № 2. С. 5.
12. Cryopreservation: A review article / A.N. Jais-wal [et al.] // Cureus. 2022. Т. 14, №. 11.
13. Харитонова И., Просеков А.Ю., Шрамко М.И. Изучение качественных характеристик концентратов лактобактерий в процессе криозамораживания и сублимационной сушки // Вестник Северо-Кавказского федерального университета. 2015. № 2. С. 87–90.
14. Wolkers W.F., Tablin F., Crowe J.H. From anhydrobiosis to freeze-drying of eukaryotic cells // Comparative Biochemistry and Physio-logy Part A: Molecular & Integrative Physiology. 2002. Т. 131, № 3. P. 535–543.
15. C18: 1 improves the freeze-drying resistance of Lactobacillus plantarum by maintaining the cell membrane / G. Wang [et al.] // ACS Applied Bio Materials. 2020. Т. 3, № 8. P. 4933–4940.
16. Влияние добавления маннозы и фукозы в защитную среду на физиологическую активность лиофилизированных молочнокислых микроорганизмов / А.А. Толкачева [и др.] // Актуальная биотехнология. 2012. № 2. С. 7–11.
17. Подбор параметров стабилизации (замораживание и сушка) симбиотического консорциума с целью получения закваски прямого внесения / В.Ю. Крумликов [и др.] // Техника и технология пищевых производств. 2016. Т. 42, № 3. С. 25–30.
18. Моделирование кристаллизации влаги при замораживании бактериальных заквасок / Е.В. Короткая [и др.] // Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50, № 2. С. 252–260.
19. Пойманов В.В., Ященко С.М., Барыкин Р.А. Исследование процесса вакуум-сублима-ционной сушки бактериальных концентратов для мясной отрасли с использованием криозамораживания // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. 2016. № 1 (67). С. 25–30.
20. Занданова Т.Н. Выбор криопротекторов для замораживания бактериального концентрата симбиотической закваски // Вестник КрасГАУ. 2021. № 3 (168). С. 163–168.
21. Макаренко Н. Криоконсервация бифидобактерий // Наука и инновации. 2010. Т. 9, № 91. С. 53–54.
22. Криоконсервация: перспективный метод хранения промышленно ценных штаммов молочнокислых бактерий и дрожжей / О.А. Сав¬кина [и др.] // Сельскохозяйственная биология. 2014. № 4. С. 112–119.
23. Effect of physical properties on the stability of Lactobacillus bulgaricus in a freeze-dried galacto-oligosaccharides matrix / E.E. Tym-czyszyn [et al.] // International Journal of Food Microbiology. 2012. Т. 155, № 3. С. 217–221.
24. Охапкина В.Ю. Методы поддержания микробных культур. Ч. 2. Лиофилизация // Теоретическая и прикладная экология. 2009. № 4. С. 21–32.
25. Вакуумная сушка бактериальных концентратов и заквасок молочнокислых бактерий / Н.Э. Каухчешвили [и др.] // Молочная промышленность. 2011. № 5. С. 30–31.
26. Effect of ginseng polysaccharide on the stability of lactic acid bacteria during freeze-drying process and storage / S.H. Yang [et al.] // Archives of pharmacal research. 2006. Т. 29. P. 735–740.
27. Богданов В.Д., Панкина А.В. Криопротекторы в холодильных технологиях продуктов питания // Труды ВНИРО. 2023. Т. 191. С. 142–155.
28. Грачева И.В., Осин А.В. Механизмы повреждений бактерий при лиофилизации и протективное действие защитных сред // Проблемы особо опасных инфекций. 2016. №. 3. С. 5–12.
29. The trehalose myth revisited: introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state / J.H. Crowe [et al.] // Cryobiology. 2001. Т. 43, № 2. P. 89–105.