Россия
УДК 636 Общее животноводство. Разведение млекопитающих животных и птиц. Скотоводство. Домашние животные и их разведение
Цель исследования – изучение связи между бактериальной контаминацией спермы быков-производителей с биологической полноценностью сперматозоидов, а также показателями воспроизводства. Объектом исследования были быки-производители голштинской породы (n=17). Материалом для исследования служила замороженно-оттаянная сперма быков-производителей в количестве 61 пробы. Микробиологические исследования спермодоз проводили с использова¬нием стандартных питательных сред в соответствии с ГОСТ 32222-2013.Определение общего количества микроорганизмов вычисляли по числу выросших колонобразующих единиц (КОЕ/мл) в 1 см3, с последующим определением их морфологических свойств. Подвижность и морфологию сперматозоидов определяли с помощью программы «Аргус CASA». Состояние ДНК в сперматозоидах изучали методом акридин-оранжевого теста (АО-тест) с применением флуоресцентного микроскопа. В результате исследования установлена высокая положительная корреляционная зависимость (r = +0,940**) между количеством микроорганизмов в сперме и патологией в отдельных сегментах сперматозоидов. Дисперсионный анализ подтверждает статистически значимое влияние количества микроорганизмов на морфологию сперматозоидов F = 123,2 (p = 0,000). Корреляционная взаимосвязь между индексом фрагментации и содержанием микроорганизмов имеет высокое значение (r = +0,965**). Подвижность сперматозоидов отрицательно коррелирует (r = –0,768**) с количеством микроорганизмов (КОЕ/мл). При наличии в образцах Mycoplasma spp количество коров с плодотворным осеменением составило 35,5 % за счет снижения подвижности, морфологии и высокой фрагментации ДНК сперматозоидов (58 %). Подвижность сперматозоидов в образцах с содержанием Mycoplasma spp в среднем составляет 24,5 %, в образцах без содержания этих микроорганизмов – 48,9 %. Таким образом, можно предположить, что наличие в образцах Mycoplasma spp и высокие показатели бактериальной обсемененности приводят к снижению показателей воспроизводства у производителей.
морфология, фрагментация ДНК, активность сперматозоидов, микробная обсемененность, качество спермопродукции, воспроизводство
Введение. Рентабельность отрасли животноводства определяется уровнем воспроизводства поголовья и количеством произведенной продукции. В частности, использование высокоценных производителей, обладающих хорошим генетическим потенциалом по качественным и количественным показателям, будет способствовать созданию конкурентоспособной отрасли и решению вопросов импортозамещения.
В условиях интенсивного развития отрасли репродуктивная система производителей постоянно подвергается влиянию различных факторов биотической и абиотической природы, которые приводят к снижению фертильности или идиопатическому бесплодию [1–4].
Одной из причин развития идиопатического бесплодия могут являться иммуногенные дефекты, генетические нарушения, воспаления и инфекционные проблемы [5]. Воспаление прямо или косвенно ухудшает сперматогенез и функцию сперматозоидов за счет выработки антител сперматозоидов и активных форм кислорода (АФК), которые приводят к нарушению целостности ДНК [6]. Контаминация патогенными бактериями репродуктивных путей самцов представляет большую угрозу маточному поголовью и является причиной их бесплодия. Так, у крупного рогатого скота болезни органов размножения производителей [7] или использование некачественной спермы [8] способствуют возникновению у коров длительного бесплодия.
Более остро проблема заготовки и хранения качественного семени стоит в индустрии искусственного осеменения, так как риск распространения инфекционных заболеваний через контаминацию половых путей самок от производителей-бактерионосителей остается потенциально высоким [9].
Обсеменение спермы микробными ассоциациями и грибами чаще всего происходит во время забора спермы у животного (нарушение волосяного покрова, гиперемия препуциальной полости, травмы), из-за неудовлетворительных санитарно-гигиенических условий в помещении (загрязнение воздуха в случном манеже) [10, 11], во время фасовки и хранения спермы, при нарушении порядка и режима в лаборатории (грязная лабораторная посуда, инструменты, разбавители, небрежная эквилибрация), а также от производителей-бактерионосителей [12].
По данным С.П. Яцентюк с соавт., в спермодозе от быков из отечественных племенных центров и спермы, разделенной по полу, были выявлены: вирус герпеса (BovineHerpesvirus 1, BHV1) – 1,94 %; Campylobacter Spp – 84,4; Histophilussomni – 90,2; C. jejuni – 18,4; Mycoplasma spp – 91,2 %. Наличие Mycoplasma spp. в репродуктивном тракте здоровых животных оказывает негативное влияние на репродуктивные качества семени [13]. По данным [14], в пробах семени быков спермодоноров из российских племенных хозяйств у 23,6 % обнаружили геном возбудителей микоплазмозов КРС, и наиболее чаще выявляли геном M. Bovigenitalium. На территории Уральского региона у крупного рогатого скота было выявлено коинфицирование M. bovis и M. bovigenitalium в 17,2 % пробах [15].
Способность микоплазм (Mycoplasma spp.) контаминировать сперму быков-производителей отмечается в работах российских и зарубежных авторов [16–18]. Микоплазмы изменяют концентрацию, подвижность [19] и морфологию [20] сперматозоидов. Более того, отмечается фрагментация ДНК сперматозоидов относительно неинфицированных производителей [21, 22]. Также было показано, что при выявлении M. bovigenitalium в образцах спермы быков подвижность сперматозоидов снижается [23].
Проведенные исследования показывают, что наличие в сперме микоплазмы (Mycoplasma spp.) оказывает влияние на параметры спермопродукции и фрагментацию ДНК сперматозоидов, что приводит к снижению фертильности производителей, однако вопрос остается спорным и требует дальнейшего изучения.
Цель исследования – изучение влияния бактериальной контаминации спермы быков на биологическую полноценность сперматозоидов и показатели воспроизводства.
Задачи: провести микробиологические исследования замороженно-оттаянной спермы быков-производителей; определить активность сперматозоидов в исследуемых пробах спермодоз; изучить степень фрагментации ядерной ДНК в сперматозоидах; определить влияние микробной контаминации спермопродукции на воспроизводительные показатели стада.
Объекты, материалы и методы. Исследование проводили в лаборатории клеточной инженерии ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста».
Объектом исследования были быки-производители голштинской черно-пестрой породы (n = 17). Материалом для исследования служила замороженно-оттаянная сперма быков-производителей в количестве 61 пробы. Микробиологические исследования спермодоз проводили с использованием стандартных питательных сред в соответствии с ГОСТ 32222-2013 [24]. Посевы инкубировали. Определение общего количества микроорганизмов вычисляли по числу выросших колонобразующих единиц (КОЕ/мл) в 1 см3, с последующим определением их морфологических свойств. Подвижность и морфологию сперматозоидов определяли с помощью программы «Аргус CASA». Состояние ДНК в сперматозоидах изучали методом акридин-оранжевого теста (АО-тест) с применением флуоресцентного микроскопа, оснащенного кубом флуоресцентных фильтров GFP-LEX460-500 DM 505BA510 с окуляром 15х и объективом 20х, 40х, 100x [25].
Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью пакета программ MS Excel и SPSS Statistics 23.
Результаты и их обсуждение. Активность сперматозоидов является одним из важнейших показателей, характеризующих качество спермы. Содержание сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением в среднем составило 46,2 % (от min = 19,1 % до max = 69,2 %). Наименьшая подвижность была отмечена у быков №1 (25,4 %), № 13 (19,1 %) и № 17 (29 %), у остальных производителей активность составила от 41 до 69,2 %, что соответствует нормативным величинам.
Общее количество сперматозоидов с патологической морфологией колебалось от 8,3 до 19,4 %, среди патологических дефектов преобладали аномалии жгутика. Корреляционный анализ показывает высокую положительную взаимосвязь (r = +0,940**) между количеством микроорганизмов в сперме и патологией в строении отдельных сегментов сперматозоидов (табл. 1).
Таблица 1
Корреляционная взаимосвязь между показателями
|
Показатель |
Анормальные сперматозоиды, % |
Индекс фрагментации |
Кол-во бактерий, КОЕ/мл |
Активность сперматозоидов, % |
|
Анормальные сперматозоиды, % |
1 |
+0,940** |
+0,944** |
–0,798** |
|
Индекс фрагментации |
+0,940** |
1 |
+0,965** |
–0,761** |
|
Количество бактерий, КОЕ/мл |
+0,944** |
+0,965** |
1 |
–0,768** |
|
Активность спермтозоидов,% |
–0,798** |
–0,761** |
–0,768** |
1 |
** Уровень значимости корреляции 0,01.
Установлена высокая отрицательная корреляционная взаимосвязь между количеством бактерий в сперме с активностью сперматозоидов (r = –0,768**).
Подтверждаются научные данные о влиянии высокой контаминации микроорганизмов на морфологию сперматозоидов. Дисперсионный анализ показал статистически значимое влияние количества микроорганизмов на морфологию сперматозоидов F = 123,2 (p = 0,000). Нужно отметить, что у производителей № 1, № 13, № 17 число сперматозоидов с аномальной морфологией было выше стандартных показателей (19,2 %; 19,4; 18,5 % соответственно) (рис. 1).
Рис. 1. Показатели аномалий морфометрии и индекса фрагментации ДНК сперматозоидов
у быков-производителей
Анализ состояния хроматина с помощью акридин-оранжевого теста (АО-тест) показал более высокую степень фрагментации ДНК (DFI) у быков-производителей № 1 (58,2 %), № 13 (61,3 %) и № 17 (54,3 %), чем средние показатели по исследуемой выборке. Можно отметить, что в образцах трех быков (№ 1, № 13, № 17) отмечается низкая подвижность, выше частота дефектов морфологии и выше индекс фрагментации ДНК. Корреляционная взаимосвязь между индексом фрагментации и содержанием микроорганизм высокая (r = +0,965**).
Общее количество микроорганизмов (КОЕ/см3) во всех исследуемых образцах соответствовало стандартным показателям ГОСТ 26030–2015 «Средства воспроизводства. Сперма быков замороженная», за исключением трех образцов, где общее количество микроорганизмов было на погранично-допустимом уровне: № 1 (КОЕ/см3 450), № 13 (КОЕ/см3 510), и № 17 (КОЕ/см3 480) (рис. 2).
В образцах быков № 1, № 13 и № 17 была выявлена микоплазма (Mycoplasma spp). Подвижность сперматозоидов в образцах с содержанием Mycoplasma spp. в среднем составляет 24,5 %, в образцах без содержания – 48,9 %.
Как показывают результаты исследования, наличие микоплазмы в образцах № 1, № 13 и № 17 оказало большее влияние на подвижность, морфометрические показатели и целостность ДНК.
Рис. 2. Общее количество микроорганизмов в эякуляте у быков-производителей
Репродуктивные показатели быков-производителей с выявленной микоплазмой были значительно хуже.
Результаты регрессионного анализа показывают тесную взаимосвязь стельности коров от первого осеменения с содержанием бактерий в сперме (табл. 2). В среднем по выборке стельность от первого осеменения составила 48,08 %. У трех быков (№ 1, №13, № 17) с выявленной микоплазмой количество коров с плодотворным осеменением было наименьшим и составило 33,1 %; 36,6 и 36,9 % соответственно.
Таблица 2
Дисперсионный анализ взаимосвязи стельности коров от первого осеменения*
с количеством бактерии в сперме
|
Модель |
Сумма квадратов |
ст.св. |
Средний квадрат |
F |
Значимость |
|
|
1 |
Регрессия |
686,223 |
1 |
686,223 |
14,868 |
0,001** |
|
Остаток |
738,475 |
16 |
46,155 |
|
|
|
|
Всего |
1424,698 |
17 |
|
|
|
|
*Зависимая переменная: стельность коров от первого осеменения, %.
**Предикторы: (константа), Количество бактерий, КОЕ/мл.
Заключение. Таким образом, результаты исследования показали, что в образцах спермы с содержанием бактерии 450–510 КОЕ/мл наблюдается увеличение индекса фрагментации ДНК до 61,3 %. В 17,6 % исследуемых образцов были обнаружены Mycoplasma spp., в них доля сперматозоидов с аномальной морфологией составляет 19 %, что больше на 9 %, чем в образцах, в которых не обнаружены Mycoplasma spp., и содержанием бактерий в среднем 185,71КОЕ/мл. Подвижность сперматозоидов в образцах с содержанием Mycoplasma spp. в среднем составляет 24,5 %, в образцах без содержания – 48,9 %. Следовательно, можно предположить, что наличие в образцах Mycoplasma spp. и высокие показатели бактериальной обсемененности приводят к снижению показателей воспроизводства у производителей.
1. Насибов М.Н., Аминов А.Л., Рамеев Т.В. Спермопродукция хряков крупной белой породы, используемых для репродукции // Вестник БГАУ. 2015. № 4. С. 60–62.
2. Четвертакова Е.В. Влияние возраста быков на биотехнологические показатели спермы // Вестник КрасГАУ. 2013. № 4. С. 151–154.
3. Effect of breed, age, season and region on sperm morphology in 11,387 bulls submitted to breeding soundness evaluation in Australia / J. Felton-Taylor [et al.] // Theriogenology. 2020. Vol. 15. P. 142:1–7.
4. Henning H., Luther A.-M., Waberski D. High Incidence of Sperm with Cytoplasmic Droplets Affects the Response to Bicarbonate in Preserved Boar Semen // Animals (Basel). 2021. № 11 (9). P. 2570.
5. The effect of bacterial contamination of semen on sperm chromatin integrity and standard semen parameters in men from infertile couples / R. Rybar [et al.] // J. Androl. 2012. Vol. 44. № s1. P. 410–418.
6. Seminal parameters of chronic male genital inflammation are associated with disturbed sperm DNA integrity / F. Haidl [et al.] // Andro-logia. 2015. Vol. 47 (4). P. 464–469.
7. Топурия Л.Ю., Есказина А.Б. Основные причины низкой воспроизводительной способности коров // Известия ОГАУ. 2012. № 4. С. 76–77.
8. Головань В.Т., Лещук А.Г., Кучарявенко А.В. О воспроизводстве молочных коров // Сб. науч. тр. ВНИИОК. 2016. Т. 1, № 9. С. 30.
9. Сушкова М.А., Строганова И.Я., Счислен-ко С.А. Микробиологические исследования свежеполученной спермы быков-произво-дителей на племпредприятии // Ветеринария сегодня. 2022. № 11 (4). С. 303–308.
10. Боранбаев А.В. Микробиологические показатели спермы марала, отобранной в панторезном станке после криоконсервации // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2019. № 3 (173). С. 107–110.
11. Борунова С.М., Грязнева Т.Н. Антибиотикорезистентность Mycoplasma bovigenitalum, выделяемой из спермы быков-производи¬телей // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2017. № 2. С. 22–27.
12. Althouse G.C., Lu K.G. Bacteriospermia in extended porcine semen // Theriogenology. 2005. Vol. 63, № 2. Р. 573–584.
13. Использование метода ПЦР для выявления возбудителей инфекционных болезней в сперме крупного рогатого скота / С.П. Яцен-тюк [и др.] // J. Agricultural und Socio-eco-nomic Sciences. 2017. Is. 10 (70). P. 331–337.
14. Распространение микоплазмозов крупного рогатого скота на животноводческих фермах в Российской Федерации в период с 2015 по 2018 г. / А.А. Мохаммад [и др.] // Ветеринария сегодня. 2020. № 2 (33). С. 102–108.
15. Детекция ДНК эмерджентных инфекций, как инструмент мониторинга за распространением и циркуляцией Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium у крупного рогатого скота на территории Уральского региона / Н.А. Безбородова [и др.] // Ветеринария Кубани. 2021. № 6. С. 13–15. DOI:https://doi.org/10.33861/2071-8020-2021-6-13-15.
16. Дифференциация Mycoplasma bovis, Myco-plasma bovigenitalium, Mycoplasma californi-cum и выявление Ureaplasma diversum методом ПЦР в реальном времени / А.Д. Козлова [и др.] // Сельскохозяйственная биология. 2019. Т. 54, № 2. С. 378–385.
17. Effect and mechanisms of reproductive tract infection on oxidative stress parameters, sperm DNA fragmentation, and semen quality in infertile males / K.S. Liu [et al.] // Reproductive Biology and Endocrinology. 2021. Vol. 19, № 97. DOI:https://doi.org/10.1186/s12958-021-00781-6.
18. Research on the relationshipbetween sperm DNA fragmentation and seminal infection by Ureaplasmaurealyticum and mycoplasma hominis of infertile males / F.H. Pan [et al.] // Eur J. ContraceptReprod Health Care. 2013. Vol. 33. P. 448–452.
19. Bacterial species present in the lower male genital tract: a five-year retrospective study / М.А. De Francesco [et al.] // Eur J. ContraceptReprod Health Care. 2011. Vol. 16 (1). P. 47–53.
20. Zeyad А., Hamad M.F., Hammadeh M.E. The effects of bacterial infection on human sperm nuclear protamine P1/P2 ratio and DNA integrity // Andrologia. 2017. № 50 (2). P. e12841.
21. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters / Т. Domes [et al.] // FertilSteril. 2012. Vol. 97, № 5. P. 1050–1055.
22. Effect of bacterial infection on sperm quality and DNA fragmentation in subfertile men with Leukocytosperma / F. Eini [et al.] // BMC Molecular and Cell Biology. 2021. Vol. 22, № 42. DOI:https://doi.org/10.1186/s12860-021-00380-8.
23. Mycoplasma bovis Infections-Occurrence, Diagnosis and Control / K. Dudek [et al.] // Pathogens. 2020. Vol. 6 (8). P. 640–645.
24. ГОСТ 32222-2013. Средства воспроизводства. Сперма. Методы отбора проб. М., 2013.
25. Detection and evalution of different morphological forms of Mycoplasma hominis in human semen / Е. Bragina [et al.] // Asian J. of Andrology. 2023. Vol. 25. P. 1–6.
