Цель исследования – идентификация возбудителя пятнистости неизвестной этиологии, поразившей в 2019–2023 г. листья и плоды яблони в насаждениях Краснодарского края. Проведена идентификация возбудителя пятнистости неизвестной этиологии, поразившей в 2019–2023 гг. листья яблони в насаждениях Краснодарского края. Причиной заболевания оказался возбудитель марссониоза – гриб Marssonina coronaria (Ellis & Davis) Davis. Это является первым случаем идентификации данного фитопатогена на яблоне в России. Согласно литературным данным, заболевание вызывает преждевременную дефолиацию с потерей от 20 до 40 % листьев. В условиях Краснодарского края на листьях и плодах в результате поражения грибом образуются пятна нескольких типов. Наиболее часто встречаются пятна от темно-зеленых до темно-коричневых или черных, лучистые – состоящие из разветвленных и вее¬рообразно расходящихся гиф. Пятна второго типа темно-зеленые, затем коричневые, округлые. Реже образуются фиолетово-бурые пятна, по форме удлиненные, расплывчатые, не отделенные резко от здоровой ткани. В регионе первые признаки проявления марссониоза на листьях отмечаются в III декаде мая – I декаде июня. Срок образования ацервул был отмечен в 2019–2021 гг. в III декаде июля, в 2022–2023 гг. – в III декаде июня. Конидии M. coronaria имеют размеры в пределах 12~25 × 3~8 мкм. По форме они ампуловидные, прямые или слегка изогнутые, состоящие из двух клеток разного размера, слегка суженные в перегородке. Колонии моноспоровых изолятов морщинистые, цвет от темного серо-коричневого до черного, без воздушного мицелия, диаметр от 5 до 9 мм на картофельно-пептонном глюкозном агаре после инкубации в течение 40 дней в темноте при 22 °C. Искусственное заражение саженцев яблони сорта Голден Делишес инокулумом спор, выделенных из изолятов гриба, и последующая реизоляция из зараженных листьев в чистую культуру подтвердила патогенность гриба.
пятнистость яблони, Marssonina coronaria, морфолого-культуральные признаки, искусственное заражение
Введение. Марссониоз яблони (Apple marssonina leaf blotch – AMLB) – опасное заболевание культуры, которое приводит к огромным потерям при производстве яблок во всем мире, особенно в азиатском регионе [1]. Заболевание в основном вызывает преждевременную дефолиацию с потерей от 20 до 40 % листьев [2]. Возбудителем, вызывающим эту пятнистость, является Marssonina coronaria (Ellis & Davis) Davis (син. Marssonina mali), которая относится к царству Fungi, отделу Ascomycota, классу Leotiomycetes, порядку Helotiales, семейству Dermateaceae, роду Marssonina. Из литературных источников следует, что впервые гриб был описан в 1903 г. в США и вскоре после этого, в 1907 г. – в Японии, как патоген, вызывающий пятнистость листьев яблони, поражение которой привело к преждевременному массовому опадению листьев и существенным потерям урожая [3]. В настоящее время гриб наиболее распространен в странах Азии. А также болезнь зарегистрирована в Канаде, Южной Америке; в Европе впервые была обнаружена в 2001 г. – в Италии, в 2010 г. – в Германии, в 2011 г. – в Австрии и Швейцарии. Прежде всего, марссониоз наиболее вредоносен в садах органического земледелия, где количество фунгицидных обработок минимально, поскольку используются в основном устойчивые к парше сорта [1, 2].
Возбудитель является биотрофом. Цикл развития гриба еще окончательно не изучен. Патоген зимует на опавших листьях, на которых осенью образуются плодовые тела половой стадии Diplocarpon mali Y. Harada & K. Sawamura – апотеции, содержащие аскоспоры, являющиеся первичным источником инфекции. Прорастание аскоспор начинается при 5 °С. Однако в условиях Европы образование апотециев не доказано. Распространение гриба осуществляется вторичной инфекцией – с помощью ветра и влаги конидиями, но, возможно, и первичной инфекцией – акоспорами [4, 5].
Цель исследования – идентификация возбудителя пятнистости неизвестной этиологии, поразившей в 2019–2023 г. листья и плоды яблони в насаждениях Краснодарского края.
Объекты и методы. Исследования проводили в садовых насаждениях Краснодарского края и лабораториях биотехнологического контроля фитопатогенов и фитофагов ФГБНУ СКФНЦСВВ и ООО «Компания Агропрогресс». Объектами исследования служили пораженные пятнистостью листья сортов яблони Джонаголд, Гала и клоны, Голден Делишес, Голден Резистент, Голд Раш, Флорина. Идентификацию возбудителя проводили сочетанием методов: визуальной диагностики в полевых условиях; микроскопии микроструктур гриба; морфолого-культурального – выделение возбудителя в чистую культуру на агаризованной питательной среде с последующим изучением признаков.
Чистую моноспоровую культуру получали путем отсева проросших спор с поверхности водного агара на питательную среду КПГА (картофельно-пептонный глюкозный агар; 200 г картофеля, 20 г пептона, 20 г глюкозы, 20 г агара и 1,0 л дистиллированной воды) с добавлением антибиотиков тетрациклина (25 мг/л) и хлорамфеникола (25 мг/л) для исключения бактериального роста. Микроскопические исследования выполняли с помощью микроскопа Olympus BX41, оснащенного видеоокуляром DCM–130. Инкубирование моноспоровых посевов проводили при 22 °С. Морфологию колоний и цвет изолятов на средах оценивали после 40 дней инкубации. Для споруляции культуру выдерживали при 12-часовом режиме чередования света и темноты. Измерение спор осуществляли под микроскопом с использованием калиброванного окулярного микрометра, проводя замер 10–15 спор.
Проверку микромицета на патогенность проводили путем инокуляции листьев двухлетних саженцев яблони в условиях фитотрона суспензией конидий, используя метод, предложенный T. Wöhner et al. [6] с модификациями. Смесь для заражения получали следующим образом. Сорокадневный моноспоровый изолят соскабливали скальпелем со среды КПГА, гомогенизировали в 20 мл стерильной воды и фильтровали через 4 слоя марли. Полученную суспензию концентрировали центрифугированием. Осадок спор суспензировали в 2 мл стерильной воды и в объеме 0,5 мл вносили на поверхность свежей среды КПГА, распределяя шпателем Дригальского. Посев инкубировали при 25 °С в течение 30 дней. Процедуру по получению суспензии спор из посева повторяли. В смеси определяли количество спор с использованием камеры Горяева. Перед заражением в инокулум добавляли 0,001 % Твин 80 и доводили до конечной концентрации 1 · 106/мл. Листья саженцев сорта Голден Делишес в условиях фитотрона опрыскивали с обеих сторон смесью спор, оборачивали влажными бумажными полотенцами и накрывали полиэтиленовыми пакетами для создания 100 %-й влажности. Через 72 ч пакеты и влажные полотенца удаляли с инокулированных листьев, и саженцы переносили на вегетационную площадку. Развитие признаков заболевания оценивали в разные дни после инокуляции. Выделение чистой культуры из искусственно зараженных листьев завершало триаду Коха.
Результаты и их обсуждение. По совокупности симптомов поражения листьев и культурально-морфологических признаков чистых культур возбудитель пятнистости листьев яблони был идентифицирован как Marssonina coronaria (Ellis & Davis) Davis.
На территории Краснодарского края признаки проявления болезни были выявлены на листьях яблони сорта Голден Резистент в центральной подзоне прикубанской зоны садоводства, с 2021 г. – в других зонах садоводства: Северной, Предгорной и Черноморской. В южном регионе мы впервые обнаружили M. coronaria в коллекционных насаждениях диких форм яблони (Malus baccata) в Республике Адыгея в 2016 г. На яблоне домашней болезнью поражаются листья и плоды. На листьях и плодах в результате поражения грибом образуются пятна нескольких типов, что согласуется с литературными данными [5]. Наиболее часто встречаются пятна от темно-зеленых до темно-коричневых или черных, лучистые – состоящие из разветвленных и веерообразно расходящихся гиф (рис. 1, А, Б, В). Второй тип: пятна второго типа темно-зеленые, затем коричневые, округлые (рис. 1, Г, Д, Е). Реже образуются фиолетово-бурые пятна, по форме удлиненные, расплывчатые, не отделенные резко от здоровой ткани (рис. 1, Ж).
Через 15–20 дней после появления пятнистости на листьях образуются хлоротические участки или полностью пожелтевшие площади. На листьях пятна образуются на верхней поверхности, по мере прогрессирования заболевания пятна сливаются, затем на пораженной ткани образуются черные округлые подушечки – спороложа, или ацервулы, расположенные под эпидермисом листа (рис. 2, А, Б, В, Г). Листья раньше времени желтеют, во второй половине лета на высоковосприимчивых к болезни сортах – Гала и клоны, Голд Раш, Голден Делишес, Флорина – может наблюдаться сильный листопад (рис. 3). Заболевание выявлено также на сортах Голден Резистент, Джонаголд, Джонапринц и Ренет Симиренко.
Рис. 1. Признаки проявления марссониоза яблони на листьях и плодах
(стрелками показаны пятна заболевания)
Рис. 2. Развитие ацервул на пораженных марссониной листьях яблони
(стрелками показаны ацервулы патогена)
Рис. 3. Дерево яблони сорта Флорина с признаками дефолиации
из-за сильного развития марссониоза
Морфометрический анализ показал, что размер конидий колебался в пределах 12~25 × 3~8 мкм (см. рис. 1, Б). Размер и форма конидий соответствовали описанным в литературе для M. coronaria [5, 6]. По форме конидии ампуловидные, прямые или слегка изогнутые, состоящие из двух клеток разного размера, слегка суженные в перегородке (рис. 4).
Рис. 4. Морфологические характеристики гриба Marssonina coronaria,
выделенного с листьев яблони: А – конидиеносцы; Б – конидиогенез;
В – конидии
Все полученные моноспоровые изоляты имели схожие культуральные характеристики: колонии морщинистые, цвет от темного серо-коричневого до черного; воздушный мицелий отсутствовал; диаметр от 5 до 9 мм на КПГА после инкубации в течение 40 дней в темноте при 22 °C (рис. 5). Описанные признаки соответствуют данным литературных источников [7].
Рис. 5. Моноспоровая культура гриба Marssonina coronaria,
выделенного с листьев яблони на среде КПГА (чашка Петри, диаметр 90 мм)
В эксперименте по оценке патогенных свойств выделенного гриба видимые симптомы были обнаружены на верхней поверхности листьев на 9–11-й день после инокуляции. Симптомы проявлялись в виде мелких пятен темного цвета. На 15–18-й день отмечалось развитие ацервул и хлороз тканей листа. Реизоляция патогена из искусственно зараженных листьев в чистую культуру показала соответствие культуральных характеристик исходному изоляту, что подтверждает патогенность гриба.
Заключение. Проведена идентификация возбудителя пятнистости неизвестной этиологии, поразившей в 2019–2023 г. листья яблони в насаждениях Краснодарского края. Причиной заболевания являлся гриб Marssonina coronaria. На листьях и плодах в результате поражения грибом образуются пятна нескольких типов. В регионе первые признаки проявления марссониоза на листьях отмечаются в III декаде мая – I декаде июня. Срок образования ацервул был отмечен в 2019–2021 гг. в III декаде июля, в 2022–2023 гг. – в III декаде июня. Можно прогнозировать, что в условиях Краснодарского края опасность болезни будет нарастать в связи с изменением погодно-климатических условий, а именно при выпадении большого количества осадков и пониженном температурном режиме в мае-июне, также отсутствием специальных обработок против M. coronaria на устойчивых и иммунных к парше сортах.
1. An empirical assessment of the economic damage caused by apple Marssonina blotch and pear scab outbreaks in Korea / D. Kwon [et al.] // Sustainability 2015. V.7 P. 16588–16598. DOI:https://doi.org/10.3390/su71215836.
2. Wöhner T., Emeriewen O.F. Apple blotch di-sease (Marssonina coronaria (Ellis & Davis) Davis) – review and research prospects // Eur. J. Plant Pathol. 2019. V. 153. № 3. P. 657–669.
3. Multiplexed SSR marker analysis of Diploca-rpon coronariae reveals clonality within samples from Middle Europe and genetic distance from Asian and North American isolates / T. Oberhänsli [et al.] // CABI Agriculture and Bioscience. 2021. V. 2. № 1. P. 21. DOI:https://doi.org/10.1186/s43170-021-00039-6.
4. Monitoring Spore Dispersal and Early Infections of Diplocarpon coronariae Causing Apple Blotch Using Spore Traps and a New QPCR Method / C. Boutry [et al.] // Phytopathology. 2023. V. 113(3). P. 470–483. DOI: 10.1094/ PHYTO-05-22-0183-R.
5. Resistance to Marssonina coronaria and Alter-naria alternata apple pathotype in the major apple cultivars and rootstocks used in China / Y. Li [et al.] // HortScience. 2012. V. 47. № 9. P. 1241–1244. DOI:https://doi.org/10.21273/HORTSCI.47.9. 1241.
6. Evaluation of Malus gene bank resources with German strains of Marssonina coronaria using a greenhouse-based screening method / T. Wöhner [et al.] // Eur. J. Plant Pathol. 2019. V. 153. № 3. P. 743–757. DOI:https://doi.org/10.1186/1477-5956-12-7.
7. Biological characterization of Marssonina coro-naria associated with apple blotch disease / D.H. Lee [et al.] // Mycobiology. 2011. V. 39. № 3. P. 200–205. DOI:https://doi.org/10.5941/MYCO.2011. 39.3.200.
