Красноярск, Красноярский край, Россия
Цель исследования – получение водных и водно-спиртовых экстрактов котовника кошачьего (мелиссы лимонной), определение в них общего содержания фенольных соединений и флавоноидов, анализ компонентного состава полученных экстрактов методом ВЭЖХ и установление антирадикальной активности экстрактов. Экстрактивные вещества из исходного сырья выделяли методом экстракции водой или водно-спиртовыми смесями (использовали 20, 40, 70 и 95 % спирт) при температуре их кипения в течение 1,0 ч. Навеска сырья – 1,0 г, объем раствора – 100 мл. После фильтрования полученные растворы подвергались дальнейшим исследованиям на компонентный состав и антирадикальную активность. Установлено, что чистый спирт извлекает минимальное количество веществ, сумма которых составляет 15,4 %. Водно-спиртовые смеси извлекают практически одинаковое количество веществ, которые составляют 19,7–21,3 % в расчете на воздушно-сухую навеску сырья. Результаты ДФПГ-теста, определенные кинетическим методом, показали, что величина АРА минимальна для спирторастворимых веществ – 2,7 % и возрастает для водно-спиртовых экстрактов от 16,6 % в случае 70 % экстракта до 25,2 % для 20 % водно-спиртового экстракта. Максимальное значение АРА характерно для водных экстрактов и составляет 38,5 %. Экстрактивные вещества котовника кошачьего обладают низкой антирадикальной активностью, которая не превышает 50 %. В полученных экстрактах определено общее содержание фенольных соединений (по реакции с реактивом Фолина-Чокальтеу), составляющее 0,09–0,69 вес.% в пересчете на галловую кислоту. Эта величина равномерно возрастает при переходе от чистого спирта к воде. По реакции с хлоридом алюминия определено общее содержание флавоноидов в полученных экстрактах: она минимальна в случае спиртового экстракта (0,24 % в пересчете на лютеолин) и максимальна в случае водного экстракта (0,57 % в пересчете на лютеолин). Величина АРА хорошо коррелирует с общим содержанием фенольных соединений (коэффициент корреляции – 0,9522), в то время как коэффициент корреляции величины АРА с общим содержанием флавоноидов составляет всего лишь 0,8809. Методом ВЭЖХ исследован компонентный состав фенольных соединений в полученных экстрактах. Максимальное количество фенольных соединений обнаружено в водных экстрактах, а минимальное – в спиртовых. Среди компонентов идентифицированы фенолкарбоновые кислоты: галловая, кофеилхинная, хлорогеновая, кофейная и феруловая. Присут-ствует рутин и некоторые гликозиды.
: котовник кошачий (мелисса лимонная), водные, спиртовые и водно-спиртовые экстракты, антирадикальная активность, 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ)
Введение. Мелисса лекарственная – Melissa officinalis L. семейство Губоцветные (Lamiaceae) используется в народной и научной медицине многих стран мира, широко распространена на Балканах, в Северной Африке, Северной Америке, в Иране, в Средней Азии, в России и других регионах мира [1, 2]. Обширный ареал ее произрастания и широкий спектр практического применения при лечении ряда заболеваний организма человека делает мелиссу официнальным растением во многих странах мира [3, 4].
В семействе Lamiaceae известны как минимум три вида мелиссы: мелисса лекарственная; мелисса лимонная (котовник кошачий) и мелисса турецкая (змееголовник молдавский) [5]. Наиболее распространенным видом мелиссы в диком виде в Сибирском регионе является мелисса лимонная – котовник кошачий. Распространен котовник практически во всех областях средней полосы России, в Сибири и на Алтае.
Учитывая тот факт, что котовник кошачий по морфологическим признакам похож на мелиссу лекарственную и имеет явно выраженный лимонный запах, можно ожидать, что в нем может содержаться значительное количество экстрактивных веществ, которые придавали бы ему лечебные свойства.
Цель исследования – получение водных и водно-спиртовых экстрактов, определение в них общего содержания фенольных соединений и флавоноидов, анализ компонентного состава полученных экстрактов методом ВЭЖХ и установление антирадикальной активности экстрактов.
Объекты и методы. Исходное сырье (вся надземная часть растений) собирали в период цветения в июле-августе 2021 г. на дачных участках Емельяновского района Красноярского края. Принадлежность исходного сырья к котовнику кошачьему проводилась по основным морфологическим признакам этого растения. Листья и соцветия измельчали до размеров 1–3 мм, стебли отбрасывали и сушили на воздухе в тени до воздушно сухого состояния.
Экстрактивные вещества из исходного сырья выделяли методом экстракции водой или водно-спиртовыми смесями (использовали 20, 40, 70 и 95 % спирт) при температуре их кипения в течение 1,0 ч. Навеска сырья составляла 1,0 г, объем раствора – 100 мл. После фильтрования полученные растворы подвергались дальнейшим исследованиям на компонентный состав и антирадикальную активность.
Общее содержание фенольных соединений проводили с использованием реактива Фолина-Чокальтеу, а расчет проводили в пересчете на галловую кислоту с использованием формулы
Х, % = (А · 100)/А1%1см · l,
где А – оптическая плотность исследуемого раствора в комплексе с реактивом Фолина-Чокальтеу при 750 нм; А1%1см – удельный показатель поглощения галловой кислоты в комплексе с реактивом Фолина-Чокальтеу при 750 нм, равный 47,3 [6]; l – объем экстракта, взятый для анализа, мл.
Содержание флавоноидов в пересчете на лютеолин определяли спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность комплекса флавоноидов с 2 % раствором алюминия хлорида в 95 % этаноле через 60 мин [7].
Величину антирадикальной активности (АРА) определяли с использованием ДФПГ кинетическим методом [6, 8]. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещали 1 мл исходного экстракта и доводили до метки соответствующим растворителем. При проведении измерений в кювету с исследуемым раствором добавляли 3 мл разбавленного экстракта и 3 мл рабочего раствора ДФПГ, в кювету с раствором сравнения – 3 мл разбавленного экстракта и 3 мл этанола 95 %. Контрольным раствором являлся раствор ДФПГ.
Для расчета процента ингибирования использовали формулу
% ингибирования = (А0 – Ах) · 100 %/(А0),
где А0 – оптическая плотность ДФПГ в отсутствии растительного экстракта (контроль); Ах – оптическая плотность исследуемого раствора растительного экстракта с ДФПГ.
Ход реакции контролировали по уменьшению величины оптической плотности растворов в видимой области на длине волны 517 нм в течение 30 мин.
Для проведения кинетических измерений использовали 0,008 % (С = 1,7·10–4 моль/л) раствор ДФПГ в этаноле 95 % (растворяли на ультразвуковой ванне).
Природу экстрактивных веществ в экстрактах проводили с использованием УФ-спектрометрии и жидкостной хроматографии. Электронные спектры поглощения записывали на спектрометре Shimadzu-1700 в кюветах толщиной 1,0 см при комнатной температуре.
Компонентный состав экстрактов котовника осуществляли на жидкостном хроматографе «Миллихром А-02» с использованием колонки 75×2·мм, подвижная фаза вода + ацетонитрил в градиентном режиме ацетонитрила от 0 до 100 % в течение 30 мин. Идентификацию соединений проводили с использованием внутренних стандартов органических кислот, лютеолина, рутина, кварцетина и других.
Результаты и их обсуждение. Количество экстрактивных веществ, извлекаемых из котовника кошачьего водой, 20, 40 и 70 % этанолом, практически одинаково и составляет 19,7–21,3 вес.%. Чистый спирт извлекает заметно меньшее количество веществ – около 15,4 вес.%.
В электронных спектрах поглощения всех экстрактов присутствуют полосы поглощения в области 280–325 нм (рис. 1). Поглощение в данной области спектра однозначно указывает на присутствие в экстрактах котовника фенолкарбоновых кислот, которыми, согласно литературным данным, могут быть галловая, хлорогеновая, цикориевая, кофейная, салициловая и феруловая кислоты [11–13], часто встречающиеся в растениях данного семейства.
Методом ВЭЖХ установлено, что в экстрактах котовника действительно присутствуют следующие кислоты: галловая, хлорогеновая: кофейная и феруловая. Кроме них присутствуют также некоторые полифенолы, идентифицированные с использованием внутренних стандартов (табл. 1). Следует указать, что на хроматограммах присутствуют как минимум 18 отдельных пиков, идентифицировать которые в полном объеме в настоящее время затруднительно ввиду отсутствия стандартных образцов.
Рис. 1. Электронный спектр экстрактивных веществ котовника, выделенных 40 % этанолом
Таблица 1
Состав полифенолов в водном экстракте котовника кошачьего
|
Время выхода, мин |
Вещество |
Содержание во фракции, вес.% |
|
7,86 |
Галловая кислота |
0,1 |
|
8,82 |
Кофеилхинная кислота |
9,8 |
|
10,38 |
Хлорогеновая кислота |
18,5 |
|
11,00 |
Кофейная кислота |
12,4 |
|
12,73 |
Лютеолин-7-дигликозид |
10,4 |
|
13,77 |
Рутин |
0,8 |
|
14,02 |
Апигенин-7-дигликозид |
16,1 |
|
14,64 |
Лютеолин-7-гликозид |
4,1 |
|
15,62 |
Феруловая кислота |
2,4 |
Очевидно, что идентифицированные соединения обладают противовоспалительной, спазмолитической и жаропонижающей активностью и могут использоваться в качестве лечебно-профилактических средств. Более того, вполне очевидно, что практически все полифенольные соединения обладают антирадикальной активностью, что существенно повышает ценность экстрактов котовника в борьбе с возникновением онкологических заболеваний [9–11]. В этой связи была изучена антирадикальная активность полученных экстрактов котовника в модельной реакции с ДФПГ. На рисунке 2 приведены данные по изменению антирадикальной активности экстрактов от времени.
Рис. 2. Зависимость антирадикальной активности полученных экстрактов котовника
от продолжительности
Следует отметить, что величина АРА закономерно снижается с возрастанием процентного содержания спирта в экстракте, причем эти изменения достаточно существенны (см. табл. 2).
Учитывая тот факт, что в полученных экстрактах возможно определять отдельно общее содержание фенольных соединений (с реактивом Фолина-Чокальтеу) и отдельно общее содержание флавоноидов (по реакции с хлоридом алюминия), представляло интерес сопоставить величину АРА с содержанием фенольных соединений и флавоноидов. Используя данные, приведенные в таблице 2, получили графические зависимости, представленные на рисунках 3 и 4.
Таблица 2
Содержание фенольных соединений, флавоноидов и величина
антирадикальной активности экстрактов котовника кошачего
|
Экстрагент |
Содержание фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту, вес.% |
Содержание флавоноидов в пересчете на лютеолин, вес.% |
Антирадикальная активность, % через 30 мин реакции |
|
Вода |
0,686±0,002 |
0,568±0,098 |
38,5 |
|
Этанол 20 % |
0,626±0,013 |
0,382±0,059 |
25,2 |
|
Этанол 40 % |
0,454±0,006 |
0,407±0,029 |
22,1 |
|
Этанол 70 % |
0,433±0,019 |
0,464±0,005 |
16,6 |
|
Этанол 95 % |
0,094±0,006 |
0,241±0,007 |
2,7 |
Рис. 3. Зависимость величины АРА полученных экстрактов котовника
от содержания фенольных соединений
Рис. 4. Зависимость величины АРА полученных экстрактов котовника
от содержания флавоноидов
Как видно из представленных данных, наилучшая корреляция между величиной АРА и содержанием отдельных групп соединений наблюдается в случае фенольных соединений: коэффициент корреляции составляет 0,9522, в то время как для флавоноидов он равен всего лишь 0,8809.
Таким образом, можно предположить, что за величину АРА в большей степени ответственны именно полифенольные соединения. Хотя не исключена возможность и того, что определенный вклад в величину АРА вносят и флавоноиды.
Следовательно, котовник кошачий (мелисса лимонная), произрастающая в диком виде в Сибири, может быть использована как лечебно-профилактическое сырье для приготовления чаев, настоек и отваров, так как содержит значительное количество полифенолов, которые обладают полезными свойствами.
Заключение
1. Определено количество экстрактивных веществ, извлекаемых из надземной части котовника кошачьего водой и водно-спиртовыми растворами. Показано, что эта величина составляет 19,7–21,3 % от веса воздушно-сухого сырья.
2. Методом ВЭЖХ идентифицированы в экстрактах фенолкарбоновые кислоты и некоторые гликозиды.
3. Установлено, что величина антирадикальной активности полученных экстрактов не превышает 38,5 %.
4. Показано, что величина АРА хорошо коррелирует с общим содержанием фенольных соединений в полученных экстрактах.
1. Зузук Б.М., Куцик Р.В. Мелисса лекарственная (Melissa officinalis L.) (аналитический обзор). URL: http://provisor.co.ua/2002/1.
2. Зузук Б.М., Куцик Р.В. Мелисса лекарственная (Melissa officinalis L.) (аналитический обзор). URL: http://provisor.co.ua/2002/2.
3. Государственный реестр лекарственных средств. Т. 1. М., 2008. 1398 с.
4. Государственный реестр лекарственных средств. Т. 2. М., 2008. 1208 с.
5. Мелисса лекарственная: перспективы использования в педиатрии / В.А. Куркин [и др.]. Самара: Офорт, 2010. 164 с.
6. Mondal S., Hossain I., Islam Md.N. Determination of antioxidant potential of Cucurbita pepo Linn. (An edible herbs of Bangladesh) // J. of Pharmacognosy and Phytochemistry. 2017. V. 6, № 5. P. 1016–1019.
7. Ломбоева С.С., Танхаева Л.М., Оленников Д.Н. Методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части ортилии однобокой (Orthilia secunda (L.) House) // Химия растительного сырья. 2008. № 2. С. 65–68.
8. Тринеева О.В. Методы определения антиоксидантной активности объектов растительного и синтетического происхождения в фармации (обзор) // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2017. № 4. С. 180–197.
9. Биологически активные вещества Nepeta Cataria L. / А.Е. Палий [и др.] // Бюллетень ГНБС. 2016. Вып. 118. С. 38–44.
10. Хачирова Ф.С., Челомбитько В.А., Зилфикиров И.Н. Технология и стандартизация сухого экстракта котовника крупноцветного // Известия вузов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2007. № 3. С. 83–85.
11. Chemical composition and biological activity of Nepeta cilicica. Bangladesh / G. Iscan [et al.] // J. Pharmacol. 2017. V. 12. P. 204–209.
