Цель исследования – определение чувствительности представителей условно-патогенных (возбудителей воспалительных и гнойно-септических заболеваний мягких тканей, кожи, слизистых органов пищеварения и размножения крупного рогатого скота в Кемеровской области) и нормальных кишечных микроорганизмов: S. aureus, E. coli, B. cereus, P. mirabilis, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. – к экстракту корней и корневищ кровохлебки лекарственной в различных разведениях для установления минимальной ингибирующей концентрации приготовленной лекарственной формы в виде раствора. Условно-патогенные микроорганизмы являются основными возбудителями воспалительных и гнойно-септических заболеваний мягких тканей, кожи, слизистых органов пищеварения и размножения крупного рогатого скота в Кемеровской области. Исследования проводились культуральным методом, с добавлением экстракта кровохлебки, приготовленного по стандартной методике, в питательный мясо-пептонный агар. В эксперименте применялись растворы экстракта кровохлебки, добавленные к питательному агару в соотношении 1:1, 1:2, 1:4, 1:8. Экстракт кровохлебки во всех разведениях ингибировал рост S. aureus и представителей нормальной микрофлоры: Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp., E. coli показала нечувствительность к исследуемому экстракту во всех разведениях. Рост B. cereus и P. mirabilis исследуемый экстракт ингибировал в разведении 1:1, 1:2, 1:4. В разведении 1:8 наблюдался хороший, отчетливый рост колоний, характерный для данных видов микроорганизмов. Эффективно применять экстракт кровохлебки в форме раствора при лечении гнойно-септических процессов мягких тканей и слизистых оболочек, инфицированных S. aureus, а также для профилактики развития инфекционного процесса, вызванного им. Применение экстракта кровохлебки для лечения и профилактики инфекций, вызванных B. cereus и P. Mirabilis, может быть неэффективно в силу малого ингибирования роста этих микроорганизмов на плотных питательных средах. Ингибирование роста нормальной микрофлоры Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. способно нарушить микроэкологическое равновесие пищеварительного тракта, поэтому не рекомендуется применение экстракта кровохлебки перорально. Необходимо ограничиться парентеральными методами применения различных лекарственных форм, в т. ч. растворов, содержащих экстракт кровохлебки.
кровохлебка лекарственная, антимикробное свойство, экстракт, полезная микрофлора, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus и Proteus mirabilis, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp.
Введение. Кровохлебка является лекарственным растением, которое обладает местным противовоспалительным и сосудосуживающим действиями. Ее применяют при желудочно-кишечных расстройствах, бронхитах, туберкулезах, заболеваниях шейки матки, наружно ее применяют для лечения ран, язв и ушибов. Также она зарекомендовала себя как антисептическое средство в отношении золотистого стафилококка, кишечной палочки, в менее выраженной степени от брюшнотифозной, паратифозной и дизентерийной инфекции. Помимо всего, было установлено, что экстракт кровохлебки губительно влияет на трихомонаду, некоторые бактерии и лямблии.
Своими антибактериальными свойствами кровохлебка обязана содержащимся в ней в большом количестве дубильных веществ – тритерпеноиды, ситостерины, эфирное масло, витамин С, до 30 % крахмала, терпеновые гликозиды. Дубильные вещества кровохлебки проявляют свои свойства до разведения в 32 раза, при дальнейших разведениях наблюдается рост всех микроорганизмов [1, 2].
Доказано, что спиртовые экстракты кровохлебки усиливают способность макрофагов к фагоцитозу и увеличивают секрецию цитокинов воспаления (TNF-α, IFN, IL-8), а также подавляют репликацию вируса и продукцию воспалительных цитокинов, не проявляя токсичности [3, 4].
Водные вытяжки корней и корневищ растения обладают повышенной антимикробной активностью к Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis [3].
Также при исследовании отвара корней и корневищ кровохлебки было установлено, что благодаря большому содержанию дубильных веществ растение обладает бактерицидным действием и успешно может применяться при различных патологиях, вызванных бактериальными агентами, особенно эффективно при дизентериях, вызванных сальмонеллами и шигеллами [5].
Все вышеперечисленные микроорганизмы распространены повсеместно. Но наиболее актуальными для Кемеровской области являются возбудители инфекционных гнойно-септических заболеваний мягких тканей, кожи и слизистых оболочек пищеварительного тракта, органов размножения: представители семейств Enterobacteriacea, Enterococcusceae, Staphylococcuscea, Bacillus spp. [6] (рис. 1, 2).
Рис. 1. Удельный вес микроорганизмов, изолированных от крупного рогатого скота
с клиническими и патологоанатомическими признаками инфекционного заболевания
в Кемеровской области
Рис. 2. Удельный вес микроорганизмов, изолированных от пациентов лечебно-профилактических учреждений Кемеровской области (URL: https://amrmap.ru)
Цель исследования – определение чувствительности представителей условно-патогенных (возбудителей воспалительных и гнойно-септических заболеваний мягких тканей, кожи, слизистых органов пищеварения и размножения крупного рогатого скота в Кемеровской области) и нормальных кишечных микроорганизмов: S. aureus, E. coli, B. cereus, P. mirabilis, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. – к экстракту корней и корневищ кровохлебки лекарственной в различных разведениях для установления минимальной ингибирующей концентрации приготовленной лекарственной формы в виде раствора.
Объекты и методы. Для исследования были использованы фильтр-пакетики с корнями и корневищами (подземными органами) кровохлебки лекарственной.
Отвар из пакетиков получали по инструкции, 3 фильтр-пакетика заваривали в 200 мл кипяченой воды, давали настояться отвару 15 мин, при этом периодически отжимая фильтр-пакетики, затем полученный отвар доводили до 200 мл кипяченной водой.
Производили разведение полученного экстракта физиологическим раствором в концентрации 1:2, 1:4, 1:8. Определение концентрации дубильных веществ, способной ингибировать рост исследуемых культур микроорганизмов, производили в соответствии с ОФС.1.5.3.0008.15 «Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» [7]. Далее готовили плотные питательные среды (мясо-пептонный агар, г. Оболенск (МПА)), в который добавляли отвар кровохлебки, разведенный физиологическим раствором, соответственно: в соотношении 1:2 (5 / 10 мл, содержание дубильных веществ 5,74 ± 0,36 %), 1:4 (2,5 / 7,5 мл, содержание дубильных веществ 3,28 ± 0,48 %) и 1:8 (1,25 / 8,75 мл, содержание дубильных веществ 1,36 ± 0,57 %). Еще одна проба была приготовлена с натуральным разведением 10 / 20 мл питательного агара с содержанием дубильных веществ 7,13 ± 0,24 %. Ставили положительный контроль: мясо-пептонный агар без добавления экстракта (табл. 1).
Таблица 1
Схема опыта in vitro по определению антимикробных свойств экстракта кровохлебки
в отношении условно-патогенных микроорганизмов
|
Разведение экстракта кровохлебки в МПА, содержание дубильных веществ |
|
|
Staphylococcus aureus |
1:2 (5 / 10 мл), 5,74 ± 0,36 % 1:4 (2,5 / 7,5 мл), 3,28 ± 0,48 % 1:8 (1,25 / 8,75 мл), 1,36 ± 0,57 % Натур. (10 / 20 мл), 7,13 ± 0,24 % |
|
Escherichia coli |
|
|
Bacillus cereus |
|
|
Proteus mirabilis |
Тестируемые штаммы микроорганизмов изолировали из биологического материала от крупного рогатого скота с гнойно-катаральными эндометритами. Отбор проб производили в соответствии с МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории: методические указания» [8]. Определение видовой принадлежности штаммов микроорганизмов осуществлялось в соответствии с «Методическими указаниями по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями», утв. Минздравом 17.12.1984 [9]; Методическими рекомендациями «Метициллинрезистентные Staphyloco-ccus aureus – возбудители внутрибольничных инфекций: идентификация и генотипирование», утв. Роспотребнадзором 23.07.2006 [10]; Методическими рекомендациями «Выделение и идентификация бактерий желудочно-кишечного тракта животных», утв. Минсельхозом 11.05. 2004 [11]. Для определения антимикробной активности отвара корневищ и корней кровохлебки лекарственной использовали метод диффузии в агар (способ «колодцев») [12]. Определение проводили по отношению к пяти 24-часовым тест-культурам (S. aureus, E. coli, B. cereus, P. mirabilis, Lactobacillus spp., Bifido-bacterium spp.). Микробную взвесь, содержащую 500 млн микробных тел в 1 мл, вносили в лунки по 0,1 мл. Критерии полученных результатов: отсутствие зоны задержки роста – испытуемая культура не чувствительна к данной концентрации испытуемого образца; диаметр зоны задержки 10 мм – умеренная чувствительность; более 10 мм – высокая чувствительность.
Данные были получены методом количественного анализа, обработаны статистически (табл. 2).
Результаты и их обсуждение. Была исследована способность отвара корней и корневищ кровохлебки ингибировать рост условно-патогенной (S. aureus, E. coli, B. cereus, P. Mirabilis) и нормальной микрофлоры тела животных и человека (Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp.). Негативное влияние на организм животных и человека условно-патогенных микроорганизмов с измененными свойствами (патогенными, токсигенными) или попавшими в несвойственные им биотопы не вызывает сомнения у лечащих врачей. Поэтому совершенствование методов борьбы с ними является одной из стратегий развития терапевтических приемов. В то же время, применяя химиотерапевтические и другие фармацевтические препараты, нужно учитывать сохранение представителей нормофлоры. Выживаемость молочнокислых микроорганизмов является принципиальным фактором при лечебно-профилактических мероприятиях, так как нарушение микроэкологии слизистых оболочек и кожи животных и человека опосредует развитие прогнозируемых и неожиданных последствий для организма.
В связи с этим, исследуя антимикробную активность некоторых действующих веществ или экстрактов растений, необходимо изучить их влияние не только на возбудителей заболеваний, но также и на нормальных представителей биоценозов организма животных и человека.
По результатам исследования установлено, что при разведении 1:2 (5 /10 мл), с содержанием дубильных веществ 5,74 ± 0,36 %, высокая чувствительность с зоной задержки роста в 13 мм установлена у Staphylococcus aureus, а также нормальной микрофлоры Lactobacillus spp. – 14 мм и Вifidumbacteria spp. – 12 мм. Присутствует рост Escherichia coli без зоны задержки роста и умеренная чувствительность Bacillus cereus – 6 мм, Proteus mirabilis – 8 мм.
В разведении 1:4 (2,5 / 7,5 мл), с содержанием дубильных веществ 3,28 ± 0,48 %, зона задержки роста Staphylococcus aureus составляет 12 мм, умеренная чувствительность наблюдается у Bacillus cereus – 3 мм и Proteus mirabilis – 5 мм; отсутствие зоны задержки роста наблюдается у Escherichia coli.
При разведении 1:8 (1,25 / 8,75 мл), с содержанием дубильных веществ 1,36 ± 0,57 %, наблюдается умеренная задержка роста Staphylococcus aureus – 5 мм, отсутствие зоны задержки роста у Escherichia coli, Bacillus cereus и Proteus mirabilis.
В натуральном разведении (10 / 20 мл), с содержанием дубильных веществ 7,13 ± 0,24 %, у Staphylococcus aureus установлена высокая чувствительность – 17 мм, Escherichia coli – отсутствие зоны задержки роста; умеренная задержка роста у Bacillus cereus – 8 мм, Proteus mirabilis – 10 мм (табл. 2).
Таблица 2
Определение чувствительности условно-патогенных микроорганизмов
в отношении экстракта кровохлебки, мм
|
Разведение экстракта кровохлебки, содержание дубильных веществ |
Staphylococcus aureus |
Escherichia coli |
Bacillus cereus |
Proteus mirabilis |
Lactobacillus spp |
Вifidum bacteria spp. |
|
1:2 (5 /10 мл), 5,74 ± 0,36 %х |
13 |
0 |
6 |
8 |
14 |
12 |
|
1:4 (2,5 / 7,5 мл), 3,28 ± 0,48 %0 |
12 |
0 |
3 |
5 |
13 |
12 |
|
1:8 (1,25 / 8,75 мл), 1,36 ± 0,57 %х |
5 |
0 |
0 |
0 |
10 |
9 |
|
Натур. (10 / 20 мл), 7,13 ± 0,24 %х |
17 |
0 |
8 |
10 |
15 |
15 |
Примечание: х – изменения достоверны относительно контроля (р < 0,05); 0 – изменения недостоверны относительно контроля (р > 0,05); % – в пересчете на танин в абсолютно сухом сырье.
В соответствии с полученными данными установлено, что к экстракту кровохлебки наиболее чувствителен S. aureus, в связи с чем целесообразно применять различные лекарственные формы, содержащие экстракт кровохлебки, при инфекционных заболеваниях, вызванных этим микроорганизмом. В связи нечувствительностью и низкой чувствительностью E. coli, B. cereus, P. mirabilis к экстракту кровохлебки применение лекарственных форм, содержащих экстракт кровохлебки, при заболеваниях, вызванных данными микроорганизмами, может иметь низкую лечебную эффективность.
Ингибирование роста отваром кровохлебки установлено также в отношении молочнокислых микроорганизмов Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. В связи с этим существует риск развития дисбиотических нарушений на слизистых оболочках, с последующими негативными проявлениями этого состояния на микроэкологию биотопов животных и человека. Поэтому применение экстракта кровохлебки должно быть контролируемым и дозируемым.
Заключение
- Кровохлебка лекарственная обладает антимикробными свойствами. При натуральном разведении, в разведении 1:2 и 1:4 мы видим, что кровохлебка подавляет рост Staphylococcus aureus, Bacillus cereus и Proteus mirabilis.
- Стойкий и активный рост при всех разведениях наблюдается у Escherichia coli, что говорит о нечувствительности этого микроорганизма к действующим антибактериальным веществам, содержащихся в кровохлебке.
- Самая высокая антимикробная активность экстракта кровохлебки наблюдается в отношении к Staphylococcus aureus. Наиболее оптимально применять лекарственные формы, содержащие экстракт кровохлебки, при лечении и профилактике гнойно-септических заболеваниях, вызванных Staphylococcus aureus.
- Экстракт кровохлебки влияет на представителей нормальной микрофлоры, она подавляет рост Lactobacillus spp. и Вifidumbacteria spp. В соответствии с этим применение лекарственных форм, содержащих экстракты кровохлебки, per os нежелательно. Рекомендуемый прием препаратов, содержащих экстракт кровохлебки, – парентеральный.
1. Селезнева Е.С., Папаяни О.И., Попов И.В. Изучение антимикробной активности извлечений травы и подземных органов Sangusorba minor L. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. Вып. 73. Пятигорск, 2018. С. 123–127.
2. Антимикробная активность водных извлечений из подземных органов некоторых видов лапчатки / Д.М. Хисямова [и др.] // Фармация. 2016. № 1. С. 32–34.
3. Казеева А.Р., Пупыкина К.А. Изучение содержания основной группы биологически активных веществ в кровохлебке лекарственной в разные фазы вегетации растения // Традиционная медицина. 2015. № 2 (41). 2015. С. 37–38.
4. Мухаметгалиев Н.Р., Идрисова Г.И., Гилазиева Г.З. Сравнительный анализ содержания дубильных веществ в корневищах кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.) // Ученые записки Казанского университета. Сер. Естественные науки. 2015. Т. 157, № 2. С. 58–68.
5. Сапарклычева С.Е., Чапалда Т.Л. Антимикробная активность кровохлебки лекарственной // Аграрное образование и наука УГАУ. Сер. «Биологические науки». Екатеринбург, 2020. С. 10.
6. Евстратенко А.Л. Микробиом верхних дыхательных путей у телят в норме и патологии // Кузбасс: образование, наука, инновации. Молодежный вклад в развитие научно-образовательного центра «Кузбасс»: мат-лы X Инновационного конвента (Кемерово, 30 января 2022 г.). Кемерово: Кемеров. гос. ун-т, 2022. С. 283–286.
7. ОФС.1.5.3.0008.15. Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах. URL: http://pharmacopoeia (дата обращения: 20.01.2023).
8. МУ 4.2.2039-05. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории: метод. указания (утв. Роспотребнадзором, 23.12.2005). URL: https://goo.su/kftu8 (дата обращения: 20.01.2023).
9. Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериям (утв. Минздравом 17.12.1984). URL: https://goo.su/9AZvx (дата обращения: 22.01.2023).
10. Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus – возбудители внутрибольничных инфекций: идентификация и генотипирование: метод. рекомендации (утв. Роспотребнадзором 23.07.2006). URL: https://goo.su/ gtl1 (дата обращения: 15.02.2023).
11. Выделение и идентификация бактерий желудочно-кишечного тракта животных: метод. рекомендации (утв. Минсельхозом 11.05.2004). URL: https://goo.su/1FPIxh (дата обращения: 15.02.2023).
12. Гунар О.В., Каматова Н.И., Евтушенко Н.С. Определение антимикробного действия лекарственных веществ. Практические подходы // Фармация. 2002. № 2. С. 4–7.
