Цель исследования – фенотипическая и генетическая оценка патогенного потенциала штаммов E. coli, изолированных от кошек с заболеваниями мочевыделительной системы. Исследуемый материал – 12 штаммов E. coli, выделенных из мочи кошек с заболеваниями мочевыделительной системы общепринятыми методами и идентифицированных методом масс-спектрометрии. Патогенные и персистентные свойства бактерий определяли фотометрическим методом. Резистентность к фторхинолонам устанавливали диско-диффузионным методом. Гены, детерминирующие синтез адгезинов, факторы колонизации и персистенции, а также резистентности к антибиотикам обнаруживали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием подобранных праймеров. E. coli характеризовались выраженным патогенным потенциалом. Определены особенности биопрофилей культур по экспрессии изученных биологических свойств: гемолитическая активность у бактерий, выделенных в ассоциациях, была достоверно выше, чем у штаммов, изолированных в монокультуре и, напротив, у монокультур были достоверно выше значения способности E. coli к биопленкообразованию и адгезии. К препаратам из группы фторхинолонов E. coli проявляли чувствительность, умеренную резистентность и резистентность. С помощью ПЦР установлено наличие у всех изолятов генетических детерминант вирулентности (papA, fimH, fyuA, kspMTII, hlyA) и резистентности (gyrA, parС, gnrB, gnrS), а также у подавляющего большинства – генов usp и grnA. Полученные данные о патогенном биопрофиле E. coli, выделенных при патологии мочевыделительной системы у кошек, могут использоваться в качестве критерия для поиска и идентификации возбудителя. Установленная резистентность к фторхинолонам у изолятов E. coli свидетельствует о необходимости контроля за их применением. Для успешной терапии крайне необходимо проведение регионального мониторинга резистентности бактерий к антибактериальным препаратам.
E. coli, заболевания мочевыделительной системы, кошки, биопрофиль возбудителей, гены, детерминирующие факторы вирулентности и резистентности к фторхинолонам
Введение. Патологии почек и мочевыводящих путей играют одну из ведущих ролей в нозологии незаразных заболеваний мелких домашних животных и представляют важную проблему для ветеринарной медицины. В видовом спектре микроорганизмов, выделенных из мочи кошек при циститах и мочекаменной болезни, наряду с бактериями рода Staphylococcus выявлено доминирование E. coli [1]. Известно, что кишечная палочка может способствовать развитию инфекционно-воспалительных осложнений, а также рецидиву заболевания, это обусловлено спектром биологических свойств микроорганизмов, инициирующих воспалительный процесс [2]. Однако информации, касающейся биопрофиля E.coli, выделенных от кошек с заболеваниями мочевыводящей системы, не достаточно.
Цель исследования – фенотипическая и генетическая оценка патогенного потенциала штаммов E. coli, изолированных от кошек с заболеваниями мочевыделительной системы.
Условия, материалы и методы. В работе были изучены 12 штаммов E. coli, выделенных из мочи 54 кошек с патологией мочевыделительной системы (мочекаменная болезнь и цистит) и находящихся на лечении в ветеринарных клиниках г. Оренбурга. Пробы мочи получали от больных животных методом катетеризации и доставляли на исследование в течение 1–2 ч. Выделение бактерий проводили стандартными методами. Видовую идентификацию осуществляли с помощью масс-спектрометра MALDI TOF MS серии Microflex LT (BrukerDaltonics, Германия) и программного обеспечения MaldiBioTyper 3,0. Антилизоцимную активность (АЛА), биопленкообразование (БПО), гемолитическую активность (ГА) и показатель адгезии микробных клеток (ПА) определяли стандартными фотометрическими методами. Резистентность к фторхинолонам (энрофлоксацину, ципрофлоксацину, норфлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину) определяли диско-диффузионным методом [3]. Бактериальную дезоксирибонуклеиновую кислоту экстрагировали с помощью реактивов «ДНК-экспресс» («Литех», Россия). Циклический синтез фрагментов ДНК осуществляли с использованием амплификатора «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия). Для определения наличия генов вирулентности и резистентности использовали специфические олигонуклеотидные праймеры, описанные в научных публикациях [4–6] и синтезированные фирмой «Синтол» (Россия) (табл.).
Праймеры, использованные при мультиплексной ПЦР, и размеры ампликонов
|
Ген |
Функция |
Праймеры |
Нуклеотидная последовательность |
Размер, п.н. |
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
|
Адгезины |
|||||
|
1 |
P-пили, ассоциированные с пиелонефритом |
pap A For |
ATGGCAGGTGGTGTTTTGGTG |
720 |
|
|
pap A Rev |
CGTCCCACCATACGTGCTCTTC |
||||
|
2 |
Фимбрии 1-го типа, покрытые белком адгезином |
fimH F |
TCGAGAACGGATAAGCCGTGG |
508 |
|
|
fimH R |
GCAGTCACCTGCCCTCCGGTA |
||||
|
3 |
Афимбриальный фактор адгезии |
afa For |
GCTGGGCAGCAAACTGATAACTCTC |
750 |
|
|
afa Rev |
CATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG |
||||
|
Система захвата и транспорта железа |
|||||
|
4 |
Ген, отвечающий за синтез сидерофора йерсинеабактина |
fyuAFor |
TGATTAACCCCGCGACGGGAA |
880 |
|
|
fyuARev |
CGCAGTAGGCACGATGTTGTA |
||||
|
Белки синтеза полисахаридов капсулы |
|||||
|
5 |
Белок II группы, синтезирующий полисахарид капсулы |
kpsMTII For |
GCGCATTTGCTGATACTGTTG |
270 |
|
|
kpsMTII Rev |
CATCCAGACGATAAGCATGAGCA |
||||
|
Нуклеазы |
|||||
|
6 |
Уропатогенный специфический белок |
usp For |
ACATTCACGGCAAGCCTCAG |
440 |
|
|
usp Rev |
AGCGAGTTCCTGGTGAAAGC |
||||
|
Токсин |
|||||
|
7 |
Гемолизин |
hlyA F |
AACAAGGATAAGCACTGTTCTGGCT |
1 177 |
|
|
hlyA R |
ACCATATAAGCGGTCATTCCCGTCA |
||||
|
Гены резистентности к фторхинолонам (энрофлоксацин, офлоксацин, левофлоксацин) |
|||||
|
8 |
Ген, кодирующий ДНК-гиразу |
gyrA-P1 gyrA-P3 |
TGT CCG AGA TGG CCT GAA GC TGC CGT CAT AGT TAT CAA CGA |
374 |
|
|
9 |
Ген, кодирующий топоизомеразу IV |
parC-3 parC-4 |
CCG TGC GTT GCC GTT TAT TG AAGTGCCGTCGAAGTTTGGCA |
368 |
|
Окончание табл.
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
10 |
Плазмид-опосредованные гены устойчивости к хинолонам |
qnrA-1 qnrA-2 |
ATTTCTCACGCCAGGATTTG GATCGGCAAAGGTTAGGTCA |
516 |
|
11 |
qnrB-1 qnrB-2 |
GATCGTGAAAGCCAGAAAGG ACGATGCCTGGTAGTTGTCC |
469 |
|
|
12 |
qnrS-1 qnrS-2 |
ACGACATTCGTCAACTGCAA TAAATTGGCACCCTGTAGGC |
417 |
Статистический анализ результатов осуществлен с применением программ MS Excel 2007.
Результаты и обсуждение. При бактериологическом исследовании мочи E. coli были выделены в 22,2 % случаев, в 33,3 % микроорганизмы были в виде монокультуры, в 66,7 % – в ассоциациях с другими микроорганизмами (S. aureus, S. intermedius, E. faecalis, K. pneumonia). У выделенных E. coli определен комплекс биологических свойств (биопрофиль), включающий их вирулентные и персистентные характеристики, а также антибиотикорезистентность. Частота обнаружения ГА, БПО и АЛА составляла 100 %, способностью к адгезии характеризовались 66,7 % E. coli. Среднее значение ГА у исследованных штаммов E. coli было равно 6,8 ± 0,85 %, выраженность АЛА составила 1,1 ± 0,05 мкг/мл, а способность образовывать биопленки – 1,43 ± 0,42 у. е.
Далее была определена чувствительность E. coli к фторхинолонам, которые являются оптимальными препаратами для эмпирической терапии неосложненных инфекций как верхних, так и нижних мочевых путей. Выявлено, что по отношению к ципрофлоксацину половина изученных штаммов проявляла чувствительность, а вторая половина – умеренную резистентность; к энрофлоксацину чувствительных штаммов не было, при этом 16,7 % культур характеризовались резистентностью и 83,3 % – умеренной резистентностью. К норфлоксацину все исследованные E. coli проявляли чувствительность, к офлоксацину и левофлоксацину по 16,7 % культур были умеренно резистентными, остальные чувствительными.
Сравнительный анализ распространенности изученных свойств у E. coli, выделенных в монокультуре и ассоциациях, выявил их отличие по способности к биопленкообразованию (50 % штаммов, выделенных в ассоциациях и 100 % изолятов в монокультуре) и адгезии (75 и 50 % соответственно). Установлено, что ГА изолятов E. coli в ассоциациях составила 7,7 ± 0,09 %, тогда как у монокультур – 5,1 ± 0,36 % (p < 0,01), и, напротив, значения БПО и ПА были выше у монокультур (1,7 ± 0,07 и 1,1 ± 0,13 у. е., р < 0,05; 17,0 ± 0,03 и 11,9 ± 0,89 %, р < 0,05). По уровню АЛА выделенные штаммы не отличались (рис.).
|
*** |
|
* |
|
* |
|
** |
Биопрофили E. coli, выделенных в монокультуре и ассоциациях при цистите и МКБ:
БП – биопленкообразование, у. е.; АЛА – антилизоцимная активность, мкг/(мл·ОП);
ГА – гемолитическая активность, %; ПА – показатель адгезии, %; (*) – р ≤ 0,05; (**) – р ≤ 0,01
Затем был охарактеризован вирулентный потенциал штаммов E. coli на уровне генотипа. Установлено, что у всех выделенных культур регистрировались следующие гены, ответственные за адгезию: fim H и pap A и отсутствовали гены afa B и afa C. Это связано с тем, что у грамотрицательных микроорганизмов функцию распознавания и прикрепления осуществляют пили, или фимбрии, а у грамположительных бактерий в адгезии участвуют афимбриальные структуры. Встречаемость данного фактора среди уропатогенных штаммов достаточно сильно варьирует, так, в исследованиях [7] у 45 изолятов эшерихий, выделенных от собак и кошек с инфекциями мочевыводящих путей, не обнаружен ген afa, что согласуется с полученными нами данными. Установлено наличие у всех изолированных нами E. coli гена kps M, детерминирующего синтез капсульного полисахарида, защищающего от иммунной системы хозяина, а также гена hly A, относящегося к порообразующим токсинам, лизирующим эритроциты и ядросодержащие клетки. Ген usp, кодирующий уропатогенный специфичный протеин, выявлен нами у 83,3 % E. coli. Известно, что выработка сидерофоров, определяющих способность бактериальных клеток к захвату железа, повышает жизнеспособность микроорганизмов внутри уретрального тракта и активируется во время инфекции. Показано, что экспрессия сидерофоров повышена в уропатогенах по сравнению с комменсальными штаммами E. coli [8], что демонстрируют проведенные нами исследования, установившие присутствие гена fyu A у всех выделенных изолятов. У всех изученных штаммов также выявлены гены gyr A и par С, ответственные за формирование устойчивости к фторхинолонам, гены qnr B и qnr S, кодирующие белки, уменьшающие связывание хинолона с ДНК и последующее образование комплекса хинолон-гираза; при этом только 66,7 % культур характеризовались наличием гена qrn A.
Проведенный анализ биопрофиля E. coli, выделенных от кошек с заболеваниями мочевыделительной системы, показал, что данные микроорганизмы, как в монокультуре, так и ассоциациях, характеризуются выраженным патогенным потенциалом, который определяется наличием у них комплекса вирулентных и персистентных свойств, включая ГА, АЛА, БПО, адгезию, антибиотикорезистентность. Таким образом, вирулентный биопрофиль E. coli можно применять как критерий скрининга у больных животных возможных возбудителей заболеваний для последующей селективной элиминации. С другой стороны, настораживает факт значительного распространения генов резистентности к антибиотикам из группы фторхинолонов, которые являются препаратами выбора. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фторхинолоны должны использоваться для терапии заболеваний мочевыделительной системы только после определения чувствительности E. coli к антибиотикам данной группы.
Заключение
1. Штаммы, выделенные из мочи кошек с заболеваниями мочевыделительной системы, характеризуются определенным биопрофилем и выраженным патогенным потенциалом.
2. Молекулярно-генетическим методом у уроизолятов с высокой частотой определено наличие генов, кодирующих адгезины, факторы колонизации и персистенции, а также резистентность к фторхинолонам.
1. Видовой состав и резистентность к антибиотикам микроорганизмов, выделенных при патологии мочевыделительной системы у плотоядных / Н.В. Морозова [и др.] // Вестник Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова. 2020. № 1 (58). С. 66–72.
2. Характеристика патогенного потенциала Escherichia coli, выделенных у пациентов с калькулезным пиелонефритом / Т.М. Пашкова [и др.] // Урология. 2021. № 4. С. 19–24.
3. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. М.: Минздрав России, 2005. 62 c.
4. Johnson J.R., Stella A.L. Extended virulence genotypes of Escherichia coli strains from patients with urosepsis in relation to phylogeny and host compromise // J. Infect. Dis. 2000. Vol. 181. P. 261–272.
5. Detection of urovirulence factors in Escherichia coli by multiplex polymerase chain reaction / S. Yamamoto [et al.] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995. Vol.12. P. 85–90.
6. The genetic background of antibiotic resistance among clinical uropathogenic Escherichia coli strains / W. Adamus-Białek [et al.] // Mol. Biol. Rep. 2018. Vol. 45 (5). P. 1055–1065.
7. Babacan O., Izgür M. Detection of virulence factors of Escherichia coli strains isolated from urogenital system infections in dogs and cats // Vet. Hekim. Der. Derg. 2021. Vol. 92(2). P. 132–142.
8. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options / A.L. Flores-Mireles [et al.] // J. Nat. Rev. Microbiol. 2015. Vol. 13(5). P. 269–284.
