Россия
УДК 636.082 Разведение животных. Племенное дело. Генетика
Цель исследования – изучение влияния лизата (КР) мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из жировой ткани (ЖТ) и костного мозга (КМ) баранов на качественные показатели сперматозоидов в процессе трехчасовой инкубации. Было сформировано три группы проб по 10 образцов в каждой: контрольная (сперматозоиды 7 • 1010 кл/мл + буфер РВS 100 мкл, pH – 7,4), первая опытная (сперматозоиды 7 • 1010 кл/мл + лизат (КР) МСК КМ 2 • 108 кл/мл, pH – 7,2), вторая опытная (сперматозоиды 7 • 1010 кл/мл + лизат (КР) МСК ЖТ 2 • 108 кл/мл, pH – 7,2). С целью установления степени переживаемости сперматозоидов в средах, содержащих мезенхимальные стволовые клетки, и определения их влияния на качественные показатели сперматозоидов была проведена четырехэтапная оценка качества спермы: 0; 1; 2 и 3 ч после инкубации спермы с лизатом мезенхимальных стволовых клеток при температуре 37 °С. Сравнение значений производилось на каждом этапе инкубации (0; 1; 2 и 3 ч) внутри каждой группы. Достоверными считались различия при p ≤ 0,01 и p ≤ 0,05. Инкубация спермы баранов в средах, содержащих лизатмезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани и костного мозга, в течение 3 ч при температуре 37 ºС способствует достоверному сохранению жизнеспособности сперматозоидов с наличием следующих морфофункциональных характеристик: прогрессивность движения – (43,10 ± 6,86) % (p < 0,01, КР МСК КМ), (38,31 ± 7,76) % (p < 0,01, КР МСК ЖТ); количество нормальных сперматозоидов (39,40 ± 2,40) % (p < 0,01, КР МСК ЖТ), количество сперматозоидов с дефектами головок: (12,10 ± 1,53) % (p < 0,01, КР МСК КМ) и (13,90 ± 2,14) % (p ≤ 0,05, КР МСК ЖТ).
сперма, бараны-производители, качественные показатели, лизат, мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани и костного мозга
Введение. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) – самообновляющаяся мультипотентная популяция клеток взрослого организма. Согласно многочисленным исследованиям, сегодня они являются признанным инструментом регенеративной терапии в медицине и ветеринарии. Ранее предполагалось, что основным механизмом действия МСК является замещение дефектных или утраченных клеток путем дифференцировки и приживления в месте повреждения. Однако результаты исследований продемонстрировали недолгосрочное функционирование имплантированных клеток, что говорит о важности не самих клеток, как строительного материала ткани, а их регуляторных свойств. Попадая в место повреждения, МСК в ответ на внешние сигналы начинают синтез широкого спектра регуляторных молекул, которые как секретируются вовне, так и высвобождаются при лизисе. Показано, что лизат МСК содержит широкий спектр интрацелюлярных цитокинов. Сегодня лизат МСК исследователи рассматривают как альтернативный живым МСК эффективный способ лечения многих заболеваний [1]. Принимая во внимание результаты апробации МСК в андрологии, в частности как способа, повышающего качество спермы [2–5], актуальным является изучение влияния лизата МСК как бесклеточной альтернативы на качественные характеристики спермы самцов-производителей на примере баранов.
Цель исследования – изучение влияния лизата (КР) мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из жировой ткани (ЖТ) и костного мозга (КМ) баранов на качественные показатели сперматозоидов в процессе трехчасовой инкубации.
Задачи: определить влияние лизата МСК на морфологическую структуру сперматозоидов баранов в процессе трехчасовой инкубации; установить динамику кинематических показателей сперматозоидов баранов в процессе трехчасовой инкубации в средах, содержащих лизат МСК.
Материалы и методы. Исследование было проведено в научно-образовательной лаборатории по трансплантации эмбрионов животных на базе ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины», а также на базе отдела разработки клеточных биотехнологий ООО «НС-Рабиес». Были проведены взятие и исследование спермы половозрелых баранов романовской породы (n = 5) и породы Дорпер (n = 5) в возрасте 1–2,5 лет. Всего было взято 10 образцов (n = 10). Отбор проб был произведен с помощью искусственной вагины модели IMV (Франция) согласно ГОСТ 32222-2013 [6].
Оценка спермы состояла из макро- и микроскопического исследований. При макроскопической оценке проводили исследование объема, запаха и цвета спермы, при микроскопической – определение концентрации, исследование морфологии и подвижности [7].
Исследование проводилось с помощью микроскопа Levenhuk MED 45T. Для подсчета концентрации сперматозоидов использовалась камера Горяева [7]. Оценка морфологии проводилась ручным способом (200 сперматозоидов в каждом образце), оценка подвижности сперматозоидов проводилась с использованием программы Аргус-CASA. Полученные образцы были разведены в соотношении 1 : 100. Оценка аликвоты спермы производилась под увеличением 10 × 10 с использованием камеры Маклера. При оценке подвижности учитывалось количество прогрессивно двигающихся, непрогрессивно двигающихся и неподвижных сперматозоидов. Для оценки морфологии использовалась окраска набором дифференцированного окрашивания Sperm Blue (Microptic) с предварительной фиксацией мазков (фиксатор 10 мин). Экспозиция мазка в красителе составила 18 мин. Далее была проведена микроскопия (увеличение с использованием объектива 100 × 10, иммерсионное масло). При оценке морфологии учитывалось количество нормальных сперматозоидов, а также количество сперматозоидов с дефектами головки, шейки и хвостовой части.
Жировую ткань (ЖТ) и костный мозг (КМ) получали после убоя баранов породы Дорпер (n = 3) в крестьянско-фермерском хозяйстве Ленинградской области. ЖТ (2 см3) вырезали подкожно и помещали в стерильную пробирку с 10 мл транспортировочной среды (буферный раствор, содержащий 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, Gibco, США). КМ (3 см3) брали из бедренной кости иглой для аспирации костного мозга и переносили в стерильную пробирку с гепарином. Пробирки с биоматериалом доставляли в лабораторию при 4–8 °С в течение 3 ч.
В лаборатории отдела разработки клеточных биотехнологий ООО «НС-Рабиес» биоматериал обрабатывали. Жировую ткань в условиях ламинарного бокса промывали буфером PBS, измельчали при помощи микроножниц и инкубировали 45 мин при 37 °С в 0,075 %-м растворе коллагеназы (тип 2) («ПанЭко», Россия) при постоянном помешивании. Полученную суспензию фильтровали, центрифугировали, полученный осадок разводили средой αMEM + 10 % FBS и высевали в культуральные флаконы площадью 25 см2. Через 24 ч среду заменяли и удаляли неприкрепленные клетки. Монослой МСК ЖТ формировался к 10 суткам после выделения.
КМ разбавляли 1 : 1 стерильным раствором PBS, центрифугировали, полученный осадок еще два раза промывали описанным способом. Затем к осадку добавляли среду αMEM + 10 % FBS и высевали в культуральные флаконы площадью 25 см2. Через 24 ч среду заменяли и удаляли неприкрепленные клетки. Спустя 48 ч процедуру повторяли. Монослой МСК КМ формировался к 10-м сут после выделения.
В дальнейшем выделенные МСК пассировали для увеличения их количества. На втором пассаже клетки криоконсервировали и депонировали в криобанке.
Для проведения экспериментов по влиянию компонентов МСК на сохранность и поддержание качества спермы баранов клетки деконсервировали и культивировали в среде αMEM + 10 % FBS. Начиная с 3-го пассажа после размораживания, их использовали в работе.
Для приготовления лизата (КР) МСК отделяли от подложки, отмывали от ростовой среды и суспендировали в PBS с концентрацией 2 · 108 кл/мл. Затем суспензию аликвотировали и фасовали в пробирки Эппендорфа. Лизат получали методом криодеструкции путем двукратного быстрого погружения в жидкий азот (–196 °С) и медленного оттаивания при комнатной температуре. Полученный таким образом лизат содержал высвобожденные внутриклеточные белково-пептидные компоненты МСК и фрагменты клеточных мембран.
Было сформировано три группы проб по 10 образцов в каждой (n = 10): контрольная (сперматозоиды 7 · 1010 кл/мл + буфер РВS 100 мкл, pH – 7,4), первая опытная (сперматозоиды 7 · 1010 кл/мл + лизат (КР) МСК КМ 2 · 108 кл/мл, pH – 7,2), вторая опытная (сперматозоиды 7 · 1010 кл/мл + лизат (КР) МСК ЖТ 2 · 108 кл/мл, pH – 7,2). С целью установления степени переживаемости сперматозоидов в средах, содержащих МСК, и определения их влияния на качественные показатели сперматозоидов была проведена четырехэтапная оценка качества спермы: 0, 1, 2 и 3 ч после инкубации спермы с лизатоммезенхимальных стволовых клеток при температуре 37 °С. Сравнение значений производилось на каждом этапе инкубации (0, 1, 2 и 3 ч) внутри каждой группы. При этом достоверными считались различия при p ≤ 0,01 и p ≤ 0,05.
Статистическая обработка данных была проведена при помощи программы Stattech и Medstatistic «Медицинская Статистика» с вычислением показателей вариационного ряда и t-критерий Стьюдента.
Результаты и их обсуждение. Согласно ранее проведенным исследованиям, за основу был взят протокол использования мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани и костного мозга баранов и козлов в концентрации 2 ∙ 108 кл/мл и сперматозоидов в концентрации 7 · 1010 кл/мл [2].
Результаты влияния лизатамезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани и костного мозга баранов на морфофункциональные характеристики сперматозоидов отражены на рисунках 1–3. При анализе результатов оценки морфологической структуры сперматозоидов, достоверные данные были получены среди значений морфологически нормальных сперматозоидов, а также сперматозоидов с дефектами головки (рис. 1).
* p ≤ 0,01, ** p ≤ 0,05 (достоверно по сравнению с результатами 0 часов инкубации спермы)
Рис. 1. Результаты оценки морфологии сперматозоидов баранов
в процессе трехчасовой инкубации с лизатом МСК (КР) (M±m, n=10).
Согласно данным рисунка 1, статистически значимое снижение количества нормальных сперматозоидов в процессе трехчасовой инкубации было зарегистрировано в контрольной и второй опытной (КР МСК ЖТ) группах. При этом в течение 1-го ч инкубации разница значений в контрольной и второй опытной группах составила 6,3 % (p ≤ 0,05) и 4,4 % (p ≤ 0,01), в течение 2-го часа – 6,5 % (p ≤ 0,05) и 8,9 % (p ≤ 0,01), в течение 3-го часа – 11,4 % (p ≤ 0,01) и 11,1 % (p ≤ 0,01) по сравнению с показателями 0 часов инкубации. Что касается наличия дефектов в морфологической структуре сперматозоидов, то достоверная разница значений была определена в контрольной группе: увеличение количества сперматозоидов с дефектами хвоста на 8,6 % (p ≤ 0,01) в процессе двухчасовой инкубации. Данная закономерность наблюдалась также в первой опытной группе (КР МСК КМ): увеличение количества сперматозоидов с дефектами головки в процессе 3-часовой инкубации на 5,5 % (p ≤ 0,01); во второй опытной группе (КР МСК ЖТ): увеличение количества сперматозоидов с дефектами головки в процессе 2- и 3-часовой инкубации на 5,0 и 7,3 % (p ≤ 0,01) соответственно. Таким образом, наиболее выраженное сокращение количества нормальных сперматозоидов и увеличение количества сперматозоидов с дефектами головки отмечаются в контрольной группе. Тенденция к сохранению морфологической целостности сперматозоидов наблюдается во второй опытной группе, при инкубации сперматозоидов с лизатоммезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани.
Результаты двигательной активности сперматозоидов отражены на рисунке 2.
Рис. 2. Динамика прогрессивности движений сперматозоидов баранов в процессе трехчасовой инкубации с лизатом МСК (КР) (M±m, n=10)
Согласно данным рисунка 2, статистически значимое уменьшение количества прогрессивно двигающихся сперматозоидов было зарегистрировано в первой и второй опытных группах в течение 2 и 3 ч инкубации. При этом разница значений в первой опытной группе на 3-й час инкубации составила 1,7 раза (p < 0,01); во второй опытной группе – 2,1 раз (p < 0,01). Количество прогрессивно двигающихся сперматозоидов во время двухчасовой инкубации с лизатом МСК из жировой ткани было достоверно уменьшено (p ≤ 0,05) и составляло (68,80 ± 3,30) %.
Было зарегистрировано уменьшение количества непрогрессивных сперматозоидов и увеличение количества неподвижных во всех исследуемых группах в течение 2 и 3 ч инкубации (рис. 3). При этом разница значений непрогрессивно двигающихся сперматозоидов в контрольной группе составила 2,1 и 4,6 раза (p < 0,01); в первой опытной группе (КР МСК КМ) – 4,5 и 9,3 раза (p < 0,01); во второй опытной группе (КР МСК ЖТ) – 3,7 и 11,4 раза (p < 0,01) по сравнению с результатами 0 часов инкубации.
Рис. 3. Динамика количества непрогрессивных и неподвижных сперматозоидов баранов
в процессе трехчасовой инкубации с лизатом МСК (КР) (M ± m, n =10)
Согласно данным рисунка 3, статистически значимое увеличение количества неподвижных сперматозоидов отмечалось в контрольной группе на 9,19 % и на 24,33 % (p ≤ 0,05) 2 и 3 часа инкубации, в первой опытной группе (КР МСК КМ) на 9,13 % (p ≤ 0,05), на 15,8 и 48,1 % (p < 0,01) 1, 2 и 3 часа инкубации, а также во второй опытной группе (КР МСК ЖТ) на 17,43 и 50,0 % (p < 0,01) 2 и 3 ч инкубации по сравнению с данными 0 часов инкубации.
Заключение. Исходя из полученных данных, инкубация спермы баранов в средах, содержащих компонент мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани и костного мозга – лизат, в течение 3 ч при температуре 37 °С способствует достоверному сохранению жизнеспособности сперматозоидов с наличием следующих морфофункциональных характеристик: прогрессивность движения – (43,10 ± 6,86) % (p < 0,01, КР МСК КМ), (38,31 ± 7,76) % (p < 0,01, КР МСК ЖТ); количество нормальных сперматозоидов (39,40 ± 2,40) % (p < 0,01, КР МСК ЖТ); количество сперматозоидов с дефектами головок: (12,10 ± 1,53) % (p < 0,01, КР МСК КМ) и (13,90 ± 2,14) % (p ≤ 0,05, КР МСК ЖТ).
Необходимо продолжить исследования с целью использования лизатамезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани и костного мозга в рамках оптимизации протоколов криоконсервации спермы баранов-производителей.
1. Malik S., Malik T. Mesenchymal stem cells lysate as a cell-free therapy: a review // Current biotechnology. 2021. 10 (2). P. 78–87.
2. Влияние МСК из жировой ткани и костного мозга баранов на качественные показатели их сперматозоидов / Е.А. Корочкина [и др.] // Ветеринария. 2024. № 1. С. 34–38.
3. Spermatogenesis after transplantation of adipose tissue-derived mesenchymal stemcells in busulfan-induced azoospermic hamster / N. Karimaghai [et al.] // Iran. J. Basic Med. Sci. 2018. Т. 21, № 7. С. 660–667. DOI: 10.22038/ ijbms.2018.29040.7010.
4. Tamadon, Amin & Zhan-byrbekuly, Ulanbek & Kairgaliyev, Ilyas & Khoradmehr, Arezoo. (2019). Mesenchymal Stem Cell Therapy of Male Infertility. DOI:https://doi.org/10.5772/intechopen.88343.
5. Qamar, Ahmad & Fang, Xun& Kim, Min Jung & Cho, Jongki. Improved viability and fertility of frozen-thawed dog sperm using adipose-derived mesenchymal stem cells // Scientific Reports. 2020. 10. DOI:https://doi.org/10.1038/s41598-020-61803-8.
6. ГОСТ 32222–2013.Средства воспроизводства. Сперма. Методы отбора проб. М.: Стандарт информ, 2018. 10 с.
7. Баженова Н.Б., Племяшов К.В., Корочкина Е.А. Оценка качественных показателей спермы животных: учебно-методическое пособие. СПб.: Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины, 2023. 25 с.
