Состояние и уровень воспроизводства, в том числе и крупного рогатого скота, в современных изменяющихся условиях указывает на необходимость пересмотра основных направлений в работе по искусственному осеменению. Возникшие проблемы из-за снижения интеграции зарубежных технологий в наше животноводство, искусственного ограничения доступа к инновационным технологиям диктуют необходимость к внимательной оценке имеющихся проблем, поиску возможностей их решения. Необходимо восстановление и создание собственной производственной базы с внедрением имеющихся наработок, освоением зарубежного опыта в сфере искусственного осеменения для получения потомства с определенным заданным полом. В решении встающих проблем необходим комплексный подход. Это не только обеспечение полноценным кормлением, моционом выращиваемых телок с подведением их к анатомо-физиологическим параметрам для осеменения в 13–14 месяцев, но и разработка более совершенной – ускоренной технологии разделения Х- и Y-сперматозоидов с минимальным отрицательным воздействием, снижающим показатели качества. Важно понимание свойств получаемой различными технологическими способами сексированной спермы, также возникает необходимость в методиках ее оценки на разных этапах в процессе разделения и эффективности осеменения с учетом влияния различных внешних производственных негативных факторов при использовании. Рассмотрены возможные методики оценки и разделения жизнеспособных спермиев от непригодных к использованию, до подготовки и после проведения разделения. Отражены возможные направления развития технологии с учетом имеющихся научных отечественных и зарубежных разработок. Приведена доступная информация по технологическим этапам уже применяемого процесса сексирования спермы сельскохозяйственных животных и ее производственной оценки. Выделены особенности использования такой спермы для получения высокой оплодотворяемости животных в условиях промышленного животноводства.
воспроизводство, инновационные технологии, сексированная сперма, искусственное осеменение
Введение. От состояния дел по воспроизводству в молочном скотоводстве зависит выполнение основных задач по обеспечению населения такими основными продуктами питания, как молоко и мясо. Существенное увеличение поголовья скота, совершенствование его племенных качеств – это основополагающие задачи применяемых в животноводстве программ. Без современных технологий успешное их решение невозможно [1]. Очевидно, что для развития отечественного животноводства необходим сильный импульс. Инновационной технологией в животноводстве является осеменение сексированной спермой. В молочном животноводстве это направленное получение телочек, в мясном – получение бычков. Мировая наука и зарубежные практики добились получения запланированного пола. В мире существует всего 11 лабораторий, занимающихся этими вопросами и реализующих свою продукцию по всему миру [2].
В настоящее время главной проблемой при внедрении репродуктивных технологий у нас в животноводстве является в первую очередь отсутствие предприятий по производству сексированной спермы, которые могли бы разрабатывать рекомендации по ее применению, контролировали бы процесс получения высоких показателей плодотворного осеменения, с выходом потомства заданного пола.
Применение технологии разделения по полу позволяет получать определенные преимущества в сравнении с обычным осеменением. Размеры новорожденной телочки меньшие, чем бычка, у животного отел и восстановление после родов происходят легче, выше сохранность новорожденных и матерей, возрастают процент плодотворного осеменения и продуктивность. В расчете на одно животное (первотелка) прирост продукции увеличивается на 3–5 %, сервис-период сокращается больше чем на 30 дней, еще уменьшаются и трудозатраты. Получение достаточного количества телочек снижает затраты на закупку животных для восполнения поголовья, появляется возможность реализации излишков. Генетический контроль наследуемых признаков позволяет наращивать показатели по продуктивности, качеству, устойчивости к заболеваниям [2]. Увеличение количества телок за счет использования сексированной спермы экономически обоснованно в молочном скотоводстве, что определяет актуальность развития этого направления.
Цель исследования – выявить проблемы в применении технологии разделения по полу спермы отечественными производителями для получения планируемого роста производительности животноводства.
Материалы и методы. Собраны и обобщены доступные материалы отечественных и зарубежных ученых, их результаты и наблюдения при производстве и использовании сексированной спермы.
Результаты и их обсуждение. Решение вопроса разделения спермиев по полу технологически возможно в двух направлениях: химически и технически. Методики разделения базируются на физико-химических, биологических свойствах спермы: на разнице размера, массы, скорости движения, количества определенных генов. Набор предлагаемых способов разделения Х- и Y-сперматозоидов достаточно широк: осаждением, центрифугированием в градиенте плотности, электрофорезом, обработкой специфическими антителами и т. д. [3].
Не стоит сбрасывать со счетов использование химического разделения, хотя зарубежные авторы считают это неперспективным, когда в разбавители или в семенную жидкость включают вещества, ослабляющие подвижность избирательно мужских или женских спермиев. В таких опытах достигалось увеличение рождаемости до 60–70 % по заданному полу [4]. Целесообразно рассмотрение применения химических методов в комбинации с техническими.
Среди перспективных можно выделить способы: одновременного приложения силы выталкивания сперматозоидов, которые затем разделяются в различных участках среды; пропускание сперматозоидов через фильтры из шариков двух диаметров: крупные – для Х-хромосомных сперматозоидов, мелкие – для несущих Y-хромосому; придание спермиям различной скорости – отклик на градиент плотности, температуры; использование скорости продвижения через колонку с замедляющей средой; использование разной скорости Х- и Y-сперматозоидов (сперматозоид с Y-хромосомой легче, а потому чуть быстрее); по силе флуоресцентного свечения; инактивации ненужных прижиганием лазерным лучом в узком потоке при окрашивании флуорохромом; применение препаратов резиквимода и имиквимода, блокирующих гены, кодирующие толл-подобные рецепторы TLR8, TLR7 на X-сперматозоидах, вызывая снижение либо активацию расщепления глюкозы (увеличивает мужское потомство); кодировка белка Cas9 и гидовую РНК работает против генов на Y-хромосоме (увеличивает женское потомство) [5].
При разделении Х- и Y-сперматозоидов необходимо понимать, что на них воздействуют различные физические, химические, биологические факторы: разбавление, окрашивание, лазерное излучение, центробежное давление, не свойственные при естественном осеменении, которые приводят к некомпенсируемым изменениям, понижающим качественные показатели.
В предлагаемых к использованию способах можно выделить следующие недостатки: способы разделения сперматозоидов не позволяют получить 100 % степень чистоты, отрицательные воздействия сказываются на всех сперматозоидах, сложность устройств и многоступенчатость процессов разделения потоков клеток, трудноосуществимое окрашивание без повреждения ДНК и снижения оплодотворяющей способности, высокий коэффициент преломления окрашенного ядра, требующий его усиления, снижение жизнеспособности сперматозоидов под ультрафиолетовым облучением при выявлении флуоресценции и целый ряд других.
Через дистрибьюторов сексированную сперму голштинской, айрширской, джерсейской, лимузин, шведской, датской красной и других пород по всему миру и в Россию поставляют пять зарубежных компаний: «Семекс Альянс» – Канада, «ABS GlobalInc», «Си-Ар-Ай», «Альта Дженетикс Раша» – США, «ВикингГенетикс» – Дания, работающих с американской фирмой Sexing Technologies, которой принадлежит патент на технологии производства сексированной спермы [3]. Компания допускает использование только своего оборудования, только своими специалистами и дочерними предприятиями с целью монопольного владения и недопущения раскрытия технологий [6].
Развитие направления пошло в 70-х гг. в результате получения на практике убедительных результатов в области проточной цитометрии в лаборатории Лоуренса. Технологии разделения получили возможность точного анализа количества ДНК с дифференциацией Х- и Y-сперматозоидов – мужской спермий содержит приблизительно на 4 % меньше ДНК, чем женский [1]. Среди пород имеются вариации в разнице массы: джерсеи – 4,22 %; ангусы – 4,07; голштины – 4,01 %.
Приобретая продукцию, нужно понимать, что соотношение в дозе и качество самих получаемых разделенных Х- и Y-спермиев влияют на плодотворное осеменение. Так, CRI («Си-Ар-Ай») реализовывало два торговых продукта с наличием в дозе 75 и 90 % полноценных Х-сперматозоидов: Джен-Чойс-75 и Джен-Чойс-90, дававших разный выход телочек и бычков; отмечаются случаи и подмены продукции недобросовестными дилерами [5].
Фирмой Sexing Technologies предложен усовершенствованный метод Sexed ULTRA™, позволяющий производить и использовать дозы с концентрацией 2,1 млн и с повышенной до 4,1 млн активных клеток (Sexed ULTRA 2M; Sexed ULTRA 4M), для сравнения в обычной дозе – 25 млн и минимально допускаемая к осеменению 10–15 млн. По утверждению авторов, при проведении эксперимента с концентрацией 4 млн оплодотворяемость сексированной спермой практически равнялась по результативности обычному осеменению, а при 2 млн наблюдалось снижение на 20–25 % [2].
Из-за сложности процесса производство предполагает выпуск одного, чаще Х-пола, другой пол утилизируется, в редких случаях производят и Y-продукцию. Производство сексированной спермы включает более 20 различных процессов и этапов.
Начинают процесс с объединения дуплетно полученных эякулятов производителя, проводят санитарный и биологический контроль, удаляют лишнюю плазму, доводя до нужной концентрации, разбавляя специальными разбавителями, с добавлением антибиотика и других компонентов в зависимости от применяемых методов подготовки, разделяют, фасуют и замораживают.
Проведение подготовки эякулята направлено на улучшение качественных показателей спермы производителя, дает гарантию, что только здоровые сперматозоиды будут использоваться во время разделения, это возможно сделать с применением целого ряда различных медицинских методик [7].
Электростатический метод – липопротеиновая оболочка зрелых сперматозоидов имеет отрицательный заряд, обладает электрокинетическим потенциалом в пределах 16–20 mV, молодые, незрелые и старые спермии имеют заряд несколько ниже. Электростатически заряжая положительным зарядом стенки стеклянной трубки при протекании спермы, производят отделение качественных сперматозоидов.
Метод микроэлектрофореза – буфером для электрофореза заполняют камеру, подают электрический ток, напряжение от 6 до 14 мА. К аноду смещаются нормальные сперматозоиды с отрицательным зарядом, а к катоду – с положительным. При этом присутствует повреждающее воздействие электрического тока и гипотонического давления буфера для электрофореза [8].
Метод калибровки плотности – достигается полное отделение мертвых патологических форм сперматозоидов и лейкоцитов. В пробирке формируют несколько слоев жидкостей различной плотности, верхний – сперма. Центрифугируют, вследствие чего полноценные сперматозоиды опускаются в нижний слой, ненужные остаются в первых двух.
Магнитоактивированная клеточная сортировка – выявление ранних маркеров апоптоза (активная каспаза 3-го типа). При фрагментации ДНК на поверхности цитоплазматической мембраны выделяется фосфолипид фосфатидилсерин – используют специальные маркеры. Связанные сперматозоиды задерживает магнитное поле. Для быков применяют наночастицы двух типов, которые связывают с гликанами мембраны: первый тип с антителами к убиквитину и второй – покрытые лектином PNA [8].
За рубежом разделение спермиев проводят методом проточной цитометрии. Он требует проведения окрашивания с помощью флуоресцентной витальной нетоксичной краски Hoechst 33342, которая избирательно связывается с Aденин / Tимин базовой парой. Процесс окрашивания длится 35–40 мин при температуре 30 °С. Применяют для спермиев и краситель Dansyl Lysine, а для выделения мертвых сперматозоидов добавляют иодид пропидия (PI), 7-аминоактиномицин (7-AAD), 4’6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) [9].
Само разделение идет под специальным давлением, температуру в сперме понижают до 18 ºС, устройством создается направленная ориентация клеток в потоке, на которые воздействуют твердотельным лазером. Специальный вибратор образует в растворе микрокапельки, в каждой капле дисперсного раствора содержится один сперматозоид, они заряжаются в зависимости от величины светоизлучения положительно Х или отрицательно Y. За секунду проходит от 40 до 80 тыс. сперматозоидов. Поток разделяют магнитным полем, используют двойные ортогональные детекторы, специальные программы и цифровые устройства для поляризованных X- и Y-сперматозоидов [10]. Компании-ХY (XY Inc.) принадлежало право на применение Клеточного сортера MoFlo-SX, он способен ориентировать спермии при помощи специальных сопел.
При распознавании используется программное обеспечение, дифференцирующее спермии по показателям: MAD, LIN и STR, где MAD – среднее угловое смещение, угол поворота головки сперматозоида относительно траектории, LIN – процент линейности криволинейной дорожки, STR – процент прямой траектории. Другие показатели для спермы, такие как VCL, VSL, VAP, WOB, ALH, BCF, VCL, мало информативны, их в этом процессе отбора не учитывают. Выделяемая четвертая часть от количества спермиев эякулята Х-хромосомная, также четвертая Y-хромосомная, остальная идет как поврежденная, или не распознанная со слабым окрашиванием [3].
Для увеличения концентрации сперматозоиды далее центрифугируют и разбавляют средой для хранения и заморозки, содержащей криопротекторы. Вначале охлаждают до 5 °C, затем фасуют и замораживают в программируемом замораживателе в соломинках объемом 0,25 мл с нанесением кода 529 (для обычной спермы используют код 29). Оценку качества заморозки проводят инкубацией образца в течение 3 ч при температуре 35 °С, включающую определение показателей концентрации, подвижности, бактериальной чистоты, сохранности акросом [1].
В хозяйствах, в отличие от обычного 2-кратного осеменения, цервикально с ректальной фиксацией шейки матки сексированной спермой осеменяют однократно, здесь в большей степени играет роль себестоимость одной дозы, она превышает несексированную в 4–5 раз (до 2 000 руб. и более) [3]. Вначале, при внедрении технологий, и отчасти сейчас некоторые специалисты рекомендуют использовать сексированную сперму только на телках. Проверка практикой показала, что и при осеменении коров с обязательным контролем восстановления после родов результаты получают не хуже. С учетом того, что в летний период уровень оплодотворяемости животных снижается в среднем в 2,5 раза, пропорционально силе теплового перегрева, не рекомендуют применять осеменение сексированной спермой, переходят на обычное [6]. Также при работе с сексированной спермой не рекомендуются гормональные обработки (синхронизация, стимуляция), при их применении отмечено снижение приживляемости зигот. Перед осеменением проводят размораживание соломинки в водяной бане при температуре 35 °С в течение 45 с, от размораживания до введения животному интервал времени не более 10 мин.
Выход телят на 100 коров при использовании Х-спермы в хозяйствах Краснодарского края достигает по двум осеменениям 30–45 телочек, что в 1,5 раза ниже, чем неразделенной по полу, тем не менее для молочного животноводства это экономически выгодно. Доля использования сексированного семени составляет около 25 % [10].
Заключение. Отечественное животноводство нуждается в создании собственных лабораторий, способных заниматься разработкой, проверкой и внедрением технологий по разделению сперматозоидов по полу, разработкой рекомендаций применения в условиях хозяйств. Необходима проработка всех этапов разделения, проведение стандартизации методов, процессов, оборудования и контроля при производстве и применении сексированной спермы. Использование сексированной спермы – инновационный высокоэффективный механизм, который позволит молочным хозяйствам получать стабильную экономическую выгоду. Дальнейшее развитие эффективного молочного животноводства невозможно без использования сексированного семени.
1. Опыт и перспективы использования сексированного семени для увеличения поголовья молочных коров на Кубани / В.В. Усенко [и др.] // Научный журнал КубГАУ. 2014. № 101 (07).
2. Никулин Д.М. Сексированное семя: эффективность применения в молочном животноводстве // Нивы Зауралья. 2014. № 11 (122). С. 78–79.
3. Ерохин А.С., Дунин М.И. Методы регуляции пола у животных / ВНИИплем. М., 2009. 64 с.
4. Пат. RU 2297198C2 С2. Способ разделения клеток спермы, несущих X-хромосому, и клеток спермы, несущих Y-хромосому / Кеннет М. Эванс, Ван Мунстер Эрик Б. № 2002132899113; заявл. 10.12.2004, опубл. 20.04.2007, Бюл. № 11.
5. Takashi U., Natsumi T., Masayuki Sh. Activation of Toll-like receptor 7/8 encoded by the X chromosome alters sperm motility and provides a novel simple technology for sexing sperm. Journal PLOS Biology, 2019 Aug 13;17(8).
6. Леонардо Ф.С. Брито. Прогресс в производстве сексированного семени «Сексинг Технолоджиз Дженетикс». URL: https://www.mkg-nn.ru/index.php/upravlenie-stadom/2-uncategorised/130-progress-v-proizvodstve-seksirovannogo-semeni-seksing-teknolodzhiz-dzhenetiks.
7. A simple zeta method for sperm selection based on membrane charge / Philip J. Chan [et al.] // Fertility and Sterility: Techniques and instrumentation. 2006. Vol. 85, № 2. P. 481–486.
8. Назаренко Р.В., Здановский В.М. Методы селекции сперматозоидов для процедуры интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в программах экстракорпорального оплодотворения (обзор литературы) // Проблемы репродукции. 2019. Т. 25, № 2. С. 83–89.
9. Ormerod M.G., Tribukait B., Giaretti W. Consensus report of the task force on standardisation of DNA flow cytometry in clinical pathology // Analytical Cellular Pathology. (Hindawi Publishing Corporation). 1998. V. 17. № 2. P. 103–110.
10. Эффективность осеменения телок сексированным семенем / М.И. Дунин [и др.] // Молочное и мясное скотоводство. 2011. № 3. С. 9–11.
