с 01.01.2014 по 01.01.2024
Донской государственный аграрный университет (Лесоводства и лесных мелиораций, Доцент)
сотрудник с 01.01.1924 по настоящее время
Новочеркасск, Ростовская область, Россия
Цель исследования – разработка способа создания коллекции генофонда винограда in vitro при совместном применении биотехнологических методов: модификации питательной среды и культивировании растений в условиях пониженной положительной температуры. В процессе культивирования при повышенном содержании сахарозы в питательной среде (50−70 г/л) появлялась осенняя окраска листьев и происходило вызревание побегов у различных сортов винограда: Сыпун черный, Виерул, Цимлянский черный (клон 2-3), Каберне Совиньон, Кумшацкий, Рупестрис дю Ло, Цимладар, более слабое у сортов Красностоп золотовский, Баклановкий, Сибирьковый. Это способствовало продлению сроков беспересадочного хранения растений. Достаточно высокая жизнеспособность растений при концентрации сахарозы 70,0 г/л в течение первых 5 месяцев культивирования постепенно снижалась при культивировании их в течение 8−9 месяцев. Установлена возможность регенерации in vitro растений из вызревших микрочеренков при культивировании их в течение одного года. Для повышения сохранности и жизнеспособности растений осуществляли хранение вызревших пробирочных растений в фармацевтическом шкафу при пониженной положительной температуре 1−8 °С. Растения хранились в плотно закрытых пробирках на твердой культуральной среде. При хранении в этих условиях в течение 3–4 лет растения имели длину вызревшей части побегов 49,8−70,3 %. Лучшее вызревание по сравнению с аборигенными – у межвидовых сортов винограда и подвоев. Через месяц культивирования одревесневших микрочеренков с живыми тканями на твердой питательной среде Мурасиге и Скуга выявлены единичная регенерация побегов и восстановление растений. Культивирование восстановленных растений в стандартных условиях на твердой питательной среде Мурасиге и Скуга с добавлением регулятора роста «Мелафен» в течение 3 месяцев способствовало дальнейшей регенерации и улучшению ростовых процессов как корней, так и побегов. Произошло полное восстановление растений. Доказана возможность беспересадочного хранения пробирочных растений винограда в течение 3−4 лет при сочетании двух факторов: повышенной концентрации сахарозы в составе питательной среды и пониженной положительной температуры 1−8 °С.
виноград, in vitro, коллекция генофонда винограда, сахароза, вызревание винограда, жизнеспособность растений
Введение. На современном этапе развития общества сохранение биоразнообразия растений является глобальной проблемой, так как изменение климата, экологические катастрофы, войны и антропогенное воздействие приводят к уничтожению растительного генофонда и наносят невосполнимый урон биологическому разнообразию Земли.
Микроклональное размножение широко используется в разных странах для создания высококачественного посадочного материала различных сельскохозяйственных культур, тем самым эффективно способствуя развитию сельского хозяйства в настоящее время и в обозримом будущем. Благодаря применению данного метода, появилась возможность создания банков in vitro редких и ценных генотипов растений [1−3].
При хранении коллекций in vitro в оптимальных условиях (t = 20–25 °С) возникает необходимость частого переноса растений на свежую питательную среду, что повышает стоимость хранения образца и увеличивает риск его инфицирования. Кроме того, частое пассирование микропобегов стимулирует активное деление клеток, что может приводить к возникновению сомаклональных вариантов.
Хранение в условиях минимального роста − один из самых эффективных способов содержания коллекций [4−6]. Главный методический подход к депонированию растений in vitro − достижение состояния максимально замедленного метаболизма, способного поддерживать жизнеспособность растительных тканей.
Замедление роста обычно достигается за счет модификации сред [7] или условий культивирования. Наиболее часто для сохранения растений в коллекции применяют пониженные положительные температуры [8], снижение интенсивности освещения, уплотняют питательную среду путем повышения в ней содержания агара [9]. Для торможения роста растений помимо этого в питательную среду добавляют осмотики сорбит [10], манит, ретарданты (например хлорхолинхлорид), гормоны (регуляторы роста) и др. [11]. Следует отметить, что во всех рассмотренных способах продолжительность беспересадочного хранения увеличивается практически вдвое и составляет около 12 месяцев. Однако биологические особенности растений позволяют более продолжительное беспересадочное хранение растений − до 2−3 лет [12].
Известна возможность получения растений in vitro с вызревшей лозой [13]. Авторы отмечают, что теоретически растения с вызревшей лозой in vitro (микросаженцы) можно в течение нескольких лет хранить плотно упакованными в ящиках без освещения при температуре 1−7 °С, перевозить на большие расстояния и создавать коллекцию сортов. Однако это не подтверждено фактическими данными.
Цель исследования – разработка способа создания коллекции генофонда винограда in vitro при совместном применении биотехнологических методов: модификации питательной среды и культивировании растений в условиях пониженной положительной температуры.
Задачи: разработка длительного (до 2−3 лет) депонирования растений винограда in vitro с вызревшей лозой, позволяющего за счет увеличения продолжительности беспересадочного хранения, сокращения трудозатрат и исключения дорогостоящих реактивов повысить экономическую эффективность хранения генофонда винограда in vitro и обеспечить сохранность генетической стабильности образцов.
Материалы и методы. Исследование проводили по общепризнанным в биотехнологии методикам на классических, донских аборигенных, подвойных сортах и сортах винограда селекции института в стационарных лабораторных условиях в период 2014−2021 гг.
Для опытов отбирали растения, регенерированные из апикальных меристем размером 0,1–0,2 мм и размноженные в культуре in vitro. В операционной комнате в ламинарном боксе «Фортран» осуществляли микрочеренкование растений. Длина микрочеренка: 10–12 мм, 1−2 мм над глазком, остальная под глазком.
Полученные микрочеренки высаживали по одному в пробирку на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга следующего состава мг/л: макроэлементы: NH4NO3 – 138, KNO3 – 950, MgSO4 · 7H2O (MgSO4 · 5H2O) – 185, KH2PO4 – 68, CaCl2 · 2H2O – 166; микроэлементы: H3BO3 – 6,2, MnSO4 · 4H2O (MnSO4 · 5H2O) − 22,3, СuSO4 · 5H2O − 0,025, CoCl2 · 6H2O − 0,025, ZnSO4 · 7 H2O − 8,6, Na2MoO4 − 0,25, KJ − 0,83; хелат железа: железо сернокислое 7-водное (FeSO4 · 7Н2O) – 27,8, трилон-Б-Na2ЭДТА – 37,3; витамины: мезоинозит – 50, тиамин HCl – 0,2; ИУК – 0,1–3 мг/л; рН среды перед автоклавированием – 5,7−5,9 (рис. 1).
Культивирование осуществляли в культуральной комнате при освещенности 3,0 тыс. люкс, фотопериоде 16/8 ч, температуре 25–27 ± 2 °С, влажности воздуха 70–75 %.
Повторность опыта 3-кратная, в каждой повторности по 14 растений.
Показатели, учитываемые при регенерации и сохранении растений: приживаемость, гибель от инфекции, гибель из-за отсутствия развития, число корней, длина корней, средняя длина корня, ризогенная зона, высота растений, количество листьев всего и на 1 см побега, скорость роста, коэффициент полярности.
Жизнеспособность растений оценивали по количеству некрозов тканей листьев и побегов: 0 баллов – визуальная гибель растения; 1 балл – некроз более 50 % тканей растения; 2 балла – некроз менее 50 % тканей; 3 балла – растения без некроза.
Результаты и их обсуждение. Установлено, что в процессе культивирования происходит вызревание побегов растений в пробирках, которое зависит от содержания сахарозы в составе питательной среды. Наибольшее число растений сорта Баклановский с вызреванием побегов выявлено при концентрации сахарозы 50−60 г/л (табл. 1).
Таблица 1
Показатели вызревания in vitro растений сорта Баклановский
при различном содержании сахарозы в составе питательной среды (2014 г.)
|
Сахароза, г/л |
Продолжительность хранения, дней |
Вызревших растений, шт. |
Длина вызревшей части побегов, см |
|
20,0 |
330 |
1 |
6,0 |
|
30,0 |
330 |
2 |
2,5 |
|
40,0 |
330 |
3 |
5,3 |
|
50,0 |
330 |
6 |
5,5 |
|
60,0 |
330 |
1 |
4,0 |
Рис. 1. Вызревание растений сорта Сибирьковый в процессе хранения
Вызревание лозы произошло и при культивировании растений сортов Крестовский и Сибирьковый (табл. 2). Лучшее вызревание выявлено при концентрации сахарозы 60,0 г/л, что позволило получить 140 одноглазковых микрочеренков. Этого количества достаточно для регенерации растений, массового их тиражирования и перезакладки коллекции.
Таблица 2
Число вызревших микрочеренков при продолжительном культивировании растений
в зависимости от содержания сахарозы в питательной среде (2011−2012 гг.)
|
Сорт |
Концентрация сахарозы, г/л |
||||||
|
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
Всего |
|
|
Крестовский |
– |
– |
9 |
– |
4 |
73 |
86 |
|
Сибирьковый |
– |
– |
13 |
6 |
16 |
67 |
102 |
|
По двум сортам |
– |
– |
22 |
6 |
20 |
140 |
188 |
В процессе продолжительного беспересадочного хранения пробирочных растений на питательной среде с повышенными концентрациями сахарозы (50−60 г/л) появлялась осенняя окраска листьев и происходило вызревание побегов у 11 различных сортов винограда (табл. 3).
Таблица 3
Показатели вызревания побегов некоторых сортов винограда
при содержании сахарозы в питательной среде 60,0 г/л
|
Сорт |
Продолжительность хранения, дней |
Вызревших растений, шт. |
Длина вызревшей части побегов, см |
|
Сыпун черный |
300 |
11 |
3,9 |
|
Виерул |
300 |
11 |
4,0 |
|
Цимлянский черный (2-3) |
300 |
8 |
3,4 |
|
Кумшацкий |
300 |
5 |
5,1 |
|
Цимладар |
300 |
5 |
2,4 |
|
Баклановский |
300 |
3 |
4,2 |
|
Каберне Совиньон |
330 |
6 |
5,3 |
|
Кумшацкий |
330 |
6 |
4,8 |
|
Рупестрис дю Ло |
330 |
6 |
3,6 |
|
Красностоп золотовский |
330 |
4 |
2,6 |
|
Сибирьковый |
330 |
2 |
3,0 |
Факт вызревания побегов в условиях депонирования является положительным для создания коллекции. Вызрело по 11 растений сортов Сыпун черный и Виерул, 8 растений сорта Цимлянский черный (клон 2-3), по 5−6 растений сортов Каберне Совиньон, Кумшацкий, Рупестрис дю Ло, Цимладар. Более слабое вызревание отмечено у растений сортов Красностоп Золотовский, Баклановский, Сибирьковый.
Таблица 4
Показатели жизнеспособности растений различных сортов при хранении их
на питательной среде с содержанием сахарозы 70,0 г/л (2013 г.)
|
Сорт |
Сохранилось, шт/% |
Высота, см |
Листьев, шт. |
Жизнеспособность, баллы |
|||
|
зеленых |
пожелтевших |
сухих |
|||||
|
Хранение в течение 159 дней |
|||||||
|
Цимлянский черный (клон 2-3) |
19/67,8 |
9,8 |
5,6 |
2,3 |
2,5 |
1,9 |
|
|
Косоротовский |
18/64,2 |
7,5 |
5,8 |
2,4 |
2,8 |
2,1 |
|
|
Кукановский |
9/32,1 |
9,0 |
5,5 |
1,9 |
3,6 |
2,1 |
|
|
Сибирьковый |
15/53,6 |
7,8 |
4,8 |
2,0 |
3,1 |
1,9 |
|
|
Рупестрис дю Ло |
9/32,1 |
5,2 |
4,4 |
1,0 |
1,0 |
2,0 |
|
|
Хранение в течение 247 дней |
|||||||
|
Цимлянский черный (клон 2-3) |
17/60,7 |
10,4 |
3,7 |
2,4 |
4,0 |
1,1 |
|
|
Косоротовский |
17/60,7 |
8,6 |
4,1 |
4,9 |
2,9 |
1,1 |
|
|
Кукановский |
9/32,1 |
9,7 |
3,0 |
3,0 |
4,0 |
1,1 |
|
|
Сибирьковый |
7/25,0 |
8,8 |
5,5 |
3,1 |
5,5 |
1,0 |
|
|
Рупестрис дю Ло |
7/25,0 |
5,7 |
4,0 |
1,9 |
2,5 |
1,1 |
|
|
Хранение в течение 263 дней |
|||||||
|
Косоротовский |
7/25,0 |
– |
3,7 |
4,6 |
5,0 |
1,0 |
|
|
Кукановский |
7/25,0 |
– |
2,0 |
4,0 |
6,6 |
1,0 |
|
|
Сибирьковый |
7/25,0 |
– |
3,0 |
2,7 |
7,0 |
1,0 |
|
|
Рупестрис дю Ло |
4/14,2 |
– |
3,5 |
2,5 |
2,5 |
1,2 |
|
|
Цимлянский черный (клон 2-3), |
0 |
сухие |
0 |
2,0 |
7,3 |
0 |
|
Пониженная положительная температура – фактор, замедляющий ростовые процессы. В связи с этим дополнительно к культивированию при повышенном содержании сахарозы осуществляли хранение вызревших пробирочных растений в фармацевтическом шкафу при пониженной положительной температуре 1−8 °С. Растения хранились в плотно закрытых пробирках с твердой питательной средой.
Вызревшие растения хранили в течение года в фармацевтическом шкафу, а затем они были расчеренкованы и высажены на свежую питательную среду. Выявлено, что микрочеренки сохранили регенерационную способность. Таким образом, установлена возможность регенерации in vitro растений из вызревших микрочеренков, что способствует продлению сроков беспересадочного хранения.
В фармацевтическом шкафу в течение 1 года хранили вызревшие растения сортов Памяти Кострикина, Виерул, Феркаль, Рупестис дю Ло, SO4, в течение 2 лет – растения сортов Крестовский и Сибирьковый, в течение 3 лет – растения сортов Денисовский, Сибирьковый, Фиолетовый ранний, 4 года хранили растения сортов Баклановский, Виерул, Сыпун черный, Цимладар, Сибирьковый (рис. 2). Характеристика их состояния представлена в таблице 5.
Рис. 2. Хранение растений в фармацевтическом шкафу
Таблица 5
Показатели состояния растений после хранения при температуре 8 °С в течение 3–4 лет
|
Сорт |
Длительность хранения, лет |
Растений с вызреванием, шт. |
Высота растений, см |
Вызревание побегов |
||
|
см |
% |
|||||
|
Межвидовые сорта |
||||||
|
Баклановский |
4 |
8 |
10,7 |
4,0 |
49,9 |
|
|
Виерул |
4 |
8 |
10,4 |
7,0 |
67,8 |
|
|
Денисовский |
3 |
3 |
14,6 |
10,3 |
70,3 |
|
|
Фиолетовый ранний |
3 |
3 |
7,3 |
4,3 |
60,9 |
|
|
Аборигенные донские сорта винограда |
||||||
|
Сибирьковый |
3 |
1,0 |
11,0 |
6,0 |
54,5 |
|
|
Сыпун черный |
4 |
11,0 |
9,4 |
5,8 |
64,1 |
|
|
Цимладар |
4 |
6 |
6,9 |
4 |
68,9 |
|
|
Цимлянский черный (клон 2-3) |
4 |
5 |
9,7 |
5,3 |
55,0 |
|
|
Подвойный сорт |
||||||
|
Рупестрис дю Ло |
3 |
6 |
6,3 |
4,3 |
67,7 |
|
Растения после хранения были одревесневшими с различной степенью вызревшей части. Среда в пробирках не высохла. Длина вызревшей части, как это следует из данных таблицы 5, колебалась от 49,8 до 70,3 %. Лучшее вызревание по сравнению с аборигенными отмечено у межвидовых сортов винограда. Вызревание у подвоев также было высоким. У сортов Виерул и Рупестрис дю Ло оно составило 67,8−67,8 %. Более значительное вызревание отмечено у сортов Фиолетовый ранний и Денисовский. Среди аборигенных сортов винограда по степени вызревания выделился Цимладар.
Растения сортов Баклановский, Виерул, Фиолетовый ранний, Денисовский, Сыпун черный, Цимладар и Цимлянский черный были расчеренкованы. Одревесневшие микрочеренки с живыми тканями были высажены на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга.
Учет, проведенный через месяц, показал, что произошла единичная регенерация побегов у сортов Баклановский, Сыпун черный. Кроме этого, отмечено образование побега без корней у сорта Фиолетовый ранний, корней (4 шт.) у сорта Цимладар. У остальных одревесневших микрочеренков развитие отсутствовало. Состояние регенерации растений представлено в таблице 6.
Таблица 6
Показатели регенерации растений в стандартных условиях культивирования (30 дней)
после 3−4 лет хранения при температуре 1−8 °С
|
Сорт |
Продолжительность хранения, лет |
Растения |
Корень |
||
|
Число, шт. |
Длина побега, см |
Число, шт. |
Длина, см |
||
|
Баклановский |
4 |
2 |
2,5 |
1 |
2,3 |
|
0,5 |
1 |
0,5 |
|||
|
Фиолетовый ранний |
3 |
1 |
0,3 |
– |
– |
|
Сыпун черный |
4 |
1 |
1,0 |
1 |
0,8 |
|
Цимладар |
4 |
1 |
– |
4 |
|
Дальнейшее культивирование этих восстановленных растений в стандартных условиях культуральной комнаты при освещенности 2,0–3,0 тыс. люксов, фотопериоде 16 ч, температуре 25–27 ± 2 °С, влажности воздуха 70–75 % на твердой питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением регулятора роста «Мелафен» в концентрации 10–7 способствовало дальнейшей регенерации и улучшению ростовых процессов как корней, так и побегов, что показано в таблице 7. Происходило полное восстановление растений.
Таблица 7
Показатели ростовых процессов восстановленных растений
при культивировании в течение 3 месяцев
|
Сорт |
Корни |
Высота, см |
Число листьев всего, шт. |
Коэффициент полярности |
||
|
Число, шт. |
Длина, см |
Ризогенная зона, см |
||||
|
Фиолетовый ранний |
2,1 |
0,7 |
1,7 |
1,5 |
2,0 |
0,7 |
|
Баклановский |
3,0 |
2,4 |
7,2 |
4,5 |
4,2 |
1,6 |
|
Сыпун черный |
4,6 |
1,6 |
7,3 |
4,6 |
5,1 |
1,5 |
|
Цимладар |
4,0 |
0,9 |
3,6 |
1,7 |
2,0 |
2,1 |
На основании полученных данных впервые доказана возможность беспересадочного хранения пробирочных растений винограда при температуре 1−8 °С в течение 3−4 лет.
Заключение
1. В процессе продолжительного беспересадочного культивирования растений на питательной среде с повышенными концентрациями сахарозы появлялось осенняя окраска листьев и происходило вызревание побегов. Наибольшее число растений с вызреванием побегов обнаружено при концентрации сахарозы 50−70 г/л.
2. Степень вызревания in vitro зависит от сортовых особенностей растений: высокая у сортов Сыпун черный, Виерул, Цимлянский черный (клон 2-3); средняя у сортов Каберне Совиньон, Кумшацкий, Рупестрис дю Ло, Цимладар; слабая у растений сортов Красностоп Золотовский, Баклановский, Сибирьковый.
3. Для дальнейшего замедления ростовых процессов и сохранения уже вызревших растений необходимо осуществлять культивирование их при пониженной положительной температуре.
4. Выявлено, что в результате хранения при температуре 1−8 °С в течение 3–4 лет растения имели длину вызревшей части побегов 49,8−70,3 %. Лучшее вызревание по сравнению с аборигенными отмечено у межвидовых сортов винограда и подвоев.
5. Учет, проведенный через месяц культивирования, показал, что при высадке одревесневших микрочеренков с живыми тканями на твердую питательную среду Мурасиге-Скуга произошли единичная регенерация побегов и восстановление растений.
6. Культивирование этих восстановленных растений в стандартных условиях культуральной комнаты на твердой питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением регулятора роста «Мелафен» в концентрации 10–7 способствовало дальнейшей регенерации и улучшению ростовых процессов как корней, так и побегов. Произошло полное восстановление растений.
7. На основании полученных данных впервые доказана возможность беспересадочного хранения пробирочных растений винограда в течение 3−4 лет при сочетании двух факторов: повышенной концентрации сахарозы в составе питательной среды и пониженной положительной температуры 1−8 °С.
1. Vitis vinifera L. germplasm diversity: a genetic and ampelometric study in ancient vineyards in the South of Basilicata region (Italy) / T. Labagnara [et al.] // Vitis. 2018. 57. № 1. P. 1–8.
2. Полулях А.А., Волынкин В.А., Лиховской В.В. Генетические ресурсы винограда института «Магарач». Проблемы и перспективы сохранения // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2017. № 21 (6). С. 608–616. DOI:https://doi.org/10.18699/VJ17.276.
3. Биотехнологические коллекции растений и криобанки − важная часть Национального банка-депозитария живых систем / А.М. Носов [и др.] // Мат-лы Междунар. науч. конф., посвящ. 85-летию Центрального ботанического сада НАН Беларуси (6–8 июня 2017 г.). Минск, 2017. С. 284–290.
4. Cruz-Cruz C.A., Gonzalez-Arnao M.T., Engelmann F. Biotechnology and Conservation of Plant Biodiversity. Resources. 2013. 2: 73–95. DOI:https://doi.org/10.3390/resources2020073.
5. In vitro techniques for grapevine germplasm conservation / D. Bosco [et al.] // Acta Hortic. 2015; 1082:201–205.
6. Looking for old grapevine varieties / C. Jiménez [et al.] // Vitis. 2019. Vol. 58. № 2. P. 59–60.
7. Митрофанова И.В. Минимализация роста декоративных растений под воздействием химических факторов в культуре in vitro // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: тез. докл. VIII междунар. конф. (9−13 сентября 2003 г., г. Саратов). Саратов: Изд-во торгово-промышленной палаты, 2003. С. 202.
8. Крицкая Т.А., Кашин А.С. Особенности длительного депонирования культуры in vitro некоторых редких и исчезающих видов растений Саратовской области // Известия Саратовского университета. Сер. «Химия. Биология. Экология». 2016. Т. 16, вып. 1. С. 74–80.
9. Дорошенко Н.П., Пузырнова В.Г., Венценосцева Н.С. Плотность питательной среды при культивировании винограда in vitro // Русский виноград. 2019. Т. 9. С. 13–19.
10. Дорошенко Н.П., Пузырнова В.Г. Влияние осмотика сорбит на ростовые процессы винограда в культуре in vitro // Плодоводство и виноградарство Юга России. 2020. № 64 (4). С. 190–209.
11. Пат. RU 2700880. Способ длительного беспересадочного хранения растений винограда в культуре in vitro / Дорошенко Н.П.; патентообладатель Федер. Ростов. аграр. научный центр. № 2017135774; заявл. 05.04.2019; опубл. 11.12.2019, Бюл. № 35.
12. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.
13. Зленко В.А., Котикова И.В., Трошин Л.П. Методы in vitro для размножения оздоровленного посадочного материала винограда // Магарач. Виноградарство и виноделие. 2003. № 3. С. 38−39.
