Izhevsk, Russian Federation
The aim of research is to study the synergistic properties of antibiotics and G. mellonella products. The objects of the study were solutions made from the larvae of the large wax moth and their waste products in different concentrations. A conditionally pathogenic microflora, Escherichia coli, was sown on a nutrient medium (meat-peptone agar) using a disk-diffusion method. The study was carried out in vitro, microorganisms were cultivated in a thermostat at + 28–37º C, the study of the growth of colonies of microorganisms was assessed after 24 hours. Discs with antibiotics (cefazolin, erythromycin, penicillin, levomycin, doxycycline, etc.) were added to the infected medium with E. coli. Each Petri dish contained 4 discs with different antibiotics. Various solutions were added to the disk: an aqueous extract from G. mellonella larvae, light and heavy fractions isolated from the waste products of these larvae in a volume of 0.01 ml. The results showed that the area of inhibition of a 15% solution of the light fraction of waste products is, on average, 2–2.5 times larger with all antibiotics (at P ≤ 0.001), with the exception of erythromycin. In this experiment, a high degree of synergy was noted in terms of the area of inhibition with 15% solutions of light and heavy fractions of waste products. The culture of microorganisms used showed a high degree of resistance to erythromycin, penicillin, lincomycin. In this regard, further study of these antibiotics was impractical, they were excluded from the experiment. It has been proven that the waste products of G. mellonella larvae weaken the antibiotic resistance of E. coli and enhance the effect of a number of antibiotics (levomycytin, enrofloxacin, gentamicin, doxycycline). The aqueous extract of the larvae of the larger wax moth showed no bacterial activity against E. coli.
larger wax moth (Galleria mellonella L.), waste products of G. mellonella larvae, extraction, antibiotic resistance, antimicrobial activity, conditionally pathogenic microorganisms.
Введение. Наращивание темпов роста сельского хозяйства приводит к увеличению объемов применения антибактериальных средств в животноводстве, следствием чего является формирование и распространение антибиотикоустойчивых штаммов бактерий и микромицетов. Использование широкого спектра антибактериальных и ветеринарных лекарственных средств в животноводстве увеличивает риск контаминации пищевой продукции [1, 2]. Европейская сеть по эпиднадзору за устойчивостью к антимикробным препаратам («EARS-Net») ежегодно регистрирует до 400 000 случаев развития полирезистентных инфекций [3, 4]. Бактериальный ответ на «атаку» антибиотика – это яркий пример бактериальной адаптации и вершина эволюции. Поэтому понимание биохимических и генетических основ резистентности имеет первостепенное значение для разработки стратегий по ограничению ее возникновения и распространения, а также создание новаторских терапевтических подходов в отношении организмов, устойчивых ко многим лекарственным препаратам [5]. Одно из перспективных решений данной проблемы – поиск синергетических взаимодействий антибиотик плюс агент, обладающий ингибирующим действием в отношении патогенной микрофлоры. В качестве данного агента могут быть использованы разработанные препараты на основе ингибированных β-лактамаз. Данный механизм защиты является одним из основных для таких важных возбудителей, как S. aureus, Н. influenzae, M. catarrhalis, В. fragilis, K. pneumomae [6].
- качестве агента, усиливающего действие антибиотика, могут быть использованы анти-микробные пептиды, которые по силе действия сопоставимы с антибиотиками [7, 8]. Резистен-тность формируется за счет комплекса следую-щих механизмов: 1) способности накапливать в матриксе внеклеточные ферменты, разрушаю-щие антибиотики; 2) уменьшения площади открытой поверхности клеток при агрегационной природе биопленок; 3) сниженного метаболизма микроорганизмов в биопленке; 4) активного обмена генетической информацией при реком-бинациях, контролирующих передачу генов резистентности к антимикробным препаратам [8–10].
В настоящее время известно, что экстракт из личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L.) проявляет высокую активность в отношении многих микроорганизмов: Mycobacterium tuberculosis, Corinebacterium difteria, Clostridium tetani, Yersinia pestis и др. [11]. Проведены исследования биологически активных пептидных компонентов гемолимфы личинок G. mellonella в условиях их предварительной специфической и неспецифической иммунизации, экстрагирования этиловым спиртом, выделения и изучения методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и МАЛДИ-анализа. Изучение антибактериального действия спиртовых экстрактов показало наличие бактериостатического действия по отношению к E. сoli и Bacillus cereus [12]. Доказано, что микробиом личинок G. mellonella, не подвергавшихся воздействию антибиотиков, несет ряд генов устойчивости к тетрациклину, что указывает на потенциал разнообразного пула генов, устойчивых к антибиотикам ряда тетрациклина [13]. Часть пептидных компонентов гемолимфы личинок восковой моли эффективно экстрагируется 34 %-м этиловым спиртом, что обусловливает ингибирующее действие данных экстрактов на рост грам(-)бактерий [14].
Исходя из анализа литературных данных, раствор из личинок G. mellonella может быть потенциально ингибирующим агентом, усиливающим действие антибиотика. В перспективе полученные эффекты помогут решить проблему антибиотикорезистентности с возможностью использования в медицине, биотехнологии и ветеринарии.
Цель исследования: изучить синергетическое взаимодействие антибиотиков и различных растворов из личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L.) и ее продуктов жизнедеятельности.
Задачи исследования: выявить антибиотикорезистентность условно-патогенного микроорганизма E. coli с добавлением агента в виде водного раствора из личинок G. mellonella, усиливающего действие антибиотика; выявить антибиотикорезистентность условно-патогенного микроорганизма E. coli с добавлением агента в виде водного раствора из продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella, усиливающего действие антибиотика.
Методы и объекты исследования. Для проведения исследования применялись «Методические рекомендации по лабораторному содержанию и разведению большой восковой огневки Galleria mellonella L.» [16]. Эксперименты проводились в соответствии со следующими работами: «Лабораторный практикум по микробиологии» [17], «Микробиология с техникой микробиологических исследований» [18]. Исследования влияния растворов G. mellonella на антибактериальную активность 11 антибиотиков (энрофлоксацин, стрептомицин, цефазолин, эритромицин, пенициллин, неомицин, левомицитин, доксициклин, гентомицин, ликомицин, тилозин) проводились в отношении Escherichia coli. Культура E. coli культивировалась в термостате при +28–37 ºС на мясопептоном агаре. Изучение роста колоний микроорганизмов E. coli оценивали на первые сутки в трехкратной повторности с применением диско-диффузионного метода. В стерильных условиях диски с антибиотиками добавляли в зараженную среду чашек Петри. В каждой чашке Петри располагали по 4 диска с разными антибиотиками. На каждый диск автоматической микропипеткой раскапывали изучаемые растворы определенной концентрации, одинакового объема (табл. 1).
Таблица 1
Схема эксперимента по изучению синергетического взаимодействия антибиотиков
и растворов из G. Mellonella
|
Группа |
Раствор |
Концентрация, % |
Объем |
|
Контроль |
Стерильный физиологический раствор |
|
0,01 мл |
|
1-я опытная |
Водный экстракт личинок G. mellonella (ВЭЛ) |
10 25 |
|
|
2-я опытная |
Легкая фракция продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella (ЛФ ПЖ) |
10 15 20 25 |
|
|
3-я опытная |
Тяжелая фракция продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella (ТФ ПЖ) |
10 15 20 25 |
Водный экстракт личинок G.mellonella готовили в два этапа. Первый этап – нативных личинок экстрагировали 40 % этанолом на период 21 сут. Второй этап – полученный экстракт высушивали на открытом воздухе до образования сухого вещества, к которому добавляли дистиллированную воду, доводя до нужной концентрации. Фракции продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella получали поэтапным экстрагированием 40 % этанолом. Полученный осадок – тяжелая фракция, надосадочная жидкость – легкая фракция. Для определения синергии антибиотиков и изучаемых растворов проводили инкубацию E. coli в термостате при +37 ºС и через 24 ч. Учитывали площадь зоны ингибирования роста условно-патогенной микрофлоры [19].
Результаты исследования и их обсуждение. Было проведено определение активности антибиотиков в композиции с различными формами личинок G. mellonella и ее продуктами жизнедеятельности. Уровень антибиотикорезистентности определяли по площади зоны ингибирования культуры E. coli, результаты представлены на рисунке 1.
|
|
|
|
Физиологический раствор (контроль) |
Водный экстракт личинок G. mellonella (1-я опытная группа) |
|
|
|
|
|
|
|
Легкая фракция продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella (2-я опытная группа) |
Тяжелая фракция продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella (3-я опытная группа) |
Рис. 1. Зоны ингибирования роста E. coli с использованием дисков
с антибиотиками, пропитанные разными растворами G. mellonella
Среднее значение зоны ингибирования опытных групп по энфлоксацину составило 16,01 мм2, что больше, чем в контроле, на 19,1 %. Наиболее достоверные выдающиеся результаты получены с 25 % ВЭЛ и 15 % ЛФ ПЖ. Также высокую эффективность антибитикорезистентности показали 15 % раствор ТФ ПЖ G.mellonella (на 34,2 % больше, чем в контроле), однако данные не достоверны (табл. 2).
|
104 |
Площадь ингибирования роста E.coli в композиции с формами личинок G.mellonella, мм2
|
Показатель |
Контроль |
ВЭЛ |
ЛФ ПЖ |
ТФ ПЖ |
|||||||
|
10 % |
25 % |
10 % |
15 % |
20 % |
25 % |
10 % |
15 % |
20 % |
25 % |
||
|
|
Энрофлоксацин |
||||||||||
|
x±m |
13,44 ±0,69 |
15,40 ±0,38 |
15,73 ±0,53* |
14,49 ±1,1 |
23,69 ±0,92*** |
– |
13,71 ±1,15 |
11,98 ±0,61 |
18,04 ±0,64 |
– |
15,10 ±0,62 |
|
Cv, % |
16,30 |
6,08 |
5,87 |
15,21 |
6,69 |
|
14,47 |
10,09 |
7,03 |
|
7,15 |
|
|
Цефазолин |
||||||||||
|
x±m |
5,17 ±0,59 |
6,89 ±0,72 |
6,96 ±0,62 |
7,46 ±0,96 |
14,59 ±1,38*** |
4,85 ±0,95 |
6,41 ±0,81 |
7,32 ±1,0,79 |
10,92 ±1,03** |
5,20 ±0,46 |
6,61 ±0,59 |
|
Cv, % |
22,92 |
25,43 |
15,45 |
18,12 |
28,71 |
16,59 |
25,50 |
20,87 |
16,41 |
31,65 |
15,54 |
|
|
Стрептомицин |
||||||||||
|
x±m |
4,56 ±0,45 |
5,23 ±0,39 |
5,05 ±0,84 |
7,47 ±0,09*** |
8,46 ±0,92*** |
2,25 ±0,41*** |
5,68 ±0,45 |
5,16 ±0,36 |
5,08 ±0,46 |
3,26 ±0,15 |
4,62 ±0,82 |
|
Cv, % |
29,71 |
18,36 |
28,69 |
2,17 |
18,91 |
9,43 |
13,58 |
9,87 |
15,68 |
52,71 |
30,91 |
|
|
Неомицин |
||||||||||
|
x±m |
5,62 ±0,32 |
8,29 ±0,84** |
8,02 ±1,13* |
8,04 ±0,76** |
15,11 ±1,36*** |
6,08±0,24** |
8,94 ±0,87*** |
7,16 ±0,09*** |
13,39 ±1,34*** |
6,66 ±0,41 |
9,50 ±0,95* |
|
Cv, % |
29,71 |
18,36 |
28,69 |
2,17 |
18,91 |
9,43 |
13,58 |
9,87 |
15,68 |
52,71 |
30,91 |
|
|
Левомицетин |
||||||||||
|
x±m |
8,32 ±0,76 |
11,57 ±1,32 |
13,70 ±0,95** |
16,07 ±1,77** |
20,20 ±2,06*** |
7,54 ±0,24 |
11,66 ±1,06** |
13,27 ±2,73 |
13,91 ±1,74** |
10,46 ±0,59 |
15,07 ±0,90*** |
|
Cv, % |
27,31 |
27,88 |
11,97 |
19,12 |
17,70 |
27,99 |
15,78 |
29,09 |
21,66 |
26,31 |
10,29 |
|
|
Доксициклин |
||||||||||
|
x±m |
5,74 ±0,68 |
10,30 ±1,20** |
10,30 ±1,20* |
– |
22,77 ±1,49*** |
6,67 ±0,71 |
11,68 ±0,59*** |
8,40 ±0,83** |
14,43 ±0,68*** |
7,90 ±0,98 |
9,03 ±1,07** |
|
Cv, % |
31,18 |
20,22 |
20,22 |
– |
11,34 |
18,50 |
8,80 |
19,87 |
8,11 |
21,59 |
20,43 |
|
|
Гентамицин |
||||||||||
|
x±m |
5,43 ±0,74 |
7,95 ±0,53* |
7,95 ±0,54* |
12,93 ±0,41*** |
15,14 ±0,36*** |
3,50 ±0,32* |
9,62 ±0,47** |
5,77 ±0,38 |
9,31 ±0,62** |
7,79 ±0,77 |
6,46 ±0,37 |
|
Cv, % |
33,4 |
11,6 |
11,6 |
26,2 |
4,1 |
16,0 |
8,4 |
13,1 |
11,5 |
17,2 |
9,9 |
Среднее значение зоны ингибирования опытных групп по цефазолину – 7,72 мм2, что больше, чем в контроле, на 49,3 %. Максимальное достоверное значение площади ингибирования роста E. coli составил у 15 % ЛФ ПЖ – 14,59 мм2. Раствор 15 % ЛФ ПЖ также показал высокие достоверные результаты – на 111 % больше, чем в контроле.
Результаты опыта по ингибированию площади по стрептомицину показали, что средние значения опытных групп на 14,7 % выше, чем в контроле. Достоверные результаты получены в сочетании с 10; 15; 20 и 25 % растворами ЛФ ПЖ. Аналогичные результаты получены с неомицином. Средние значения площади зоны ингибирования на 62,2 % выше контрольных значений. Площадь ингибирования у неомицина совместно с водным экстрактом G. mellonella и ПЖ в среднем на 62,2 % выше, чем в контроле. Из всех опытных групп максимальную площадь ингибирования роста E. coli достоверно выявлено 25 % ТФ ПЖ и 15 % ЛФ ПЖ.
Результаты ингибирования роста кишечной палочки левомицетином в композиции с изучаемыми формами в среднем на 60,3 % выше, чем в контроле, что так же, как в предыдущих экспериментах, указывает на эффективность подавления роста условно-патогенной микрофлоры. Максимальные значения площади ингибирования – в композиции с 10 и 15 % ЛФ ПЖ.
Доксициклин совместно с формами G. mellonella в среднем продемонстрировал лучшее подавление условно-патогенной микрофлоры (на 96,6 %) по сравнению с контролем. Из всех рассматриваемых форм максимальная площадь ингибирования отмечается с 15 % ЛФ ПЖ и ТФ ПЖ.
Исследуемые формы G. mellonella в композиции с гентамицином показали следующие результаты. Среднее значение зоны ингибирования опытных групп на 59,1 % выше, чем в контроле. Максимальная площадь зоны ингибирования наблюдались в сочетаниях с 10 и 15 % ЛФ ПЖ (P ≤ 0,001). По ряду антибиотиков (линкомицин, эритромицин, бензилпенициллин, тилозин) в контроле выявлена антибиотикорезистентность штамма E. сoli. В связи с этим в дальнейших исследованиях данные антибиотики будут исключены.
Наибольшая эффективность в отношении E. coli отмечена в композициях 15 % ЛФ и ТФ с энрофлоксацином, цефазолином, неомицином, левомицетином, доксициклином, гентомицином. Разница по опытным группам достоверна. Средняя эффективность композиции антибиотиков с формами G. mellonella наблюдается со стрептомицином (P ≤ 0,001).
Изучение влияния синергетических свойств антибиотиков и продуктов G. mellonella показало, что площадь ингибирования 15 % раствора ЛФ ПЖ достоверно больше в среднем в 2–2,5 раза со всеми антибиотиками (при P ≤ 0,001), за исключением эритромицина. Далее выявлена достоверная синергия 15 % раствора ТФ ПЖ и 25 % раствора ЛФ ПЖ, особенно в сочетании с антибиотиками левомицитин, энрофлоксацин, гентомицин, доклицитин (при P ≤ 0,001). Минимальная площадь ингибирования, близкая к контрольным значениям, – водный экстракт личинок, 20 % растворы ЛФ и ТФ ПЖ. В отдельных случаях 10 % раствор ЛФ ПЖ показал большую площадь ингибирования в сочетании с энрофлоксацином, левомицитином, неомицином.
В данном эксперименте отмечена высокая степень синергии по площади ингибирования с 15 % растворами ЛФ ПЖ и ТФ ПЖ. Используемая культура микроорганизмов показала высокую степень резистентности к эритромицину, пенициллину, линкомицину. В связи с этим дальнейшее изучение этих антибиотиков было не целесообразно, и они были исключчены из эксперимента.
Выводы
- Водный экстракт личинок большой вос-ковой моли не проявлял бактериальной актив-ности в отношении E. coli.
- Продукты жизнедеятельности личинок G. mellonella ослабляют антибиотикорезистент-ность E. coli и усиливают действие ряда анти-биотиков (левомицитин, энрофлоксацин, генто-мицин, доклицитин), что важно при решении проблемы их устойчивости в животноводстве и других сферах деятельности человека. Целе-сообразно продолжить исследования в данном направлении.
1. Prigitano A., Romanò L., Auxilia F. et al. // Journal of Infection and Public Health. 2018. Vol. 11(1). P. 30–34. DOI: 10.1016/ j.jiph.2017.02.010.
2. Minaeva L.P., Shapeleva S.A. Antibiotiki v sel'skom hozyaystve kak faktor formi-rovaniya antimikrobnoy rezistentnosti i istochnik kontaminacii pischevoy produkcii // Uspehi medicinskoy mikologii. 2019. T. 20. S. 441–444.
3. Kosinec A.N., Frolova A.V., Bulavkin V.P. i dr. Antibiotikorezistenost'. Novye vozmozhnosti antibakterial'nogo vozdey-stviya // Vestnik VGMU. 2014. T. 13, № 2. S. 70–77.
4. Babyak A.S., Polina A.V. // Mezhdunarodnyy studencheskiy nauchnyy vestnik. 2017. № 6. URL: http://eduherald.ru/ru/article/view?id=178 71 (data obrascheniya: 12.03.2021).
5. Jose M. Munita, Cesar A. Arias Mechanisms of Antibiotic Resistance // Microbiol Spectr. 2016 Apr; 4(2):https://doi.org/10.1128/microbiolspec.VMBF-0016-2015.
6. Kombinacii penicillinov s ingibitorami beta-laktamaz. URL: https://studwood.ru/177 8687/meditsina/kombinatsii_penitsillinov_ingibitorami_beta_laktamaz (data obrascheniya: 12.03.2021).
7. Lazareva O.I., Sivkova T.N., Prohoro-va T.S. Vliyanie somaticheskogo ekstrakta iz lichinok anizakid na bakterii // Permskiy agrarnyy vestnik. Zootehniya i veteri-nariya. 2018. № 2 (22). S. 140–147.
8. Larionova L.S., Krylova L.S., Drevko Ya.B. i dr. Biotransformaciya M. domestica pri razlichnyh sposobah vvedeniya in vivo // Veterinariya, zootehniya i biotehnologiya. 2018. № 8. S. 21–29.
9. Popova A.K., Kozhevnikov M.A. Primenenie bakteriofagov kak al'ternativnyy metod antibakterial'noy terapii na fone krizisa antibiotikorezistentnosti // Alleya nauki. 2019. № 10 (37). S.198–202.
10. Juan-IgnacioAlós Resistencia bacteriana a los antibióticos: una crisis global Antibiotic resistance: A global crisis // Microbiology Spectrum. 2016 Apr; 4 (2):https://doi.org/10.1128/micro biolspec.VMBF-0016-2015; DOI:https://doi.org/10.1016/j. eimc.2014.10.004.
11. Vinnik Yu.S., Serova E.V., Andreev R.I. i dr. Osobennosti formirovaniya mikrob-nyh bioplenok na razlichnyh substratah. Vozmozhnost' izucheniya bioplenok na zhelch-nyh konkrementah // Nauchnoe obozrenie. Medicinskie nauki. 2014. № 1. S. 62.
12. Spiridonow N.A., Kashparova E.V., Basku-nov B.P. On chemical composition of a biologically active preparation from Galleria mellonella // Comparative of Biochemistry and Physiology. 1992. P. 102–109.
13. Katarzyna Ignasiak, Anthony Maxwell Oxyte-tracycline reduces the diversity of tetracycline-resistance genes in the Galleria mellonella gut microbiome // Microbiology. 2018. Dec 29; 18(1):228. DOI:https://doi.org/10.1186/s12866-018-1377-3.
14. Kostina D.A., Fedotkina O.S., Kleno-va N.A. i dr. Vliyanie biologicheski aktiv-nyh peptidnyh komponentov gemolimfy lichinok Galleria mellonella na rost i fer-mentativnuyu aktivnost' Eischrichia coli // Problemy prikladnoy ekologii i biologii. 2013. № 15. T. 3-1. S. 567–574.
15. Otvos L. Antibacterial peptides isolated from insects // Journal of Peptide Science. 2000. V. 6 (10). R. 497–511.
16. Konovalova T.V. Sovremennye sredstva i metody obespecheniya veterinarnogo blago-poluchiya po infekcionnoy i protozoynoy patologii zhivotnyh, ryb i pchel // Meto-dicheskie rekomendacii po laboratornomu soderzhaniyu i razvedeniyu bol'shoy vosko-voy ognevki Galleria mellonella L. M., 2011. S. 156–178.
17. Grickevich E.R., Buchenkov I.E. i dr. Laboratornyy praktikum po mikrobio-logii. Minsk, 2017. 268 s.
18. Labinskaya A.S. Mikrobiologiya s tehnikoy mikrobiologicheskih issledovaniy. M., 1978. 258 s.
19. MUK 4.2.1890-04.4.2. Metody kontrolya. Biologicheskie i mikrobiologicheskie fak-tory. Opredelenie chuvstvitel'nosti mikro-organizmov k antibakterial'nym prepa-ratam: metod. ukazaniya, 2004. M., 2004.
