Ижевск, Россия
Цель исследования – изучение синергетических свойств антибиотиков и продуктов G. mellonella. Объектами исследования были растворы, сделанные из личинок большой восковой моли и их продуктов жизнедеятельности в разной концентрации. Диско-диффузионным методом на питательную среду (мясопептонный агар) высеивали условно-патогенную микрофлору – Escherichia coli. Исследование проводилось in vitro, микроорганизмы культивировались в термостате при +28–37 ºС, изучение роста колоний микроорганизмов оценивали через 24 ч. Диски с антибиотиками (цефазолин, эритромицин, пенициллин, левомицитин, доксициклин и др.) добавляли в зараженную среду с E. coli. В каждой чашке Петри было по 4 диска с разными антибиотиками. Добавляли на диск разные растворы: водный экстракт из личинок G. mellonella, легкую и тяжелую фракции, выделенные из продуктов жизнедеятельности этих личинок в объеме 0,01 мл. Результаты показали, что площадь ингибирования 15 % раствора легкой фракции продуктов жизнедеятельности больше в среднем в 2–2,5 раза со всеми антибиотиками (при P ≤ 0,001), за исключением эритромицина. В данном эксперименте отмечена высокая степень синергии по площади ингибирования с 15 % растворами легкой и тяжелой фракции продуктов жизнедеятельности. Используемая культура микроорганизмов показала высокую степень резистентности к эритромицину, пенициллину, линкомицину. В связи с этим дальнейшее изучение этих антибиотиков было нецелесообразно, они были исключены из эксперимента. Доказано, что продукты жизнедеятельности личинок G. mellonella ослабляют антибиотикорезистентность E. coli и усиливают действие ряда антибиотиков (левомицитин, энрофлоксацин, гентамицин, доксициклин). Водный экстракт личинок большой восковой моли не проявлил бактериальной активности в отношении E. coli.
большая восковая моль (Galleria mellonella L.), продукты жизнедеятельности личинок G. mellonella, экстрагирование, антибиотикорезистентность, противомикробная активность, условно-патогенные микроорганизмы.
Введение. Наращивание темпов роста сельского хозяйства приводит к увеличению объемов применения антибактериальных средств в животноводстве, следствием чего является формирование и распространение антибиотикоустойчивых штаммов бактерий и микромицетов. Использование широкого спектра антибактериальных и ветеринарных лекарственных средств в животноводстве увеличивает риск контаминации пищевой продукции [1, 2]. Европейская сеть по эпиднадзору за устойчивостью к антимикробным препаратам («EARS-Net») ежегодно регистрирует до 400 000 случаев развития полирезистентных инфекций [3, 4]. Бактериальный ответ на «атаку» антибиотика – это яркий пример бактериальной адаптации и вершина эволюции. Поэтому понимание биохимических и генетических основ резистентности имеет первостепенное значение для разработки стратегий по ограничению ее возникновения и распространения, а также создание новаторских терапевтических подходов в отношении организмов, устойчивых ко многим лекарственным препаратам [5]. Одно из перспективных решений данной проблемы – поиск синергетических взаимодействий антибиотик плюс агент, обладающий ингибирующим действием в отношении патогенной микрофлоры. В качестве данного агента могут быть использованы разработанные препараты на основе ингибированных β-лактамаз. Данный механизм защиты является одним из основных для таких важных возбудителей, как S. aureus, Н. influenzae, M. catarrhalis, В. fragilis, K. pneumomae [6].
- качестве агента, усиливающего действие антибиотика, могут быть использованы анти-микробные пептиды, которые по силе действия сопоставимы с антибиотиками [7, 8]. Резистен-тность формируется за счет комплекса следую-щих механизмов: 1) способности накапливать в матриксе внеклеточные ферменты, разрушаю-щие антибиотики; 2) уменьшения площади открытой поверхности клеток при агрегационной природе биопленок; 3) сниженного метаболизма микроорганизмов в биопленке; 4) активного обмена генетической информацией при реком-бинациях, контролирующих передачу генов резистентности к антимикробным препаратам [8–10].
В настоящее время известно, что экстракт из личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L.) проявляет высокую активность в отношении многих микроорганизмов: Mycobacterium tuberculosis, Corinebacterium difteria, Clostridium tetani, Yersinia pestis и др. [11]. Проведены исследования биологически активных пептидных компонентов гемолимфы личинок G. mellonella в условиях их предварительной специфической и неспецифической иммунизации, экстрагирования этиловым спиртом, выделения и изучения методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и МАЛДИ-анализа. Изучение антибактериального действия спиртовых экстрактов показало наличие бактериостатического действия по отношению к E. сoli и Bacillus cereus [12]. Доказано, что микробиом личинок G. mellonella, не подвергавшихся воздействию антибиотиков, несет ряд генов устойчивости к тетрациклину, что указывает на потенциал разнообразного пула генов, устойчивых к антибиотикам ряда тетрациклина [13]. Часть пептидных компонентов гемолимфы личинок восковой моли эффективно экстрагируется 34 %-м этиловым спиртом, что обусловливает ингибирующее действие данных экстрактов на рост грам(-)бактерий [14].
Исходя из анализа литературных данных, раствор из личинок G. mellonella может быть потенциально ингибирующим агентом, усиливающим действие антибиотика. В перспективе полученные эффекты помогут решить проблему антибиотикорезистентности с возможностью использования в медицине, биотехнологии и ветеринарии.
Цель исследования: изучить синергетическое взаимодействие антибиотиков и различных растворов из личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L.) и ее продуктов жизнедеятельности.
Задачи исследования: выявить антибиотикорезистентность условно-патогенного микроорганизма E. coli с добавлением агента в виде водного раствора из личинок G. mellonella, усиливающего действие антибиотика; выявить антибиотикорезистентность условно-патогенного микроорганизма E. coli с добавлением агента в виде водного раствора из продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella, усиливающего действие антибиотика.
Методы и объекты исследования. Для проведения исследования применялись «Методические рекомендации по лабораторному содержанию и разведению большой восковой огневки Galleria mellonella L.» [16]. Эксперименты проводились в соответствии со следующими работами: «Лабораторный практикум по микробиологии» [17], «Микробиология с техникой микробиологических исследований» [18]. Исследования влияния растворов G. mellonella на антибактериальную активность 11 антибиотиков (энрофлоксацин, стрептомицин, цефазолин, эритромицин, пенициллин, неомицин, левомицитин, доксициклин, гентомицин, ликомицин, тилозин) проводились в отношении Escherichia coli. Культура E. coli культивировалась в термостате при +28–37 ºС на мясопептоном агаре. Изучение роста колоний микроорганизмов E. coli оценивали на первые сутки в трехкратной повторности с применением диско-диффузионного метода. В стерильных условиях диски с антибиотиками добавляли в зараженную среду чашек Петри. В каждой чашке Петри располагали по 4 диска с разными антибиотиками. На каждый диск автоматической микропипеткой раскапывали изучаемые растворы определенной концентрации, одинакового объема (табл. 1).
Таблица 1
Схема эксперимента по изучению синергетического взаимодействия антибиотиков
и растворов из G. Mellonella
|
Группа |
Раствор |
Концентрация, % |
Объем |
|
Контроль |
Стерильный физиологический раствор |
|
0,01 мл |
|
1-я опытная |
Водный экстракт личинок G. mellonella (ВЭЛ) |
10 25 |
|
|
2-я опытная |
Легкая фракция продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella (ЛФ ПЖ) |
10 15 20 25 |
|
|
3-я опытная |
Тяжелая фракция продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella (ТФ ПЖ) |
10 15 20 25 |
Водный экстракт личинок G.mellonella готовили в два этапа. Первый этап – нативных личинок экстрагировали 40 % этанолом на период 21 сут. Второй этап – полученный экстракт высушивали на открытом воздухе до образования сухого вещества, к которому добавляли дистиллированную воду, доводя до нужной концентрации. Фракции продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella получали поэтапным экстрагированием 40 % этанолом. Полученный осадок – тяжелая фракция, надосадочная жидкость – легкая фракция. Для определения синергии антибиотиков и изучаемых растворов проводили инкубацию E. coli в термостате при +37 ºС и через 24 ч. Учитывали площадь зоны ингибирования роста условно-патогенной микрофлоры [19].
Результаты исследования и их обсуждение. Было проведено определение активности антибиотиков в композиции с различными формами личинок G. mellonella и ее продуктами жизнедеятельности. Уровень антибиотикорезистентности определяли по площади зоны ингибирования культуры E. coli, результаты представлены на рисунке 1.
|
|
|
|
Физиологический раствор (контроль) |
Водный экстракт личинок G. mellonella (1-я опытная группа) |
|
|
|
|
|
|
|
Легкая фракция продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella (2-я опытная группа) |
Тяжелая фракция продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella (3-я опытная группа) |
Рис. 1. Зоны ингибирования роста E. coli с использованием дисков
с антибиотиками, пропитанные разными растворами G. mellonella
Среднее значение зоны ингибирования опытных групп по энфлоксацину составило 16,01 мм2, что больше, чем в контроле, на 19,1 %. Наиболее достоверные выдающиеся результаты получены с 25 % ВЭЛ и 15 % ЛФ ПЖ. Также высокую эффективность антибитикорезистентности показали 15 % раствор ТФ ПЖ G.mellonella (на 34,2 % больше, чем в контроле), однако данные не достоверны (табл. 2).
|
104 |
Площадь ингибирования роста E.coli в композиции с формами личинок G.mellonella, мм2
|
Показатель |
Контроль |
ВЭЛ |
ЛФ ПЖ |
ТФ ПЖ |
|||||||
|
10 % |
25 % |
10 % |
15 % |
20 % |
25 % |
10 % |
15 % |
20 % |
25 % |
||
|
|
Энрофлоксацин |
||||||||||
|
x±m |
13,44 ±0,69 |
15,40 ±0,38 |
15,73 ±0,53* |
14,49 ±1,1 |
23,69 ±0,92*** |
– |
13,71 ±1,15 |
11,98 ±0,61 |
18,04 ±0,64 |
– |
15,10 ±0,62 |
|
Cv, % |
16,30 |
6,08 |
5,87 |
15,21 |
6,69 |
|
14,47 |
10,09 |
7,03 |
|
7,15 |
|
|
Цефазолин |
||||||||||
|
x±m |
5,17 ±0,59 |
6,89 ±0,72 |
6,96 ±0,62 |
7,46 ±0,96 |
14,59 ±1,38*** |
4,85 ±0,95 |
6,41 ±0,81 |
7,32 ±1,0,79 |
10,92 ±1,03** |
5,20 ±0,46 |
6,61 ±0,59 |
|
Cv, % |
22,92 |
25,43 |
15,45 |
18,12 |
28,71 |
16,59 |
25,50 |
20,87 |
16,41 |
31,65 |
15,54 |
|
|
Стрептомицин |
||||||||||
|
x±m |
4,56 ±0,45 |
5,23 ±0,39 |
5,05 ±0,84 |
7,47 ±0,09*** |
8,46 ±0,92*** |
2,25 ±0,41*** |
5,68 ±0,45 |
5,16 ±0,36 |
5,08 ±0,46 |
3,26 ±0,15 |
4,62 ±0,82 |
|
Cv, % |
29,71 |
18,36 |
28,69 |
2,17 |
18,91 |
9,43 |
13,58 |
9,87 |
15,68 |
52,71 |
30,91 |
|
|
Неомицин |
||||||||||
|
x±m |
5,62 ±0,32 |
8,29 ±0,84** |
8,02 ±1,13* |
8,04 ±0,76** |
15,11 ±1,36*** |
6,08±0,24** |
8,94 ±0,87*** |
7,16 ±0,09*** |
13,39 ±1,34*** |
6,66 ±0,41 |
9,50 ±0,95* |
|
Cv, % |
29,71 |
18,36 |
28,69 |
2,17 |
18,91 |
9,43 |
13,58 |
9,87 |
15,68 |
52,71 |
30,91 |
|
|
Левомицетин |
||||||||||
|
x±m |
8,32 ±0,76 |
11,57 ±1,32 |
13,70 ±0,95** |
16,07 ±1,77** |
20,20 ±2,06*** |
7,54 ±0,24 |
11,66 ±1,06** |
13,27 ±2,73 |
13,91 ±1,74** |
10,46 ±0,59 |
15,07 ±0,90*** |
|
Cv, % |
27,31 |
27,88 |
11,97 |
19,12 |
17,70 |
27,99 |
15,78 |
29,09 |
21,66 |
26,31 |
10,29 |
|
|
Доксициклин |
||||||||||
|
x±m |
5,74 ±0,68 |
10,30 ±1,20** |
10,30 ±1,20* |
– |
22,77 ±1,49*** |
6,67 ±0,71 |
11,68 ±0,59*** |
8,40 ±0,83** |
14,43 ±0,68*** |
7,90 ±0,98 |
9,03 ±1,07** |
|
Cv, % |
31,18 |
20,22 |
20,22 |
– |
11,34 |
18,50 |
8,80 |
19,87 |
8,11 |
21,59 |
20,43 |
|
|
Гентамицин |
||||||||||
|
x±m |
5,43 ±0,74 |
7,95 ±0,53* |
7,95 ±0,54* |
12,93 ±0,41*** |
15,14 ±0,36*** |
3,50 ±0,32* |
9,62 ±0,47** |
5,77 ±0,38 |
9,31 ±0,62** |
7,79 ±0,77 |
6,46 ±0,37 |
|
Cv, % |
33,4 |
11,6 |
11,6 |
26,2 |
4,1 |
16,0 |
8,4 |
13,1 |
11,5 |
17,2 |
9,9 |
Среднее значение зоны ингибирования опытных групп по цефазолину – 7,72 мм2, что больше, чем в контроле, на 49,3 %. Максимальное достоверное значение площади ингибирования роста E. coli составил у 15 % ЛФ ПЖ – 14,59 мм2. Раствор 15 % ЛФ ПЖ также показал высокие достоверные результаты – на 111 % больше, чем в контроле.
Результаты опыта по ингибированию площади по стрептомицину показали, что средние значения опытных групп на 14,7 % выше, чем в контроле. Достоверные результаты получены в сочетании с 10; 15; 20 и 25 % растворами ЛФ ПЖ. Аналогичные результаты получены с неомицином. Средние значения площади зоны ингибирования на 62,2 % выше контрольных значений. Площадь ингибирования у неомицина совместно с водным экстрактом G. mellonella и ПЖ в среднем на 62,2 % выше, чем в контроле. Из всех опытных групп максимальную площадь ингибирования роста E. coli достоверно выявлено 25 % ТФ ПЖ и 15 % ЛФ ПЖ.
Результаты ингибирования роста кишечной палочки левомицетином в композиции с изучаемыми формами в среднем на 60,3 % выше, чем в контроле, что так же, как в предыдущих экспериментах, указывает на эффективность подавления роста условно-патогенной микрофлоры. Максимальные значения площади ингибирования – в композиции с 10 и 15 % ЛФ ПЖ.
Доксициклин совместно с формами G. mellonella в среднем продемонстрировал лучшее подавление условно-патогенной микрофлоры (на 96,6 %) по сравнению с контролем. Из всех рассматриваемых форм максимальная площадь ингибирования отмечается с 15 % ЛФ ПЖ и ТФ ПЖ.
Исследуемые формы G. mellonella в композиции с гентамицином показали следующие результаты. Среднее значение зоны ингибирования опытных групп на 59,1 % выше, чем в контроле. Максимальная площадь зоны ингибирования наблюдались в сочетаниях с 10 и 15 % ЛФ ПЖ (P ≤ 0,001). По ряду антибиотиков (линкомицин, эритромицин, бензилпенициллин, тилозин) в контроле выявлена антибиотикорезистентность штамма E. сoli. В связи с этим в дальнейших исследованиях данные антибиотики будут исключены.
Наибольшая эффективность в отношении E. coli отмечена в композициях 15 % ЛФ и ТФ с энрофлоксацином, цефазолином, неомицином, левомицетином, доксициклином, гентомицином. Разница по опытным группам достоверна. Средняя эффективность композиции антибиотиков с формами G. mellonella наблюдается со стрептомицином (P ≤ 0,001).
Изучение влияния синергетических свойств антибиотиков и продуктов G. mellonella показало, что площадь ингибирования 15 % раствора ЛФ ПЖ достоверно больше в среднем в 2–2,5 раза со всеми антибиотиками (при P ≤ 0,001), за исключением эритромицина. Далее выявлена достоверная синергия 15 % раствора ТФ ПЖ и 25 % раствора ЛФ ПЖ, особенно в сочетании с антибиотиками левомицитин, энрофлоксацин, гентомицин, доклицитин (при P ≤ 0,001). Минимальная площадь ингибирования, близкая к контрольным значениям, – водный экстракт личинок, 20 % растворы ЛФ и ТФ ПЖ. В отдельных случаях 10 % раствор ЛФ ПЖ показал большую площадь ингибирования в сочетании с энрофлоксацином, левомицитином, неомицином.
В данном эксперименте отмечена высокая степень синергии по площади ингибирования с 15 % растворами ЛФ ПЖ и ТФ ПЖ. Используемая культура микроорганизмов показала высокую степень резистентности к эритромицину, пенициллину, линкомицину. В связи с этим дальнейшее изучение этих антибиотиков было не целесообразно, и они были исключчены из эксперимента.
Выводы
- Водный экстракт личинок большой вос-ковой моли не проявлял бактериальной актив-ности в отношении E. coli.
- Продукты жизнедеятельности личинок G. mellonella ослабляют антибиотикорезистент-ность E. coli и усиливают действие ряда анти-биотиков (левомицитин, энрофлоксацин, генто-мицин, доклицитин), что важно при решении проблемы их устойчивости в животноводстве и других сферах деятельности человека. Целе-сообразно продолжить исследования в данном направлении.
1. Prigitano A., Romanò L., Auxilia F. et al. // Journal of Infection and Public Health. 2018. Vol. 11(1). P. 30–34. DOI: 10.1016/ j.jiph.2017.02.010.
2. Минаева Л.П., Шапелева С.А. Антибиотики в сельском хозяйстве как фактор форми-рования антимикробной резистентности и источник контаминации пищевой продукции // Успехи медицинской микологии. 2019. Т. 20. С. 441–444.
3. Косинец А.Н., Фролова А.В., Булавкин В.П. и др. Антибиотикорезистеность. Новые возможности антибактериального воздей-ствия // Вестник ВГМУ. 2014. Т. 13, № 2. С. 70–77.
4. Бабяк А.С., Полина А.В. // Международный студенческий научный вестник. 2017. № 6. URL: http://eduherald.ru/ru/article/view?id=178 71 (дата обращения: 12.03.2021).
5. Jose M. Munita, Cesar A. Arias Mechanisms of Antibiotic Resistance // Microbiol Spectr. 2016 Apr; 4(2):https://doi.org/10.1128/microbiolspec.VMBF-0016-2015.
6. Комбинации пенициллинов с ингибиторами бета-лактамаз. URL: https://studwood.ru/177 8687/meditsina/kombinatsii_penitsillinov_ingibitorami_beta_laktamaz (дата обращения: 12.03.2021).
7. Лазарева О.И., Сивкова Т.Н., Прохоро-ва Т.С. Влияние соматического экстракта из личинок анизакид на бактерии // Пермский аграрный вестник. Зоотехния и ветери-нария. 2018. № 2 (22). С. 140–147.
8. Ларионова Л.С., Крылова Л.С., Древко Я.Б. и др. Биотрансформация M. domestica при различных способах введения in vivo // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2018. № 8. С. 21–29.
9. Попова А.К., Кожевников М.А. Применение бактериофагов как альтернативный метод антибактериальной терапии на фоне кризиса антибиотикорезистентности // Аллея науки. 2019. № 10 (37). С.198–202.
10. Juan-IgnacioAlós Resistencia bacteriana a los antibióticos: una crisis global Antibiotic resistance: A global crisis // Microbiology Spectrum. 2016 Apr; 4 (2):https://doi.org/10.1128/micro biolspec.VMBF-0016-2015; DOI:https://doi.org/10.1016/j. eimc.2014.10.004.
11. Винник Ю.С., Серова Е.В., Андреев Р.И. и др. Особенности формирования микроб-ных биопленок на различных субстратах. Возможность изучения биопленок на желч-ных конкрементах // Научное обозрение. Медицинские науки. 2014. № 1. С. 62.
12. Spiridonow N.A., Kashparova E.V., Basku-nov B.P. On chemical composition of a biologically active preparation from Galleria mellonella // Comparative of Biochemistry and Physiology. 1992. P. 102–109.
13. Katarzyna Ignasiak, Anthony Maxwell Oxyte-tracycline reduces the diversity of tetracycline-resistance genes in the Galleria mellonella gut microbiome // Microbiology. 2018. Dec 29; 18(1):228. DOI:https://doi.org/10.1186/s12866-018-1377-3.
14. Костина Д.А., Федоткина О.С., Клено-ва Н.А. и др. Влияние биологически актив-ных пептидных компонентов гемолимфы личинок Galleria mellonella на рост и фер-ментативную активность Eischrichia coli // Проблемы прикладной экологии и биологии. 2013. № 15. Т. 3-1. С. 567–574.
15. Otvos L. Antibacterial peptides isolated from insects // Journal of Peptide Science. 2000. V. 6 (10). Р. 497–511.
16. Коновалова Т.В. Современные средства и методы обеспечения ветеринарного благо-получия по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел // Мето-дические рекомендации по лабораторному содержанию и разведению большой воско-вой огневки Galleria mellonella L. М., 2011. С. 156–178.
17. Грицкевич Е.Р., Бученков И.Э. и др. Лабораторный практикум по микробио-логии. Минск, 2017. 268 с.
18. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М., 1978. 258 с.
19. МУК 4.2.1890-04.4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические фак-торы. Определение чувствительности микро-организмов к антибактериальным препа-ратам: метод. указания, 2004. М., 2004.
