The purpose of research is to improve the technology of clonal micropropagation by selecting an effective sterilizing substance and modifying the nutrient media used for growing grape varieties in vitro. Objects: technical grape varieties Granatovyj, Dostojnyj and Krasnostop AZOS. The experiment was carried out on the basis of the selection and biotechnological laboratory of the SKFNTsSVV, Krasnodar, 2020–2022. Merisystems of grape genotypes measuring 0.3–0.5 mm in size were used as initial explants in in vitro culture. Research methods are generally accepted in the practice of clonal micropropagation of plants: sterilization of the starting material, introduction into culture, clonal micropropagation itself, in vitro rooting with subsequent adaptation to in vivo conditions. The most effective method of sterilization of the substances under consideration turned out to be immersion of grape explants in a chlorine-containing solution (50 %). The proportion of aseptic viable explants was 53 %. It has been established that the best medium for the development of grape genotypes is a modified nutrient medium according to A.N. Rebrov’s prescription. Survival of microplants on a modified medium according to A.N. Rebrov with the addition of growth regulators 1.0 mg/l 6-BAP + 0.5 mg/l IAA was 29.4 % for the variety Granatovyj, 31.2 % for Dostojnyj and 41.5 % for Krasnostop AZOS.
grapes, in vitro, meristem, sterilization, nutrient media, biopotential
Введение. Для увеличения срока эксплуатации виноградных насаждений необходим переход к их закладке сертифицированным посадочным материалом [1].
Микроклональное размножение является одним из современных способов репродуцирования растений в культуре тканей и клеток [2]. Полученные растения in vitro генетически идентичны исходному экземпляру. При использовании данного способа происходит освобождение тканей микропобегов от возбудителей многих заболеваний, снижающих урожайность виноградных насаждений до 30–80 % и продолжительность эксплуатации в 1,5–2 раза [3].
Процесс размножения in vitro состоит из следующих методических этапов: интернирование эксплантов и их обеззараживание, обособление апекса, индукция адвентивного побегообразования, укоренение побегов, получение пробирочных растений и их размножение, высадка растений-регенератов в почвенный субстрат.
Получение оздоровленных методом in vitro растений связано с оптимизацией условий их культивирования на каждом этапе [4, 5]. К резкому снижению скорости роста и размножения, а также к ухудшению физиологического состояния регенерантов приводят даже небольшие отклонения от оптимума [6, 7].
Одним из важных условий при работе с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности [8]. Питательная среда – хороший субстрат для развития микроорганизмов. Изолированные от растения апексы, которые высаживаются на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами [9]. Для этого, чтобы предотвратить заражения апексов сортообразцов растений, необходимо проводить как стерилизацию эксплантов, так и самой питательной среды, на которой будут культивироваться апексы [10–12].
Результативность клонального микроразмножения, как отмечают ряд авторов научных исследований, в значительной степени определяется правильным выбором питательных сред, так как состав среды является важнейшим фактором для эффективного морфогенеза и дальнейшего успешного развития первичных эксплантов. Детализированный состав питательных сред, отработанный для одних сортообразцов, в полной мере не может соответствовать для других [13–15].
Таким образом, эффективность микроклонального размножения зависит от многих факторов: морфогенетического потенциала размножаемого растения, стерилизующих веществ при введении в in vitro, от размера, вырезаемого меристемного апекса, состава питательной среды, влажности и температуры на различных этапах, укоренения микрорастений, адаптации винограда к условиям in vivo. Для этого важное значение приобретает изучение того или иного фактора на каждом этапе культивирования микрорастений.
Цель исследований – совершенствование некоторых элементов технологии микроклонального размножения винограда in vitro путем подбора эффективного стерилизующего вещества для вводимых эксплантов и оптимально-приемлемого состава питательной среды для получения безвирусных клонов с целью производства здорового посадочного материала винограда.
Объекты и методы. Объекты – технические сорта винограда Гранатовый (Vitis Vin.), Достойный (Vitis Vin.) и Красностоп АЗОС (Vitis Lab.). Опыт проводился на базе селекционно-биотехнологической лаборатории СКФНЦСВВ, г. Краснодар, 2020–2022 гг. В качестве исходных эксплантов в культуре in vitro использованы меристемы генотипов винограда размером 0,3–0,5 мм. Для стерилизации эксплантов применены: этиловый спирт (70 %), пероксид водорода (3 %), дезинфицирующие таблетки ОКА-ТАБ, содержащие 50 % активного хлора (обработка 0,5 %-м раствором в течение 5 минут с 3-кратной промывкой дистиллированной водой). Для введения сортообразцов винограда in vitro использованы среды – Murasige-Skuga (MS – контроль) (Тимофеева С.Н., Смолькина Ю.В. и др. Технологии микроразмножения in vitro: учеб.-метод. пособие. Саратов, 2016; Реброва А.Н. Патент № 2636030. Питательная среда для ввода и регенерации меристем винограда в условиях in vitro, 17.11.2017). Закладку опытов проводили в трехкратной повторности, в одной повторности 30 пробирок. Наблюдения в опытах проводились по общепринятым в биотехнологии методикам П.Я. Голодрига (1986), Н.П. Дорошенко (2012).
Результаты и их обсуждение. Наиболее действенным стерилизатором из экспериментальных веществ оказалось погружение эксплантов винограда в хлорсодержащий раствор (таблетки ОКА-ТАБ, 50 % активного хлора). Доля асептических жизнеспособных эксплантов составила 53 %. Применение этилового спирта, пероксида водорода характеризуется меньшим процентом выживаемости эксплантов растений винограда ввиду недостаточно эффективной стерилизации (рис. 1).
Рис. 1. Доля эксплантов, % асептических жизнеспособных эксплантов
Прошедшие стерилизацию фрагменты растений высаживали в пробирки на питательные среды, приготовленные по прописи Murasige-Skuga (MS) и модифицированные по прописи А.Н. Реброва. Результаты культивирования первичных эксплантов в течение 18 дней в беспересадочной культуре показали, что повышенная регенерационная активность меристем винограда наблюдалась на экспериментальной среде по прописи А.Н. Реброва (рис. 2).
Рис. 2. Приживаемость меристем селекционно-ценных генотипов в культуре in vitro
сравнение регенерационной активности изучаемых генотипов винограда показало, что приживаемость эксплантов сортов Гранатовый и Красностоп АЗОС была выше на модифицированной среде по прописи А.Н. Реброва, чем в контроле, на 33,4 и 10 %. Адаптированность меристем сорта Достойный к контрольной и модифицированной среде не показало существенного различия и составила всего 1,0 %.
Для изучения влияния регуляторов роста на укоренение, рост и развитие растений винограда in vitro на модифицированной среде по прописи А.Н. Реброва были использованы два варианта сочетания 6-БАП и ИУК, в качестве контроля использована среда с содержанием
6-БАП-1 мг/л (рис. 3).
Рис. 3. Регенерация сортов винограда на модифицированной среде по прописи А.Н. Реброва с различным содержанием регуляторов роста (через 30 дней культивирования)
На основании полученных данных учетов и наблюдений было отмечено, что лучшее развитие генотипов отмечалось на исследуемой среде, содержащей 1,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК. Приживаемость микрорастений сортов Гранатовый, Достойный, Красностоп АЗОС была выше на 11,1 и 11,7 %, чем в контроле, и составляла 29,4 %, 31,2 и 41,5 %. В контрольном варианте – среда с содержанием 6-БАП-1 мг/л, регенерация исследуемых сортов составила 18,3 %, 19,5 и 29,8 %.
В ходе наблюдений была выявлена закономерность, что развитие пробирочных растений происходит не линейно и зависит от следующих факторов: периода развития и сортовой специфики.
Заключение. На этапе введения в культуру in vitro винограда наиболее эффективный стерилизующий агент – таблетки ОКА-ТАБ (50 % активного хлора). Доля асептических жизнеспособных эксплантов составила 53 %.
Оптимизирован компонентный состав питательной среды для выращивания сортов винограда Гранатовый, Достойный и Красностоп АЗОС в культуре in vitro. Приживаемость микрорастений на модифицированной среде по прописи А.Н. Реброва с добавлением регуляторов роста 1,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК составила для сорта Гранатовый – 29,4 %, Достойный – 31,2 и Красностоп АЗОС – 41,5 %.
1. Kulikov I.M., Upadyshev M.T., Vysockij V.A. Dostizheniya i perspektivnye napravleniya biotehnologicheskih issledovanij v FGBNU «Vserossijskij selekcionno-tehnologicheskij ins¬titut sadovodstva i pitomnikovodstva» // Bioteh¬nologiya v plodovodstve: mat-ly mezhdunar. nauch. konf. Samohvalovichi, 2016. S. 26–28.
2. Optimizaciya metodologii polucheniya plodovyh rastenij iz pochek v kul'ture tkanej in vitro / V.A. Zlenko [i dr.] // Magarach. Vinogradarstvo i vinodelie. 2017. № 1. 3 s.
3. Kuharchik N.V. Biotehnologii v plodovodstve Belarusii // Nauka i innovacii. 2016. № 6 (160). S. 17–22.
4. Batukaev A.A., Palaeva D.O., Sobralieva `E.A. Sovershenstvovanie sostava pitatel'nyh sred pri mikrocherenkovanii vinograda in vitro // Nauchnye trudy Severo-Kavkazskogo federal'¬nogo nauchnogo centra sadovodstva, vinogra¬darstva, vinodeliya. Krasnodar, 2018. T. 18. S. 76–80.
5. Yankovskaya M.B. Modifikaciya pitatel'nyh sred pri rabote s kul'turoj in vitro // Geneticheskie osnovy selekcii sel'skohozyajstvennyh kul'tur: mat-ly mezhdunar. nauch.-prakt. konf., pos¬vyasch. pamyati akad. RAN, d-ra s.-h. nauk, prof. N. I. Savel'eva (24-26 maya 2017 g.). Voronezh: Kvarta, 2017. S. 362–366.
6. Bratkova L.G., Malyhina A.N., Cacenko N.N. Priemy adaptacii meriklonov vinograda k uslo-viyam in vivo // Plodovodstvo i vinogradorstvo yuga Rossii. 2015. № 34 (04). S. 14–29.
7. The effect of foliar fertilizing on ecological optimization of the application of fungicides on the productivity and phenolic complex composition of grapes / A.A. Batukaev [et al.] // Rreservation and innovation: expectations at the environmental, economic and social level book of abstracts of 42st world congress of vine and wine 17th general assembly of the oiv. 2019. P. 61–63.
8. Relief of necrosis of the tips of shoots during propagation of grapes in vitro cv. Red ball / N.K. Surakshaa [et al.] // Scientia horticulturae Vol. 248. 2019. P. 118–125.
9. Doroshenko N.P., Puzyrnova V.G. Ozdorovlenie rastenij ot fitoplazm i mikoplazm pri klonal'nom mikrorazmnozhenii vinograda // Russkij vino¬grad. 2018. T. 8. S. 44–52.
10. Phenolics and their antifungal role in grapevine wood decay: Focus on the Botryosphaeriaceae family / C. Lambert [et al.] // Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 60, is. 48. 2012. P. 11859–11868.
11. Zawadzka M., Orlikowska T. Factors modifying regeneration in vitro of adventitious shoots in five red raspberry cultivars // J. Fruit ornamental Plant Res. 2006. Vol. 14. P. 105–115.
12. Control of contamination during micropropa-gation process of Rootstocks Mariana (Prunus mariana) / S. Amiri [et al.] // Annals of Biological Research. 2013. Vol. 4 (3). P. 149–151.
13. Kastrickaya M.S., Zmushko A.A., Krasins-kaya T.A. Mikrorazmnozhenie rastenij roda Prunus L.: iniciaciya i razmnozhenie // Plodo-vodstvo: sb. nauch tr. Samohvalovichi, 2018. T. 30. S. 258–264.
14. Markova M.G., Somova E.N. Vliyanie pita-tel'noj sredy i spektral'nogo sostava sveta na razmnozhenie zemlyaniki in vitro // Agrarnaya nauka Evro-Severo-Vostoka. 2018. T. 63, № 2. S. 35–41.
15. Ivanova-Hanina L.V. Vliyanie sostava substrata na prizhivaemost' mikrorastenij Vitis vinifera L. in vivo // Ekosystemy. 2018. Vol. 13 (43). S. 84–88.
