Цель исследований – совершенствование технологии клонального микроразмножения путем подбора эффективного стерилизующего вещества и модифицирования питательных сред, используемых для выращивания сортообразцов винограда в условиях in vitro. Объекты – техничес¬кие сорта винограда Гранатовый, Достойный и Красностоп АЗОС. Экспериментальный опыт проводился на базе селекционно-биотехнологической лаборатории СКФНЦСВВ, г. Краснодар, 2020–2022 гг. В качестве исходных эксплантов в культуре in vitro использованы мерисистемы генотипов винограда размером 0,3–0,5 мм. Методы исследований – общепринятые в практике клонального микроразмножения растений: стерилизация исходного материала, введение в культуру, собственно клональное микроразмножение, укоренение in vitro с последующей адаптацией к условиям in vivo. Наиболее эффективным способом стерилизации из рассматриваемых веществ оказалось погружение эксплантов винограда в хлорсодержащий раствор (50 %). Доля асептических жизнеспособных эксплантов составила 53 %. Установлено, что наилучшей средой для развития генотипов винограда является модифицированная питательная среда по прописи А.Н. Реброва Приживаемость микрорастений на модифицированной среде по прописи А.Н. Реброва с добавлением регуляторов роста 1,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК составила для сорта Гранатовый – 29,4 %, Достойный – 31,2 и Красностоп АЗОС – 41,5 %.
виноград, in vitro, меристема, стерилизация, питательные среды, биопотенциал
Введение. Для увеличения срока эксплуатации виноградных насаждений необходим переход к их закладке сертифицированным посадочным материалом [1].
Микроклональное размножение является одним из современных способов репродуцирования растений в культуре тканей и клеток [2]. Полученные растения in vitro генетически идентичны исходному экземпляру. При использовании данного способа происходит освобождение тканей микропобегов от возбудителей многих заболеваний, снижающих урожайность виноградных насаждений до 30–80 % и продолжительность эксплуатации в 1,5–2 раза [3].
Процесс размножения in vitro состоит из следующих методических этапов: интернирование эксплантов и их обеззараживание, обособление апекса, индукция адвентивного побегообразования, укоренение побегов, получение пробирочных растений и их размножение, высадка растений-регенератов в почвенный субстрат.
Получение оздоровленных методом in vitro растений связано с оптимизацией условий их культивирования на каждом этапе [4, 5]. К резкому снижению скорости роста и размножения, а также к ухудшению физиологического состояния регенерантов приводят даже небольшие отклонения от оптимума [6, 7].
Одним из важных условий при работе с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности [8]. Питательная среда – хороший субстрат для развития микроорганизмов. Изолированные от растения апексы, которые высаживаются на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами [9]. Для этого, чтобы предотвратить заражения апексов сортообразцов растений, необходимо проводить как стерилизацию эксплантов, так и самой питательной среды, на которой будут культивироваться апексы [10–12].
Результативность клонального микроразмножения, как отмечают ряд авторов научных исследований, в значительной степени определяется правильным выбором питательных сред, так как состав среды является важнейшим фактором для эффективного морфогенеза и дальнейшего успешного развития первичных эксплантов. Детализированный состав питательных сред, отработанный для одних сортообразцов, в полной мере не может соответствовать для других [13–15].
Таким образом, эффективность микроклонального размножения зависит от многих факторов: морфогенетического потенциала размножаемого растения, стерилизующих веществ при введении в in vitro, от размера, вырезаемого меристемного апекса, состава питательной среды, влажности и температуры на различных этапах, укоренения микрорастений, адаптации винограда к условиям in vivo. Для этого важное значение приобретает изучение того или иного фактора на каждом этапе культивирования микрорастений.
Цель исследований – совершенствование некоторых элементов технологии микроклонального размножения винограда in vitro путем подбора эффективного стерилизующего вещества для вводимых эксплантов и оптимально-приемлемого состава питательной среды для получения безвирусных клонов с целью производства здорового посадочного материала винограда.
Объекты и методы. Объекты – технические сорта винограда Гранатовый (Vitis Vin.), Достойный (Vitis Vin.) и Красностоп АЗОС (Vitis Lab.). Опыт проводился на базе селекционно-биотехнологической лаборатории СКФНЦСВВ, г. Краснодар, 2020–2022 гг. В качестве исходных эксплантов в культуре in vitro использованы меристемы генотипов винограда размером 0,3–0,5 мм. Для стерилизации эксплантов применены: этиловый спирт (70 %), пероксид водорода (3 %), дезинфицирующие таблетки ОКА-ТАБ, содержащие 50 % активного хлора (обработка 0,5 %-м раствором в течение 5 минут с 3-кратной промывкой дистиллированной водой). Для введения сортообразцов винограда in vitro использованы среды – Murasige-Skuga (MS – контроль) (Тимофеева С.Н., Смолькина Ю.В. и др. Технологии микроразмножения in vitro: учеб.-метод. пособие. Саратов, 2016; Реброва А.Н. Патент № 2636030. Питательная среда для ввода и регенерации меристем винограда в условиях in vitro, 17.11.2017). Закладку опытов проводили в трехкратной повторности, в одной повторности 30 пробирок. Наблюдения в опытах проводились по общепринятым в биотехнологии методикам П.Я. Голодрига (1986), Н.П. Дорошенко (2012).
Результаты и их обсуждение. Наиболее действенным стерилизатором из экспериментальных веществ оказалось погружение эксплантов винограда в хлорсодержащий раствор (таблетки ОКА-ТАБ, 50 % активного хлора). Доля асептических жизнеспособных эксплантов составила 53 %. Применение этилового спирта, пероксида водорода характеризуется меньшим процентом выживаемости эксплантов растений винограда ввиду недостаточно эффективной стерилизации (рис. 1).
Рис. 1. Доля эксплантов, % асептических жизнеспособных эксплантов
Прошедшие стерилизацию фрагменты растений высаживали в пробирки на питательные среды, приготовленные по прописи Murasige-Skuga (MS) и модифицированные по прописи А.Н. Реброва. Результаты культивирования первичных эксплантов в течение 18 дней в беспересадочной культуре показали, что повышенная регенерационная активность меристем винограда наблюдалась на экспериментальной среде по прописи А.Н. Реброва (рис. 2).
Рис. 2. Приживаемость меристем селекционно-ценных генотипов в культуре in vitro
сравнение регенерационной активности изучаемых генотипов винограда показало, что приживаемость эксплантов сортов Гранатовый и Красностоп АЗОС была выше на модифицированной среде по прописи А.Н. Реброва, чем в контроле, на 33,4 и 10 %. Адаптированность меристем сорта Достойный к контрольной и модифицированной среде не показало существенного различия и составила всего 1,0 %.
Для изучения влияния регуляторов роста на укоренение, рост и развитие растений винограда in vitro на модифицированной среде по прописи А.Н. Реброва были использованы два варианта сочетания 6-БАП и ИУК, в качестве контроля использована среда с содержанием
6-БАП-1 мг/л (рис. 3).
Рис. 3. Регенерация сортов винограда на модифицированной среде по прописи А.Н. Реброва с различным содержанием регуляторов роста (через 30 дней культивирования)
На основании полученных данных учетов и наблюдений было отмечено, что лучшее развитие генотипов отмечалось на исследуемой среде, содержащей 1,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК. Приживаемость микрорастений сортов Гранатовый, Достойный, Красностоп АЗОС была выше на 11,1 и 11,7 %, чем в контроле, и составляла 29,4 %, 31,2 и 41,5 %. В контрольном варианте – среда с содержанием 6-БАП-1 мг/л, регенерация исследуемых сортов составила 18,3 %, 19,5 и 29,8 %.
В ходе наблюдений была выявлена закономерность, что развитие пробирочных растений происходит не линейно и зависит от следующих факторов: периода развития и сортовой специфики.
Заключение. На этапе введения в культуру in vitro винограда наиболее эффективный стерилизующий агент – таблетки ОКА-ТАБ (50 % активного хлора). Доля асептических жизнеспособных эксплантов составила 53 %.
Оптимизирован компонентный состав питательной среды для выращивания сортов винограда Гранатовый, Достойный и Красностоп АЗОС в культуре in vitro. Приживаемость микрорастений на модифицированной среде по прописи А.Н. Реброва с добавлением регуляторов роста 1,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК составила для сорта Гранатовый – 29,4 %, Достойный – 31,2 и Красностоп АЗОС – 41,5 %.
1. Куликов И.М., Упадышев М.Т., Высоцкий В.А. Достижения и перспективные направления биотехнологических исследований в ФГБНУ «Всероссийский селекционно-технологичес¬кий институт садоводства и питомниководства» // Биотехнология в плодоводстве: мат-лы междунар. науч. конф. Самохваловичи, 2016. С. 26–28.
2. Оптимизация методологии получения плодовых растений из почек в культуре тканей in vitro / В.А. Зленко [и др.] // Магарач. Виноградарство и виноделие. 2017. № 1. 3 с.
3. Кухарчик Н.В. Биотехнологии в плодоводстве Беларусии // Наука и инновации. 2016. № 6 (160). С. 17–22.
4. Батукаев А.А., Палаева Д.О., Собралиева Э.А. Совершенствование состава питательных сред при микрочеренковании винограда in vitro // Научные труды Северо-Кавказского федерального научного центра садоводства, виноградарства, виноделия. Краснодар, 2018. Т. 18. С. 76–80.
5. Янковская М.Б. Модификация питательных сред при работе с культурой in vitro // Генетические основы селекции сельскохозяйственных культур: мат-лы междунар. науч.-практ. конф., посвящ. памяти акад. РАН, д-ра с.-х. наук, проф. Н.И. Савельева (24–26 мая 2017 г.). Воронеж: Кварта, 2017. С. 362–366.
6. Браткова Л.Г., Малыхина А.Н., Цаценко Н.Н. Приемы адаптации мериклонов винограда к условиям in vivo // Плодоводство и виноградорство юга России. 2015. № 34 (04). С. 14–29.
7. The effect of foliar fertilizing on ecological optimization of the application of fungicides on the productivity and phenolic complex composition of grapes / A.A. Batukaev [et al.] // Рreservation and innovation: expectations at the environmental, economic and social level book of abstracts of 42st world congress of vine and wine 17th general assembly of the oiv. 2019. P. 61–63.
8. Relief of necrosis of the tips of shoots during propagation of grapes in vitro cv. Red ball / N.K. Surakshaa [et al.] // Scientia horticulturae Vol. 248. 2019. P. 118–125.
9. Дорошенко Н.П., Пузырнова В.Г. Оздоровление растений от фитоплазм и микоплазм при клональном микроразмножении винограда // Русский виноград. 2018. Т. 8. С. 44–52.
10. Phenolics and their antifungal role in grapevine wood decay: Focus on the Botryosphaeriaceae family / C. Lambert [et al.] // Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 60, is. 48. 2012. P. 11859–11868.
11. Zawadzka M., Orlikowska T. Factors modifying regeneration in vitro of adventitious shoots in five red raspberry cultivars // J. Fruit ornamental Plant Res. 2006. Vol. 14. P. 105–115.
12. Control of contamination during micropropa-gation process of Rootstocks Mariana (Prunus mariana) / S. Amiri [et al.] // Annals of Biological Research. 2013. Vol. 4 (3). P. 149–151.
13. Кастрицкая М.С., Змушко А.А., Красинс-кая Т.А. Микроразмножение растений рода Prunus L.: инициация и размножение // Плодоводство: сб. науч тр. Самохваловичи, 2018. Т. 30. С. 258–264.
14. Маркова М.Г., Сомова Е.Н. Влияние питательной среды и спектрального состава света на размножение земляники in vitro // Аграрная наука Евро-Северо-Востока. 2018. Т. 63, № 2. С. 35–41.
15. Иванова-Ханина Л.В. Влияние состава субстрата на приживаемость микрорастений Vitis vinifera L. in vivo // Ekosystemy. 2018. Vol. 13 (43). С. 84–88.
