Russian Federation
Russian Federation
Russian Federation
The purpose of research is to evaluate the effectiveness of representatives of the family. Bacillaceae, isolated from agricultural soils of the Krasnoyarsk Region, against pathogens of fungal diseases of potatoes. The antibiotic activity of 21 strains of p. Bacillus was studied using the counter-culture method, identified as members of B. altitudinis, B. atrophaeus, B. cereus, B. megaterium, B. simplex, B. subtilis and Bacillus sp. and 1 strain p. Peribacillus (identified as P. simplex), isolated by the authors from agricultural soils of the Krasnoyarsk Region, in relation to the causative agents of potato fungal diseases Geotrichum candidum (causal agent of rubber rot), Rhizoctonia solani (causative agent of rhizoctonia blight), Fusarium equiseti (causative agent of fusarium blight), and Alternaria sp. . (the causative agent of Alternaria blight). Of the tested strains, 3 strains did not show antagonism against the indicated pathogens, 1 strain was active only against Alternaria sp., 1 – against Alternaria sp. and R. solani, the remaining 17 strains showed varying degrees of antagonistic activity against all four pathogens. Alternaria sp. showed maximum sensitivity to the set of strains studied (the average zone of growth inhibition by strain is 11.17 mm), the minimum is F. equiseti (the average zone of growth inhibition by strain is 7.33 mm). For G. candidum and R. solani, the average growth inhibition zone across strains was 9.21 and 9.70 mm, respectively. Despite the presence of a statistically significant (p < 0.05) positive correlation between pathogens in terms of sensitivity to antagonist strains (from r = 0.612 between Alternaria sp. and F. equiseti to r = 0.810 between F. equiseti and R. solani), two-factor analysis of variance revealed a statistically significant (p < 0.001) interaction effect between the factors “antagonist strain” and “taxonomic affiliation of the fungus” with an influence strength of 15.41 %. This indicates a different spectrum of antifungal activity in the studied strains and emphasizes the need to use in biological products a set of strains that differ in the spectrum of antifungal activity.
potato, fungal diseases, Geotrichum candidum, Rhizoctonia solani, Fusarium equiseti, Alternaria sp., antagonist strains, Bacillus, Peribacillus
Введение. Картофель (Solanum tuberosum) является одной из важнейших продовольственных культур. Как и другие сельскохозяйственные культуры, картофель поражается целым спектром болезней, существенно снижающих урожай как во время вегетации, так и при хранении. Так, в России потери урожая картофеля от болезней составляют от 13 до 30 % [1].
В настоящее время в качестве одного из наиболее перспективных направлений в защите растений от болезней рассматривается биологический метод, основанный на применении микробных штаммов-антагонистов как альтернативы традиционно используемым химическим препаратам [2]. Широкому распространению биологического метода защиты растений в сельском хозяйстве препятствует очень ограниченная номенклатура биопрепаратов, присутствующих на рынке, что в первую очередь обусловлено недостаточным числом эффективных штаммов-антагонистов. В этой связи поиск таких штаммов и их комбинаций рассматривается в качестве исключительно актуальной задачи [3]. При этом предпочтение должно отдаваться штаммам, выделенным из местных микробных сообществ, и, соответственно, адаптированным к местным почвенно-климатическим условиям. Настоящие исследования посвящены поиску автохтонных штаммов-антагонистов для биологической защиты картофеля от грибных болезней в почвенно-климатических условиях Красноярского края.
Цель исследований – оценить эффективность представителей сем. Bacillaceae, выделенных из сельскохозяйственных почв Красноярского края, против возбудителей грибных болезней картофеля.
Задачи: изучить антибиотическую активность штаммов сем. Bacillaceae в отношении возбудителей ризоктониоза, фузариоза, альтернариоза и резиновой гнили картофеля; проверить наличие индивидуальных различий в спектрах антифунгальной активности изучаемых штаммов.
Объекты и методы. Объектами исследования служили 21 штамм р. Bacillus и 1 штамм р. Peribacillus, выделенные авторами из сельскохозяйственных почв Красноярского края и на этапе предварительных исследований проявившие антибиотическую активность в отношении грибов (табл. 1).
Таблица 1
Штаммы-антагонисты, использованные в работе
|
Штамм |
Таксономическая принадлежность |
Метод идентификации |
|
1 |
2 |
3 |
|
RSA 2 |
Bacillus altitudinis |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 4 |
Bacillus megaterium |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 9 |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 11 |
Bacillus subtilis/ Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 12 |
Peribacillus simplex |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 15 |
Bacillus simplex |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 17 |
Bacillus cereus group / Bacillus subtilis |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 19 |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 20 (1) |
Bacillus subtilis |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 20 (2) |
Bacillus subtilis |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
Ра1 |
Bacillus sp. |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
Ра2 |
Bacillus sp. |
Культурально-морфологический |
|
Ра3 |
Bacillus sp. |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
АЛ3 |
Bacillus cereus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
Ал4 |
Bacillus sp. |
Культурально-морфологический |
|
СХ5 |
Bacillus cereus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
СХ6 |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
*RSA 1 (B-13893) |
Bacillus atrophaeus |
По нуклеотидной последовательности гена 16SpРНК |
|
RSA 8 |
Bacillus atrophaeus |
По нуклеотидной последовательности гена 16SpРНК |
Окончание табл. 1
|
1 |
2 |
3 |
|
RSA 16 (1) |
Bacillus atrophaeus |
По нуклеотидной последовательности гена 16SpРНК |
|
RSA 16 (2) |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 18 |
Bacillus atrophaeus |
По нуклеотидной последовательности гена 16SpРНК |
Примечание: знаком (*) помечен штамм, на который получены патенты на изобретение; в скобках указаны номера, под которыми штамм депонирован в Национальном биоресурсном центре «Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов» (БРЦ ВКПМ)(Москва).
В качестве тест-культур использованы возбудитель резиновой гнили картофеля Geotrichum candidum, возбудитель ризоктониоза Rhizoctonia solani, возбудитель фузариоза Fusarium equiseti и возбудитель альтернариоза Alternaria sp. G. candidum выделен авторами в ходе анализа первого случая появления резиновой гнили в Красноярском крае и идентифицирован по совокупности культурально-морфологических свойств [4]. R. solani и F. equiseti выделены авторами в соавторстве с С.В. Прудниковой в ходе анализа семенного материала картофеля в учебно-научном комплексе (УНПК) «Борский» ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ, расположенном в Сухобузимском районе Красноярского края, и идентифицированы по совокупности культурально-морфологических признаков и нуклеотидным последовательностям фрагмента гена 28S рРНК [5]. Изолят Alternaria sp. выделен авторами из пораженного альтернариозом картофеля в УНПК «Борский» и идентифицирован по совокупности культурально-морфологических признаков.
Проверку антибиотической активности штаммов-антагонистов в отношении тест-культур проводили методом встречных культур [6] по ширине зоны подавления роста в трехкратной повторности после 10 сут инкубирования при температуре 25 ± 1 °C. В качестве питательной среды использовали среду № 2 ГРМ (Сабуро) производства ФБУН ГНЦ ПМБ, разведенную в 2 раза и дополненную агаром до 20 г/л. Ранее нами было показано, что данная среда хорошо поддерживает рост как бактериальных штаммов-антагонистов р. Bacillus, так и фитопатогенных грибов [7].
Для анализа сходства реакции тест-культур на набор штаммов-антагонистов использовали корреляционный анализ. Для сравнения тест-культур по чувствительности к штаммам-антагонистам использовали двухфакторный дисперсионный анализ, где в качестве факторов выступали штамм антагониста и штамм тест-культуры. В качестве post-hoc тестов использовали рекомендуемые в современной литературе тесты Тьюки (Tukey HSD test) и Шеффе (Scheffe’s S test) [8]. Для анализа группировки штаммов по антагонистической активности в отношении всего набора тест-культур использовали проекцию на Главные компоненты.
Результаты и их обсуждение. В зависимости от штамма-антагониста и тест-культуры средние по повторностям зоны подавления роста фитопатогенных грибов варьировали от 0 до 20 мм (рис. 1, табл. 2).
Между тест-культурами отмечена достаточно высокая корреляция в реакции на набор изучаемых штаммов (табл. 3).
Рис. 1. Пример подавления роста F. equiseti в присутствии штаммов-антагонистов:
1 – контроль без антагонистов; 2 – штамм-антагонист СХ5
Таблица 2
Средние зоны подавления роста у различных штаммов фитопатогенных грибов
в присутствии разных штаммов-антагонистов, мм
|
Штамм бактерий |
Тест-культура |
|||
|
Alternaria sp. |
G. candidum |
R. solani |
F. equiseti |
|
|
RSA1 |
18,3 |
12,3 |
8,0 |
7,0 |
|
RSA8 |
11,7 |
11,0 |
11,0 |
10,0 |
|
RSA16 (1) |
13,3 |
13,3 |
14,3 |
11,0 |
|
RSA16 (2) |
12,0 |
14,0 |
10,3 |
2,7 |
|
CХ5 |
12,0 |
13,0 |
11,3 |
6,3 |
|
СХ6 |
13,3 |
11,7 |
20,3 |
10,3 |
|
Ра1 |
12,3 |
8,0 |
13,0 |
8,3 |
|
Ра2 |
13,3 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
|
Ра3 |
6,3 |
0,0 |
1,0 |
0,0 |
|
АЛ3 |
17,3 |
12,7 |
18,3 |
12,3 |
|
АЛ4 |
14,7 |
13,7 |
15,7 |
15,7 |
|
RSA2 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
|
RSA4 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
|
RSA9 |
14,0 |
9,7 |
8,7 |
9,3 |
|
RSA11 |
8,3 |
13,3 |
9,0 |
8,7 |
|
RSA12 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
|
RSA15 |
14,0 |
11,0 |
8,3 |
2,7 |
|
RSA17 |
16,0 |
15,7 |
13,0 |
9,3 |
|
RSA18 |
10,0 |
4,0 |
13,0 |
12,7 |
|
RSA19 |
11,7 |
13,3 |
15,0 |
9,7 |
|
RSA20(1) |
14,0 |
13,0 |
13,3 |
9,0 |
|
RSA20(2) |
13,0 |
13,0 |
9,7 |
16,3 |
Таблица 3
Коэффициенты корреляции между зонами отсутствия роста у разных тест-культур
под влиянием изучаемых штаммов
|
Тест-культура |
Alternaria sp. |
G. candidum |
R. solani |
F. equiseti |
|
Alternaria sp. |
1,000 |
0,751 |
0,696 |
0,612 |
|
G. candidum |
0,751 |
1,000 |
0,797 |
0,691 |
|
R. solani |
0,696 |
0,797 |
1,000 |
0,810 |
|
F. equiseti |
0,612 |
0,691 |
0,810 |
1,000 |
Примечание: жирным шрифтом выделены коэффициенты корреляции, статистически значимые на уровне p < 0,05.
Тем не менее двухфакторный дисперсионный анализ показал, что антагонистический эффект статистически значимо (p < 0,001) зависит не только от биологических особенностей штамма-антагониста и тест-культуры, но и от взаимодействия «штамм бактерий × тест-культура», отражающего индивидуальную реакцию тест-культур на отдельные штаммы, т. е. различия в спектре антигрибной активности у разных штаммов-антагонистов.
При этом основным источником варьирования размеров зоны подавления являются особенности штамма бактерий (соответствующий показатель силы влияния составляет 59,56 %). Показатель силы влияния фактора «тест-культура» составил 4,78 %, показатель силы влияния взаимодействия «штамм бактерий × тест-культура» составил 15,41 % (табл. 4).
В целом по вариантам штаммов-антагонистов и тест-культур наиболее чувствительными к действию антагонистов оказалась Alternaria sp., наименее чувствительным – F. equiseti (табл. 5, 6).
Таблица 4
Результаты дисперсионного анализа влияния штамма-антагониста
и штамма фитопатогенного гриба на размер зоны подавления роста
|
Источник вариации |
Показатель силы влияния, % |
Статистическая значимость эффекта p |
|
Штамм бактерий |
59,56 |
0,000000 |
|
Тест-культура |
4,78 |
0,000000 |
|
Штамм бактерий × тест-культура |
15,41 |
0,000060 |
|
Случайное варьирование |
20,25 |
– |
Таблица 5
Статистическая значимость различий p между тест-культурами по средней зоне
подавления роста в присутствии штаммов-антагонистов согласно тесту Шеффе
|
Тест-культура |
Средняя зона подавления, мм |
Alternaria sp. |
G. candidum |
R. solani |
|
Alternaria sp. |
11,17 |
– |
0,016 |
0,117 |
|
G. candidum |
9,21 |
0,016 |
– |
0,885 |
|
R. solani |
9,70 |
0,117 |
0,885 |
– |
|
F. equiseti |
7,33 |
0,000 |
0,023 |
0,002 |
Здесь и далее: р-значения даны с округлением до третьего знака.
Таблица 6
Статистическая значимость различий p между тест-культурами по средней зоне
подавления роста в присутствии штаммов-антагонистов согласно тесту Тьюки
|
Тест-культура |
Средняя зона подавления, мм |
Alternaria sp. |
G. candidum |
R. solani |
|
Alternaria sp. |
11,17 |
– |
0,006 |
0,069 |
|
G. candidum |
9,21 |
0,006 |
– |
0,851 |
|
R. solani |
9,70 |
0,069 |
0,851 |
– |
|
F. equiseti |
7,33 |
0,000 |
0,010 |
0,001 |
Отмеченный выше эффект взаимодействия факторов «штамм бактерий × тест-культура» привел к тому, что ранговый анализ не выявил ни одного штамма, который занял бы первое место по антагонистическому действию на все тест-культуры. Так, например, штамм RSA1, занявший лидирующую позицию по антигрибному эффекту в отношении Alternaria sp., занял лишь 14-е место по аналогичному эффекту в отношении F. equiseti. В противоположность этому штамм RSA20 (2) проявил высокую антагонистическую активность в отношении F. Equiseti (1-е место по антигрибному эффекту), относительно слабую активность в отношении Alternaria sp. (11-е место). При этом проекция штаммов по их активности в отношении всего набора тест-культур на первые две главные компоненты не выявила какой-либо выраженной группировки штаммов по спектру антигрибной активности (рис. 2).
Рис. 2. Проекция штаммов-антагонистов по спектру их антигрибной активности на первые две Главные компоненты (в качестве исходных данных использованы данные таблицы 1;
при проведении анализа исключены штаммы RSA2, RSA4 и RSA12, не проявившие
антагонистической активности в отношении ни одной из тест-культур)
Таким образом, при составлении биопрепаратов для защиты картофеля от грибных болезней необходимо использовать не какой-либо один штамм-антагонист, а комплекс штаммов с разным спектром антигрибной активности.
Заключение
- В результате проверки антагонистической активности 22 штаммов сем. Bacillaceae, выделенных из сельскохозяйственных почв Красноярского края, 19 штаммов проявили антагонизм против актуальных для региона возбудителей грибных болезней картофеля Alternaria sp., G. candidum, R. solani и F. equiseti. Из них 1 штамм был активен только против Alternaria sp., 1 – против Alternaria sp. и R. solani, остальные 17 штаммов проявили ту или иную степень антагонистической активности против всех четырех возбудителей.
- Максимальную чувствительность к набору изученных штаммов в среднем проявила Alternaria sp., минимальную – F. equiseti.
Дисперсионный анализ выявил статистически значимый (p < 0,001) эффект взаимодействия факторов «штамм антагониста × таксономическая принадлежность гриба», на долю которого пришлось 15,41 % общего варьирования экспериментальных данных. Это взаимодействие свидетельствует о разном спектре антигрибной активности у изученных штаммов и подчеркивает необходимость использовать в биопрепаратах целый набор штаммов, различающихся по спектру антигрибной активности.
1. Baketov P.V. Snizhenie poter' kartofelya i ovoschej. M.: Rossel'hozizdat, 2001.
2. Microbial interactions within multiple-strain biological control agents impact soil-borne plant disease / B. Niu [et al.] // Frontiers in Mic¬robiology. 2020. T. 11. P. 585404.
3. Microbial Consortia for Plant Protection against Diseases: More than the Sum of Its Parts / T. Maciag [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. 2023. T. 24, № 15. P. 12227.
4. Hizhnyak S.V., Ovsyankina S.V., Churakov A.A. Pervoe soobschenie o vyzyvaemoj Geotrichum candidum rezinovoj gnili kartofelya v Kras¬noyarskom krae // Vestnik KrasGAU. 2023. № 10. S. 106–113.
5. Vydelenie i identifikaciya avtohtonnyh vozbudi-telej boleznej kartofelya, rasprostranennyh v regionah Sibiri / S.V. Prudnikova [i dr.] // Bioteh¬nologiya novyh materialov – okruzhayuschaya sreda – kachestvo zhizni: mat-ly IV Mezhdunar. nauch. konf., Krasnoyarsk, 10–13 oktyabrya 2021 g. Krasnoyarsk: SFU, 2021. S. 174–177.
6. In Vitro Antagonistic Characteristics of Bacilli Isolates against Trichoderma spp. and Three Species of Mushrooms / W.G. Kim [et al.] // Mycobiology. 2008. 36 (4):266-9. DOI:https://doi.org/10.4489/MYCO.2008.36.4.266..
7. Pochvennye mikrobnye soobschestva kak istochnik shtammov dlya biologicheskoj zaschity soi ot fuzarioza v Prienisejskoj Sibiri / S.A. Rodovikov [i dr.] // Vestnik Nizhnevar-tovskogo gosudarstvennogo universiteta. 2020. № 2. S. 4-11. DOI:https://doi.org/10.36906/2311-4444/20-2/01.
8. Comparing multiple comparisons: practical gui-dance for choosing the best multiple comparisons test / S. Midway [et al.] // Bioinformatics and Genomics. 2020. DOI:https://doi.org/10.7717/peerj.10387.
