Россия
Россия
Россия
Цель исследований – оценить эффективность представителей сем. Bacillaceae, выделенных из сельскохозяйственных почв Красноярского края, против возбудителей грибных болезней картофеля. Методом встречных культур изучена антибиотическая активность 21 штамма р. Bacillus, идентифицированных как представители B. altitudinis, B. atrophaeus, B. cereus, B. Mega-terium, B. simplex, B. subtilis и Bacillus sp. и 1 штамма р. Peribacillus (идентифицированного как P. simplex), выделенных авторами из сельскохозяйственных почв Красноярского края, в отношении актуальных для региона возбудителей грибных болезней картофеля Geotrichum candidum (возбудитель резиновой гнили), Rhizoctonia solani (возбудитель ризоктониоза), Fusarium equiseti (возбудитель фузариоза) и Alternaria sp. (возбудитель альтернариоза). Из протестированных штаммов 3 штамма не проявили антагонизма в отношении указанных возбудителей, 1 штамм был активен только против Alternaria sp., 1 – против Alternaria sp. и R. solani, остальные 17 штаммов проявили ту или иную степень антагонистической активности против всех четырех возбудителей. Максимальную чувствительность к набору изученных штаммов проявила Alternaria sp. (средняя по штаммам зона подавления роста 11,17 мм), минимальную – F. equiseti (средняя по штаммам зона подавления роста 7,33 мм). Для G. candidum и R. solani средняя по штаммам зона подавления роста была соответственно 9,21 и 9,70 мм. Несмотря на наличие статистически значимой (p < 0,05) положительной корреляции между возбудителями по чувствительности к штаммам-антагонистам (от r = 0,612 между Alternaria sp. и F. equiseti до r = 0,810 между F. equiseti и R. solani), двухфакторный дисперсионный анализ выявил статистически значимый (p < 0,001) эффект взаимодействия между факторами «штамм антагониста» и «таксономическая принадлежность гриба» с показателем силы влияния 15,41 %. Это свидетельствует о разном спектре антигрибной активности у изученных штаммов и подчеркивает необходимость использовать в биопрепаратах набор штаммов, различающихся по спектру антигрибной активности.
картофель, грибные болезни, Geotrichum candidum, Rhizoctonia solani, Fusa¬rium equiseti, Alternaria sp., штаммы-антагонисты, Bacillus, Peribacillus
Введение. Картофель (Solanum tuberosum) является одной из важнейших продовольственных культур. Как и другие сельскохозяйственные культуры, картофель поражается целым спектром болезней, существенно снижающих урожай как во время вегетации, так и при хранении. Так, в России потери урожая картофеля от болезней составляют от 13 до 30 % [1].
В настоящее время в качестве одного из наиболее перспективных направлений в защите растений от болезней рассматривается биологический метод, основанный на применении микробных штаммов-антагонистов как альтернативы традиционно используемым химическим препаратам [2]. Широкому распространению биологического метода защиты растений в сельском хозяйстве препятствует очень ограниченная номенклатура биопрепаратов, присутствующих на рынке, что в первую очередь обусловлено недостаточным числом эффективных штаммов-антагонистов. В этой связи поиск таких штаммов и их комбинаций рассматривается в качестве исключительно актуальной задачи [3]. При этом предпочтение должно отдаваться штаммам, выделенным из местных микробных сообществ, и, соответственно, адаптированным к местным почвенно-климатическим условиям. Настоящие исследования посвящены поиску автохтонных штаммов-антагонистов для биологической защиты картофеля от грибных болезней в почвенно-климатических условиях Красноярского края.
Цель исследований – оценить эффективность представителей сем. Bacillaceae, выделенных из сельскохозяйственных почв Красноярского края, против возбудителей грибных болезней картофеля.
Задачи: изучить антибиотическую активность штаммов сем. Bacillaceae в отношении возбудителей ризоктониоза, фузариоза, альтернариоза и резиновой гнили картофеля; проверить наличие индивидуальных различий в спектрах антифунгальной активности изучаемых штаммов.
Объекты и методы. Объектами исследования служили 21 штамм р. Bacillus и 1 штамм р. Peribacillus, выделенные авторами из сельскохозяйственных почв Красноярского края и на этапе предварительных исследований проявившие антибиотическую активность в отношении грибов (табл. 1).
Таблица 1
Штаммы-антагонисты, использованные в работе
|
Штамм |
Таксономическая принадлежность |
Метод идентификации |
|
1 |
2 |
3 |
|
RSA 2 |
Bacillus altitudinis |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 4 |
Bacillus megaterium |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 9 |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 11 |
Bacillus subtilis/ Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 12 |
Peribacillus simplex |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 15 |
Bacillus simplex |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 17 |
Bacillus cereus group / Bacillus subtilis |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 19 |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 20 (1) |
Bacillus subtilis |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 20 (2) |
Bacillus subtilis |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
Ра1 |
Bacillus sp. |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
Ра2 |
Bacillus sp. |
Культурально-морфологический |
|
Ра3 |
Bacillus sp. |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
АЛ3 |
Bacillus cereus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
Ал4 |
Bacillus sp. |
Культурально-морфологический |
|
СХ5 |
Bacillus cereus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
СХ6 |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
*RSA 1 (B-13893) |
Bacillus atrophaeus |
По нуклеотидной последовательности гена 16SpРНК |
|
RSA 8 |
Bacillus atrophaeus |
По нуклеотидной последовательности гена 16SpРНК |
Окончание табл. 1
|
1 |
2 |
3 |
|
RSA 16 (1) |
Bacillus atrophaeus |
По нуклеотидной последовательности гена 16SpРНК |
|
RSA 16 (2) |
Bacillus atrophaeus |
MALDI-TOF масс-спектрометрия |
|
RSA 18 |
Bacillus atrophaeus |
По нуклеотидной последовательности гена 16SpРНК |
Примечание: знаком (*) помечен штамм, на который получены патенты на изобретение; в скобках указаны номера, под которыми штамм депонирован в Национальном биоресурсном центре «Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов» (БРЦ ВКПМ)(Москва).
В качестве тест-культур использованы возбудитель резиновой гнили картофеля Geotrichum candidum, возбудитель ризоктониоза Rhizoctonia solani, возбудитель фузариоза Fusarium equiseti и возбудитель альтернариоза Alternaria sp. G. candidum выделен авторами в ходе анализа первого случая появления резиновой гнили в Красноярском крае и идентифицирован по совокупности культурально-морфологических свойств [4]. R. solani и F. equiseti выделены авторами в соавторстве с С.В. Прудниковой в ходе анализа семенного материала картофеля в учебно-научном комплексе (УНПК) «Борский» ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ, расположенном в Сухобузимском районе Красноярского края, и идентифицированы по совокупности культурально-морфологических признаков и нуклеотидным последовательностям фрагмента гена 28S рРНК [5]. Изолят Alternaria sp. выделен авторами из пораженного альтернариозом картофеля в УНПК «Борский» и идентифицирован по совокупности культурально-морфологических признаков.
Проверку антибиотической активности штаммов-антагонистов в отношении тест-культур проводили методом встречных культур [6] по ширине зоны подавления роста в трехкратной повторности после 10 сут инкубирования при температуре 25 ± 1 °C. В качестве питательной среды использовали среду № 2 ГРМ (Сабуро) производства ФБУН ГНЦ ПМБ, разведенную в 2 раза и дополненную агаром до 20 г/л. Ранее нами было показано, что данная среда хорошо поддерживает рост как бактериальных штаммов-антагонистов р. Bacillus, так и фитопатогенных грибов [7].
Для анализа сходства реакции тест-культур на набор штаммов-антагонистов использовали корреляционный анализ. Для сравнения тест-культур по чувствительности к штаммам-антагонистам использовали двухфакторный дисперсионный анализ, где в качестве факторов выступали штамм антагониста и штамм тест-культуры. В качестве post-hoc тестов использовали рекомендуемые в современной литературе тесты Тьюки (Tukey HSD test) и Шеффе (Scheffe’s S test) [8]. Для анализа группировки штаммов по антагонистической активности в отношении всего набора тест-культур использовали проекцию на Главные компоненты.
Результаты и их обсуждение. В зависимости от штамма-антагониста и тест-культуры средние по повторностям зоны подавления роста фитопатогенных грибов варьировали от 0 до 20 мм (рис. 1, табл. 2).
Между тест-культурами отмечена достаточно высокая корреляция в реакции на набор изучаемых штаммов (табл. 3).
Рис. 1. Пример подавления роста F. equiseti в присутствии штаммов-антагонистов:
1 – контроль без антагонистов; 2 – штамм-антагонист СХ5
Таблица 2
Средние зоны подавления роста у различных штаммов фитопатогенных грибов
в присутствии разных штаммов-антагонистов, мм
|
Штамм бактерий |
Тест-культура |
|||
|
Alternaria sp. |
G. candidum |
R. solani |
F. equiseti |
|
|
RSA1 |
18,3 |
12,3 |
8,0 |
7,0 |
|
RSA8 |
11,7 |
11,0 |
11,0 |
10,0 |
|
RSA16 (1) |
13,3 |
13,3 |
14,3 |
11,0 |
|
RSA16 (2) |
12,0 |
14,0 |
10,3 |
2,7 |
|
CХ5 |
12,0 |
13,0 |
11,3 |
6,3 |
|
СХ6 |
13,3 |
11,7 |
20,3 |
10,3 |
|
Ра1 |
12,3 |
8,0 |
13,0 |
8,3 |
|
Ра2 |
13,3 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
|
Ра3 |
6,3 |
0,0 |
1,0 |
0,0 |
|
АЛ3 |
17,3 |
12,7 |
18,3 |
12,3 |
|
АЛ4 |
14,7 |
13,7 |
15,7 |
15,7 |
|
RSA2 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
|
RSA4 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
|
RSA9 |
14,0 |
9,7 |
8,7 |
9,3 |
|
RSA11 |
8,3 |
13,3 |
9,0 |
8,7 |
|
RSA12 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
0,0 |
|
RSA15 |
14,0 |
11,0 |
8,3 |
2,7 |
|
RSA17 |
16,0 |
15,7 |
13,0 |
9,3 |
|
RSA18 |
10,0 |
4,0 |
13,0 |
12,7 |
|
RSA19 |
11,7 |
13,3 |
15,0 |
9,7 |
|
RSA20(1) |
14,0 |
13,0 |
13,3 |
9,0 |
|
RSA20(2) |
13,0 |
13,0 |
9,7 |
16,3 |
Таблица 3
Коэффициенты корреляции между зонами отсутствия роста у разных тест-культур
под влиянием изучаемых штаммов
|
Тест-культура |
Alternaria sp. |
G. candidum |
R. solani |
F. equiseti |
|
Alternaria sp. |
1,000 |
0,751 |
0,696 |
0,612 |
|
G. candidum |
0,751 |
1,000 |
0,797 |
0,691 |
|
R. solani |
0,696 |
0,797 |
1,000 |
0,810 |
|
F. equiseti |
0,612 |
0,691 |
0,810 |
1,000 |
Примечание: жирным шрифтом выделены коэффициенты корреляции, статистически значимые на уровне p < 0,05.
Тем не менее двухфакторный дисперсионный анализ показал, что антагонистический эффект статистически значимо (p < 0,001) зависит не только от биологических особенностей штамма-антагониста и тест-культуры, но и от взаимодействия «штамм бактерий × тест-культура», отражающего индивидуальную реакцию тест-культур на отдельные штаммы, т. е. различия в спектре антигрибной активности у разных штаммов-антагонистов.
При этом основным источником варьирования размеров зоны подавления являются особенности штамма бактерий (соответствующий показатель силы влияния составляет 59,56 %). Показатель силы влияния фактора «тест-культура» составил 4,78 %, показатель силы влияния взаимодействия «штамм бактерий × тест-культура» составил 15,41 % (табл. 4).
В целом по вариантам штаммов-антагонистов и тест-культур наиболее чувствительными к действию антагонистов оказалась Alternaria sp., наименее чувствительным – F. equiseti (табл. 5, 6).
Таблица 4
Результаты дисперсионного анализа влияния штамма-антагониста
и штамма фитопатогенного гриба на размер зоны подавления роста
|
Источник вариации |
Показатель силы влияния, % |
Статистическая значимость эффекта p |
|
Штамм бактерий |
59,56 |
0,000000 |
|
Тест-культура |
4,78 |
0,000000 |
|
Штамм бактерий × тест-культура |
15,41 |
0,000060 |
|
Случайное варьирование |
20,25 |
– |
Таблица 5
Статистическая значимость различий p между тест-культурами по средней зоне
подавления роста в присутствии штаммов-антагонистов согласно тесту Шеффе
|
Тест-культура |
Средняя зона подавления, мм |
Alternaria sp. |
G. candidum |
R. solani |
|
Alternaria sp. |
11,17 |
– |
0,016 |
0,117 |
|
G. candidum |
9,21 |
0,016 |
– |
0,885 |
|
R. solani |
9,70 |
0,117 |
0,885 |
– |
|
F. equiseti |
7,33 |
0,000 |
0,023 |
0,002 |
Здесь и далее: р-значения даны с округлением до третьего знака.
Таблица 6
Статистическая значимость различий p между тест-культурами по средней зоне
подавления роста в присутствии штаммов-антагонистов согласно тесту Тьюки
|
Тест-культура |
Средняя зона подавления, мм |
Alternaria sp. |
G. candidum |
R. solani |
|
Alternaria sp. |
11,17 |
– |
0,006 |
0,069 |
|
G. candidum |
9,21 |
0,006 |
– |
0,851 |
|
R. solani |
9,70 |
0,069 |
0,851 |
– |
|
F. equiseti |
7,33 |
0,000 |
0,010 |
0,001 |
Отмеченный выше эффект взаимодействия факторов «штамм бактерий × тест-культура» привел к тому, что ранговый анализ не выявил ни одного штамма, который занял бы первое место по антагонистическому действию на все тест-культуры. Так, например, штамм RSA1, занявший лидирующую позицию по антигрибному эффекту в отношении Alternaria sp., занял лишь 14-е место по аналогичному эффекту в отношении F. equiseti. В противоположность этому штамм RSA20 (2) проявил высокую антагонистическую активность в отношении F. Equiseti (1-е место по антигрибному эффекту), относительно слабую активность в отношении Alternaria sp. (11-е место). При этом проекция штаммов по их активности в отношении всего набора тест-культур на первые две главные компоненты не выявила какой-либо выраженной группировки штаммов по спектру антигрибной активности (рис. 2).
Рис. 2. Проекция штаммов-антагонистов по спектру их антигрибной активности на первые две Главные компоненты (в качестве исходных данных использованы данные таблицы 1;
при проведении анализа исключены штаммы RSA2, RSA4 и RSA12, не проявившие
антагонистической активности в отношении ни одной из тест-культур)
Таким образом, при составлении биопрепаратов для защиты картофеля от грибных болезней необходимо использовать не какой-либо один штамм-антагонист, а комплекс штаммов с разным спектром антигрибной активности.
Заключение
- В результате проверки антагонистической активности 22 штаммов сем. Bacillaceae, выделенных из сельскохозяйственных почв Красноярского края, 19 штаммов проявили антагонизм против актуальных для региона возбудителей грибных болезней картофеля Alternaria sp., G. candidum, R. solani и F. equiseti. Из них 1 штамм был активен только против Alternaria sp., 1 – против Alternaria sp. и R. solani, остальные 17 штаммов проявили ту или иную степень антагонистической активности против всех четырех возбудителей.
- Максимальную чувствительность к набору изученных штаммов в среднем проявила Alternaria sp., минимальную – F. equiseti.
Дисперсионный анализ выявил статистически значимый (p < 0,001) эффект взаимодействия факторов «штамм антагониста × таксономическая принадлежность гриба», на долю которого пришлось 15,41 % общего варьирования экспериментальных данных. Это взаимодействие свидетельствует о разном спектре антигрибной активности у изученных штаммов и подчеркивает необходимость использовать в биопрепаратах целый набор штаммов, различающихся по спектру антигрибной активности.
1. Бакетов П.В. Снижение потерь картофеля и овощей. М.: Россельхозиздат, 2001.
2. Microbial interactions within multiple-strain biological control agents impact soil-borne plant disease / B. Niu [et al.] // Frontiers in Mic¬robiology. 2020. Т. 11. P. 585404.
3. Microbial Consortia for Plant Protection against Diseases: More than the Sum of Its Parts / T. Maciag [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. 2023. Т. 24, № 15. P. 12227.
4. Хижняк С.В., Овсянкина С.В., Чураков А.А. Первое сообщение о вызываемой Geotri-chum candidum резиновой гнили картофеля в Красноярском крае // Вестник КрасГАУ. 2023. № 10. С. 106–113.
5. Выделение и идентификация автохтонных возбудителей болезней картофеля, распространенных в регионах Сибири / С.В. Пруд¬никова [и др.] // Биотехнология новых материалов – окружающая среда – качество жизни: мат-лы IV Междунар. науч. конф., Красноярск, 10–13 октября 2021 г. Крас¬ноярск: СФУ, 2021. С. 174–177.
6. In Vitro Antagonistic Characteristics of Bacilli Isolates against Trichoderma spp. and Three Species of Mushrooms / W.G. Kim [et al.] // Mycobiology. 2008. 36 (4):266-9. DOI:https://doi.org/10.4489/MYCO.2008.36.4.266..
7. Почвенные микробные сообщества как источник штаммов для биологической защиты сои от фузариоза в Приенисейской Сибири / С.А. Родовиков [и др.] // Вестник Нижневартовского государственного университета. 2020. № 2. С. 4–11. DOI:https://doi.org/10.36906/2311-4444/20-2/01.
8. Comparing multiple comparisons: practical gui-dance for choosing the best multiple comparisons test / S. Midway [et al.] // Bioinformatics and Genomics. 2020. DOI:https://doi.org/10.7717/peerj.10387.
