Russian Federation
UDK 615.9 Токсикология. Учение о ядовитых веществах. Отравления
Mycotoxins are dangerous metabolites of fungi that are found in feed and food products. Combinations of several Fusarium mycotoxins, including T-2 toxin and zearalenone, are often found in contaminated cereal crops. The liver plays a crucial role in detoxification processes and is one of the main targets of mycotoxins. The purpose of research is to study the effect of T-2 toxin and zearalenone on the production of pro-inflammatory cytokines interleukin-6 (IL-6) and interleukin-8 (IL-8) in primary cultures of chicken liver cells. The production of pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 was studied using ELISA kits produced by Vector. It was found that the concentration of the pro-inflammatory cytokine IL-6 was increased as a result of exposure to T-2 mycotoxin at both 100.0 nmol/dm3 and 1000.0 nmol/dm3 in hepatocyte culture, after 12 hours of incubation as a result of rapid toxic shock, but not at a toxin concentration of 10.0 nmol/dm3. When exposed to T-2 toxin for 24 hours, an adaptive response occurred and no significant differences were found. Significant differences in the concentration of IL-8 were found after 24 hours of incubation, compared to the control. When similar concentrations of zearalenone were added, no significant changes in the concentrations of the cytokines IL-6 and IL-8 were observed, except in the case of the maximum concentration of the toxin. When toxins were introduced together, the dynamics of IL-6 content was similar to that of T-2 toxin, but no potentiating effect was recorded. The content of IL-8 changed more than with the addition of monomycotoxin.
T-2 toxin, zearalenone, primary liver cell culture, proinflammatory cytokines, IL-6, IL-8
Введение. Микотоксины представляют собой опасные метаболиты грибов, которые содержатся в кормах и пищевых продуктах [1, 2]. Несколько классов этих соединений могут продуцироваться одним видом грибов. Особенно опасны в этом отношении виды из рода Fusarium [3–6]. Они могут производить трихотецены и зеараленон, которые признаны важными загрязнителями пищевых продуктов и кормов. Эти классы вызывают широкий спектр токсикологических эффектов, главным образом из-за разнообразия их химической структуры [7, 8].
В зараженных зерновых культурах часто обнаруживаются комбинации нескольких микотоксинов Fusarium [9, 10], представляющих угрозу для здоровья человека и животных [11]. Растет обеспокоенность по поводу опасности воздействия смесей этих микотоксинов в пищевых продуктах из-за их естественного совместного присутствия [12, 13].
Токсин Т-2 – один из самых сильнодействующих трихотеценов. Трихотецены включают группу близкородственных соединений, называемых сесквитерпеноидами, имеющими тетрациклический 12,13-эпокситрихотеценовый скелет, и продуцируются видами плесени Fusarium [14–16]. Алиментарное отравление представляет собой наиболее распространенный путь воздействия на животных. С момента их первого открытия существовала обеспокоенность по поводу связи между воздействием трихотецена и здоровьем, основанная на их токсичности для животных, а также на их связи с токсикозами человека и животных. При остром воздействии высоких доз трихотеценов у животных появляются такие признаки, как диарея, рвота, лейкоцитоз и кровотечение [15]. В чрезвычайно высоких дозах трихотецены могут вызвать шокоподобный синдром, который может привести к смерти. Токсин Т-2 считается основным возбудителем фатальной алиментарной токсической алейкии (АТА) у человека, поражает слизистую оболочку и иммунную систему. Подобное же происходит у животных [17–20]. Основными патолого-анатомическими находками являются лейкопения и некротические поражения полости рта, пищевода и желудка [21].
Зеараленон – нестероидный эстрогенный микотоксин, выделенный из нескольких разновидностей грибов Fusarium. Исследования на различных видах животных (например, на грызунах, свиньях и обезьянах) показали, что зеараленон и его метаболиты проявляют эстрогенную и анаболическую активность [22]. Кроме того, токсины Fusarium вызывают перекисное окисление липидов, ингибируют синтез белков и ДНК и вызывают гибель клеток [23].
Куры относительно толерантны к трихотеценам по сравнению с млекопитающими, однако присутствие токсина Т-2 в кормах служит актуальной проблемой в птицеводстве во всем мире [24–26]. Поскольку печень играет решающую роль в процессах детоксикации и является одной из основных мишеней трихотеценов, она особенно подвержена вредному воздействию токсина Т-2 [27, 28].
Цель исследования – изучить влияние Т-2 токсина и зеараленона на продукцию провоспалительных цитокинов интрелейкина-6 (ИЛ-6) и интерлейкина-8 (ИЛ-8).
Объекты и методы. Выделение гепатоцитов проводили, по аналогии с работами [29, 30], из трехнедельных цыплят-бройлеров-самцов КОББ 500, полученных от компании ООО «Челны-Бройлер». После обезглавливания животного в СО2 камере печень промывали и обескровливали. Сначала печень перфузировали 150 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS), содержащего 0,5 ммоль/л этиленгликоля тетрауксусной кислоты (EGTA). После этого печень промывали 150 мл EGTA-HBSS, затем 100 мл MgCl2 и CaCl2 (оба 7 ммоль/л). После иссечения и мягкого встряхивания щипцами печень помещали на 45 мин в ледяной раствор бычьего сывороточного альбумина 25 мг/мл (БСА).
Фракции, обогащенные гепатоцитами, выделяли с помощью многоступенчатого дифференциального центрифугирования. Сначала клеточные суспензии трижды центрифугировали на низкой скорости (100×g) в течение 3 мин в среде Вильямса, с добавлением 0,22 % NaHCO3, 50 мг/мл гентамицина, 2 мм глютамина, 4 мкг/л дексаметазона, 20 МЕ/л инсулина и 5 % фетальной бычьей сыворотки (FBS). После трехкратной ресуспендации была получена очищенная фракция гепатоцитов.
Клеточную суспензию разливали в стеклянные флаконы из химически инертного стекла объемом 2 см3 каждый. Спиртовой раствор Т-2 токсина и зеараленона вносили во флаконы в количестве 0,001 см3. Контролем служили флаконы с клеточной суспензией – вносили этиловый спирт (96 об %) 0,001 см3. Дозы Т-2 токсина и зеараленона составили 0; 10; 100 и 1000 нМ/м3, по аналогии с работами [31]. Токсины были получены по аналогии с работой [25]. В последующем выдерживали флаконы с культурой в инкубаторе при температуре плюс 37 °С. Длительность инкубирования составила 12 ч и 24 ч. Затем клетки с помощью смеси растворов трипсина и версена подвергали диспергированию. Дисперигирующий раствор вносили в объеме 0,2 см3 на флакон и инкубировали в термостате при температуре плюс 37 °С. Период инкубации составил 20 мин. Для остановки действия дисперигирующей смеси вливали 1 см3 питательной среды, содержащей бычью сыворотку крови. Продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 изучали методом ИФА наборами производства «Вектор». Относительные концентрации цитокинов (пг/л) перерассчитывали, учитывая среднее значение монокультур гепатоцитов в отрицательном контроле, равном 1. Для стандартизации значений, полученных с помощью ранее упомянутого метода, определяли общую концентрацию белка клеточных лизатов.
Обработку результатов производили методом вариационной статистики (критерий достоверности Стьюдента). Разница между сравниваемыми значениями воспринималась достоверной при Р ≤ 0,05.
Результаты и их обсуждение. Результаты исследования содержания ИЛ-6 и ИЛ-8 в клеточной суспензии при внесении Т-2 токсина представлены в таблице 1.
Таблица 1
Содержание ИЛ-6 и ИЛ-8 в клеточной суспензии при внесении Т-2 токсина (M±m, n = 10)
|
Вносимое вещество |
Концентрация, нМ/дм3 |
ИЛ-6 |
ИЛ-8 |
||
|
Длительность инкубации, ч |
|||||
|
12 |
24 |
12 |
24 |
||
|
Контроль |
0 |
1,0±0,03 |
1,0±0,03 |
1,0±0,02 |
1,0±0,03 |
|
Т-2 токсин |
10 |
1,08±0,03 |
1,35±0,05* |
0,84±0,03 |
1,22±0,04 |
|
Т-2 токсин |
100 |
1,48±0,05* |
1,42±0,05* |
0,92±0,03 |
1,35±0,04* |
|
Т-2 токсин |
1000 |
1,64±0,05* |
1,27±0,05* |
0,83±0,03 |
1,48±0,05* |
Здесь и далее: * Р ≤ 0,05.
Как следует из данных, представленных в таблице 1, концентрация ИЛ-6 отличалась в клеточной суспензии при внесении в культуру 100,0 и 1000,0 нмоль/дм3 Т-2 токсина после 12 ч инкубации: так, она достоверно увеличивалась относительно контрольных данных на 48 и 64 % соответственно. При этом внесение Т-2 токсина в концентрации 10,0 нмоль/дм3 не приводило к статистически значимому изменению концентрации ИЛ-6. Увеличение времени инкубации до 24 ч приводило к тому, что в культурах, куда вносили самую низкую дозу токсина, происходило усиление продукции ИЛ-6 до 35 % сверх контроля, однако при двух других концентрациях наблюдалась тенденция к уменьшению содержания провоспалительного цитокина от величин, накопленных при 12 ч инкубации.
Концентрация ИЛ-8 отличалась в клеточной суспензии при внесении в культуру Т-2 токсина после 12 ч инкубации: так, она уменьшалась относительно контрольных данных от 17 до 8 % соответственно. Увеличение времени инкубации до 24 ч приводило к тому, что в культурах происходила активация синтеза ИЛ-8 до 48 % выше контроля.
Результаты исследования содержания ИЛ-6 и ИЛ-8 в клеточной суспензии при внесении зеараленона представлены в таблице 2.
Таблица 2
Содержание ИЛ-6 и ИЛ-8 в клеточной суспензии при внесении зеараленона (M±m, n = 10)
|
Вносимое вещество |
Концентрация, нМ/дм3 |
ИЛ-6 |
ИЛ-8 |
||
|
Длительность инкубации, ч |
|||||
|
12 |
24 |
12 |
24 |
||
|
Контроль |
0 |
1,0±0,03 |
1,0±0,03 |
1,0±0,03 |
1,0±0,03 |
|
Зеараленон |
10 |
1,05±0,03 |
1,09±0,04 |
0,92±0,03 |
1,02±0,04 |
|
Зеараленон |
100 |
1,07±0,03 |
1,16±0,05 |
0,97±0,03 |
1,05±0,04 |
|
Зеараленон |
1000 |
1,24±0,04* |
1,07±0,04 |
0,88±0,03 |
1,24±0,05* |
Как следует из данных, представленных в таблице 2, концентрация ИЛ-6 незначительно отличалась в клеточной суспензии относительно контроля при внесении в культуру 10,0 и 100,0 нмоль/дм3 зеараленона после 12 ч инкубации и она увеличивалась от 5 до 7 %, что находится в пределах статистической погрешности. Достоверно увеличивалась концентрация ИЛ-6, относительно контрольных данных, на 24 % при внесении зеараленона в концентрации 1000,0 нмоль/дм3, что все равно меньше, чем при внесении Т-2 токсина. Увеличение времени инкубации до 24 ч приводило к тому, что в культурах, куда вносили самую низкую дозу токсина, происходило незначительное усиление продукции ИЛ-6 – от 9 до 16 % сверх контроля, однако изменения носили статистически недостоверный характер. При максимальной концентрации токсина наблюдалась тенденция к уменьшению содержания провоспалительного цитокина от величин, накопленных при 12 ч инкубации.
Концентрация ИЛ-8 статистически не отличалась в клеточной суспензии при внесении в культуру зеараленона после 12 ч инкубации относительно контроля. Увеличение времени инкубации до 24 ч приводило к тому, что в культурах происходила активация синтеза ИЛ-8 при максимальном внесении токсина до 24 % выше контроля.
Результаты исследования содержания ИЛ-6 и ИЛ-8 в клеточной суспензии при комбинированном внесении Т-2 токсина и зеараленона представлены в таблице 3.
Таблица 3
Содержание ИЛ-6 и ИЛ-8 в клеточной суспензии при комбинированном
внесении Т-2 токсина и зеараленона (M±m, n = 10)
|
Вносимое вещество |
Концентрация, нМ/дм3 |
ИЛ-6 |
ИЛ-8 |
||
|
Длительность инкубации, ч |
|||||
|
12 |
24 |
12 |
24 |
||
|
Контроль |
0 |
1,0±0,03 |
1,0±0,03 |
1,0±0,02 |
1,0±0,03 |
|
Т-2 токсин + зеараленон |
10 |
1,09±0,03 |
1,30±0,05* |
0,89±0,03 |
1,28±0,04 |
|
Т-2 токсин + зеараленон |
100 |
1,43±0,05* |
1,35±0,05* |
0,96±0,03 |
1,45±0,04* |
|
Т-2 токсин + зеараленон |
1000 |
1,69±0,05* |
1,29±0,05* |
0,85±0,03 |
1,62±0,05* |
Как следует из данных, представленных в таблице 3, динамика концентрации ИЛ-6 имела те же тенденции, что и у Т-2 токсина, внесение зеараленона не изменяло профиль динамики содержания. В клеточной суспензии при внесении в культуру 100,0 и 1000,0 нмоль/дм3 Т-2 токсина после 12 ч инкубации достоверно увеличивалась относительно контрольных данных на 43 и 69 % соответственно. При этом внесение обоих микотоксинов в концентрации 10,0 нмоль/дм3 не приводило к статистически значимому изменению концентрации ИЛ-6. Увеличение времени инкубации до 24 ч приводило к тому, что в культурах, куда вносили самую низкую дозу токсинов, происходило усиление продукции ИЛ-6 до 30 % сверх контроля, однако при двух других концентрациях наблюдалась тенденция к уменьшению содержания провоспалительного цитокина от величин, накопленных при 12 ч инкубации.
Динамика концентрации ИЛ-8 имела те же тенденции, что и у Т-2 токсина, внесение зеараленона не изменяло профиль динамики содержания. После 12 ч инкубации она уменьшалась относительно контрольных данных от 15 до 4 %. Увеличение времени инкубации до 24 ч привело к тому, что внесение двух токсинов увеличивало содержание ИЛ-8 по сравнению с моновнесением – в культурах происходила активация синтеза ИЛ-8 до 62 % выше контроля.
Заключение. Таким образом, концентрация провоспалительного цитокина ИЛ-6 была повышена в результате воздействия Т-2 микотоксином как 100,0 нмоль/дм3, так и 1000,0 нмоль/дм3 в культуре гепатоцитов, после 12 ч инкубации в результате быстрой токсинной атаки, но не при концентрации токсина 10,0 нмоль/дм3. Однако в модели клеточной культуры, при воздействии
Т-2 токсином в течение 24 ч, что соответствует более длительному воздействию токсина, сопровождающемуся адаптационным ответом, достоверных различий обнаружено не было. В концентрации ИЛ-8 достоверные различия были обнаружены после 24 ч инкубации по сравнению с контролем. При внесении аналогичных концентраций зеараленона значительных изменений в концентрации цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 не наблюдалось, за исключением случая с максимальной концентрацией токсина. При совместном внесении токсинов динамика содержания ИЛ-6 была сходна с таковой у Т-2 токсина, но потенцирующего эффекта не регистрировали, а содержание ИЛ-8 изменялось сильнее, чем при внесении монотоксина.
1. Diverse mycotoxin threats to safe food and feed cereals / R.L. Latham [et al.] // Essays in Biochemistry. 2023. № 67(5). P. 797–809. DOI:https://doi.org/10.1042/EBC20220221.
2. Fiziologicheskie osnovy diagnostiki i profilaktiki mikotoksikozov v pticevodstve / V.G. Vertipra¬hov [i dr.]. Sergiev Posad: Vseros. nauch.-issled. i tehnolog. in-t pticevodstva RAN, 2023. 181 s.
3. Effect of abiotic stressors on T-2-producing environmental isolates of Fusarium sporotri-chioides / G.M. Yumangulova [et al.] // Journal of Pharmacy Research. 2017. Vol. 11. № 10. P. 1226–1229.
4. Porazhennost' kormov gribami roda fuzarium / O.K. Ermolaeva [i dr.] // Uchenye zapiski Kazanskoj gosudarstvennoj akademii veteri-narnoj mediciny im. N.`E. Baumana. 2019. T. 239, № 3. S. 121–124.
5. Semenova S.A., Magdeeva `E.A., Galiullin A.K. Izuchenie antagonizma mikroskopicheskih gri¬bov k patogennym mikrobam // Uspehi medi¬cinskoj mikologii. 2014. T. 12. S. 339–341.
6. Poisk antagonistov v otnoshenii sanitarno-pokazatel'nyh mikrobov pochvy / S.A. Semeno¬va [i dr.] // Vestnik Marijskogo gosudarstven¬nogo universiteta. Ser. «Sel'skohozyajstvennye nauki. `Ekonomicheskie nauki». 2022. T. 8, № 1 (29). S. 63–71.
7. Semenov `E.I. Sochetannoe vozdejstvie T-2 toksina, dezoksinivalenola i zearalenona // Uspehi medicinskoj mikologii. 2015. T. 14. S. 302–306.
8. Kombinirovannoe vozdejstvie mikotoksinov na fiziologicheskie pokazateli krys / L.R. Valiullin [i dr.] // Uchenye zapiski Kazanskoj gosudarst-vennoj akademii veterinarnoj mediciny im. N.`E. Baumana. 2015. T. 221, № 1. S. 45–48.
9. Mikologicheskaya ocenka kormov v Respub-like Tatarstan / R.M. Potehina [i dr.] // Veteri-narnyj vrach. 2019. № 1. S. 19–23.
10. Ocenka toksichnosti kormov po regionam Rossijskoj Federacii / S.A. Semenova [i dr.] // Uchenye zapiski Kazanskoj gosudarstvennoj akademii veterinarnoj mediciny im. N.`E. Bau-mana. 2015. T. 224, № 4. S. 196–199.
11. Sluchai massovogo otravleniya zhivotnyh, ptic i ryb v nekotoryh regionah Rossijskoj Federacii i stran SNG / `E.I. Semenov [i dr.] // Veterinariya. 2021. № 8. S. 39–44.
12. Kombinirovannye porazheniya zhivotnyh i razrabotka sredstv profilaktiki i lecheniya / K.H. Papunidi [i dr.]. Kazan': FCTRB-VNIVI, 2019. 248 s.
13. Semenov `E.I. Farmako-toksikologicheskie aspekty primeneniya `enterosorbentov pri sochetannyh mikotoksikozah: dis. … d-ra veterinar. nauk. Kazan', 2019. 342 s.
14. Analitika dannyh rasprostraneniya T-2 toksina v Respublike Tatarstan / I.N. Shtyrov [i dr.] // Mezhdunarodnyj vestnik veterinarii. 2021. № 1. S. 167–172.
15. Samsonov A.I., Dervyanov V.N. Profilaktika T-2 toksikoza norok // Veterinarnyj vrach. 2007. № 2. S. 17–18.
16. Obosnovanie vvedeniya v racion zhivotnyh kombinacii sorbentov neorganicheskoj i orga-nicheskoj prirody pri T-2 toksikoze / N.N. Mishina [i dr.] // Veterinarnyj vrach. 2019. № 2. S. 30–37.
17. Valiev A.R., Semenov `E.I., Ahmetov F.G. Immunosupressiya v patogeneze T-2 mikotok-sikoza i ee farmakokorrekciya // Veterinarnyj vrach. 2011. № 2. S. 4–6.
18. Screening drugs-potential immunomodulators for T-2 mycotoxicosis / E.I. Semenov [et al.] // Bali Medical Journal. 2017. № 6 (2). P. 110–114. DOI:https://doi.org/10.15562/bmj.v6i2.516.
19. Chastota razvitiya yazvennyh processov v slizistoj obolochke zheludka svinej, obuslov-lennyh vozdejstviem mikotoksinov i kolonizaciej bakteriyami roda Helicobac¬ter / F.M. Nurgaliev [i dr.] // Veterinarnyj vrach. 2020. № 2. S. 31–38.
20. `Eksperimental'nyj sochetannyj mikotoksikoz svinej na fone infekcionnoj nagruzki / `E.I. Se-menov [i dr.] // Sel'skohozyajstvennaya biolo-giya. 2022. T. 57, № 2. S. 371–383.
21. Mishina N.N. Profilakticheskaya `effektivnost' lignin- i polisaharidsoderzhaschih `enterosor-bentov pri sochetannom T-2 i aflatoksikoze: dis. … kand. biol. nauk. Kazan', 2008. 162 s.
22. Izuchenie biohimicheskih pokazatelej kletok pri vozdejstvii zearalenona i T-2 toksina / N.R. Kasanova [i dr.] // Vestnik biotehnologii i fiziko-himicheskoj biologii im. Yu.A. Ovchin-nikova. 2022. T. 18, № 1. S. 28–32.
23. Vliyanie aflatoksina V1 na nakoplenie malono-vogo dial'degida v pervichnyh kul'turah kletok pecheni / A.I. Samsonov [i dr.] // Sovremennye problemy `eksperimental'noj i klinicheskoj toksikologii, farmakologii i `ekologii: sb. tez. dokl. Mezhdunar. nauch.-prakt. konf. Kazan', 2021. S. 191–195.
24. A case of laying hens mycosis caused by Fusarium Proliferatum / R.M. Potekhina [et al.] // Veterinary Medicine International. 2023. Vol. 2023. DOI:https://doi.org/10.1155/2023/5281260.
25. Effect of bee brood and zeolite on broiler chickens exposed by mycotoxin T-2 / E.I. Semenov [et al.] // Natural Volatiles and Essential Oils. 2021. Vol. 8. № 4. S. 3520–3531.
26. `Effektivnost' adsorbentov pri sochetannom mikotoksikoze cyplyat-brojlerov / S.A. Tanase-va [i dr.] // Mezhdunarodnyj vestnik veterinarii. 2020. № 4. S. 50–56.
27. Perfilova K.V., Mishina N.N., Semenov `E.I. Obosnovanie komponentnogo sostava komp-leksnogo sredstva «Ceapitoks» v otnoshenii T-2 toksina v opytah in vitro // Uchenye zapiski Kazanskoj gosudarstvennoj akademii veteri¬narnoj mediciny im. N.`E. Baumana. 2021. T. 247, № 3. S. 208–212.
28. `Eksperimental'noe obosnovanie ispol'zova-niya polikomponentnogo sorbenta dlya detok-sikacii pecheni ot mikotoksinov / N.N. Mishina [i dr.] // Vestnik Omskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2023. № 1 (49). S. 114–121.
29. Toxicity and oxidative stress induced by T-2 toxin and HT-2 toxin in broilers and broiler hepatocytes / L. Yang [et al.] // Food Chem. Toxicol. 2016. P. 128–137. DOI: 10.1016/ j.fct.2015.12.003.
30. Vliyanie T-2 toksina i zearalenona na soder-zhanie belkov teplovogo shoka v pervichnyh kul'turah kletok pecheni / A.I. Samsonov [i dr.] // Veterinarnyj vrach. 2023. № 3. S. 22–29
31. Cellular effects of T-2 toxin on primary hepatic cell culture models of chickens / M. Mackei [et al.] // Toxins. 2020. Vol. 12 (1) P. 46. DOI:https://doi.org/10.3390/toxins12010046.
