Russian Federation
M.V. Lomonosov Northern (Arctic) Federal University
Moscow, Russian Federation
Karavaevo, Kostroma, Russian Federation
Vologda, Vologda, Russian Federation
Russian Federation
The aim of research is to study the effect of the composition of the culture medium and the concentration of 2-isopentyl adenine on the in vitro shoot formation of cloudberry forms collected in the northern regions of the European part of Russia and Siberia. The objects of the study are cloudberry plants of the Leningradskaya and Kondinskaya forms, collected in natural places of the Vyborg District of the Leningrad Region and the Kondinsky District of the Khanty-Mansiysk Autonomous Okrug – Yugra. The studies were carried out in 2022–2024 using generally accepted methods of microclonal propagation of plants. The number, average length and total length of microshoots per one regenerated plant were recorded. The experiment was repeated 3 times, with 10 plants each. The maximum values of the number of microshoots of cloudberry (on average 3.3–3.7 pcs.), their average length (1.6–1.8 cm) and total length (5.5–7.0 cm) were noted when growing regenerated plants in vitro on the MC culture medium. On the MS ½ culture medium, the number, average length, and total length of cloudberry microshoots in vitro were, on average, 1.4, 1.2–1.6, and 2.1–2.3 times smaller, respectively, than on the MS medium; on the MS ¼ medium, they were 2.8, 1.6–2.6, and 4.6–6.4 times smaller. An increase in the concentration of cytokinin 2-iP from 0.5 to 1.0 mg/l in the culture medium contributed to an increase in the number of cloudberry microshoots (on average, 1.3 times) in vitro culture and a decrease in their average length (2–3.2 times) and total length (2.8–3.1 times).
cloudberry, Rubus chamaemorus, clonal micropropagation, in vitro, organogenesis, culture medium, growth regulators
Введение. На севере России и в странах Северной Европы (особенно в Норвегии и Финляндии) морошка приземистая (Rubus chamaemorus L.) является востребованным на рынке ягодным видом, обладающим высокой пищевой ценностью, и используется в пищевой промышленности и домашней кулинарии. Вкусовые свойства морошки позволяют употреблять их не только в свежем виде, но также и в виде варенья, повидла, джемов, компотов, соков, добавок для кондитерских и хлебобулочных изделий [1, 2]. В зрелых плодах морошки содержатся сахара, белки, клетчатка, органические кислоты (лимонная, яблочная), витамины A, В, С, РР, минеральные вещества (калий, кобальт, железо фосфор и др.), Кроме того, в плодах морошки много пектинов, дубильных веществ, каротиноидов, флавоноидов, эллагитаннинов. При этом экстракты плодов морошки имеют высокую антиоксидантную и биологическую активность,
проявляют разностороннее фармакологическое (в т. ч. антимикробное, диетическое и противораковое) действие [3–9].
В условиях необходимости импортозамещения на сегодняшний день интенсификация отрасли отечественного ягодоводства требует широкого использования высокотехнологичных приемов. Известно, что основные сорта ягодных культур возникли в результате сложных скрещиваний и характеризуются высоким уровнем гетерозиготности, в связи с чем их размножение традиционным семенным способом не позволяет растениям сохранить весь набор хозяйственно значимых признаков исходной формы [10, 11]. Для большинства ягодных растений эту проблему можно решить с помощью применения технологий клонального микроразмножения растений.
Разработка и совершенствование методов in vitro для микроразмножения морошки приземистой может найти применение не только в сельскохозяйственном производстве, но и в вопросах сохранения и искусственного поддержания численнности популяций данного вида во многих странах мира. Существующие в настоящее время технологии размножения морошки in vitro [12–16] требуют их всесторонней доработки для целей полного обеспечения необходимого объема посадочного материала этой ценной культуры, в т. ч. с учетом генетических особенностей форм, полученных из природно-климатических условий произрастания северных регионов европейской части России и Сибири.
Цель исследований – изучение влияния состава культуральной среды и концентрации
2-изопентиладенина на побегообразование in vitro форм морошки приземистой, отобранных в северных регионах европейской части России и Сибири.
Объекты и методы. Исследования проводили в 2022–2024 гг. по общепринятым методикам микроклонального размножения растений [17, 18]. В качестве объектов исследования изучали растения форм морошки приземистой, отобранных в местах естественного произрастания – Ленинградская (Выборгский район Ленинградской области) и Кондинская (Кондинский район Ханты-Мансийского АО – Югры). В качестве эксплантов использовали апикальные меристемы растений. Растения выращивали на культуральной среде по прописи Мурасиге-Скуга (МС) [19], в т. ч. в вариантах с разбавлением минеральной основы бидистилированной водой в 2 и 4 раза (уровень кислотности среды pHKCl – 5,3–5,5). Далее культивирование растений-регенерантов проводили в световой комнате при температуре воздуха 23–25 °C, относительной влажности воздуха 75–80 %, 16-часовом фотопериоде. Для регулирования ростовых процессов на этапе «собственно микроразмножение» в культуральную среду добавляли
2-изопентиладенин (2-iP) в концентрациях 0,5 и 1,0 мг/л. Проводили учет числа, средней длины и суммарной длины микропобегов в расчете на одно растение-регенерант. Повторность опыта 3-кратная, по 10 растений в каждой. Для оценки достоверности различий между средними данными вариантов опытов проводили по общепринятым методикам [20], использовали двухфакторный дисперсионный анализ при помощи наименьшей существенной разности для 5 % уровня значимости (НСР05), где факторы: А – состав культуральной среды; Б – концентрация росторегулирующего вещества.
Результаты и их обсуждение. В ходе исследований выявлено, что при культивировании in vitro на этапе «собственно микроразмножение» у растений морошки приземистой наибольшее число микропобегов формировалось на культуральной среде МС: у формы Ленинградская оно составляло в среднем 3,3 шт., у формы Кондинская – 3,7 шт., что значительно больше, чем на средах МС ½ (в 1,4 раза) и МС ¼ (в 2,8 раза) (табл. 1).
Повышение концентрации цитокинина 2-iP от 0,5 до 1,0 мг/л в культуральной среде не оказало влияния на число микропобегов in vitro растений морошки у формы Ленинградская, тогда как у формы Кондинская способствовало незначительному уменьшению их числа в среднем в 1,3 раза.
Наибольшие показатели средней длины микропобегов исследуемых форм морошки в культуре in vitro (в среднем 1,6–1,8 см) наблюдались на культуральной среде МС. В то же время на среде МС ½ значения данного параметра были меньше в 1,2–1,6 раза, на среде МС ¼ – в 1,6–2,6 раза (табл. 2).
Таблица 1
Число микропобегов in vitro морошки приземистой в зависимости
от состава культуральной среды и концентрации 2-iP, шт.
|
Форма |
Концентрация 2-iP, мг/л |
Состав культуральной среды |
Среднее |
||
|
МС |
МС ½ |
МС ¼ |
|||
|
Ленинградская |
0,5 |
3,6 |
2,0 |
1,1 |
2,2 |
|
1,0 |
2,9 |
2,5 |
1,3 |
2,2 |
|
|
Среднее |
3,3 |
2,3 |
1,2 |
– |
|
|
НСР05 : А = 0,80; Б = 0,90; АБ = 0,96 |
|||||
|
Кондинская |
0,5 |
4,1 |
3,0 |
1,5 |
2,9 |
|
1,0 |
3,3 |
2,2 |
1,1 |
2,2 |
|
|
Среднее |
3,7 |
2,6 |
1,3 |
– |
|
|
НСР05 : А = 0,87; Б = 0,91; АБ = 1,13 |
|||||
Таблица 2
Средняя длина микропобегов in vitro морошки приземистой
в зависимости от состава культуральной среды и концентрации 2-iP, см
|
Форма |
Концентрация 2-iP, мг/л |
Состав культуральной среды |
Среднее |
||
|
МС |
МС ½ |
МС ¼ |
|||
|
Ленинградская |
0,5 |
2,3 |
2,0 |
1,5 |
1,9 |
|
1,0 |
0,9 |
0,5 |
0,5 |
0,6 |
|
|
Среднее |
1,6 |
1,3 |
1,0 |
– |
|
|
НСР05 : А = 0,72; Б = 0,91; АБ = 1,19 |
|||||
|
Кондинская |
0,5 |
2,5 |
1,5 |
1,0 |
1,6 |
|
1,0 |
1,1 |
0,7 |
0,5 |
0,8 |
|
|
Среднее |
1,8 |
1,1 |
0,7 |
– |
|
|
НСР05 : А = 0,56; Б = 0,74; АБ = 0,88 |
|||||
Отмечено, что с повышением в составе культуральной среды концентрации 2-iP от 0,5 до 1,0 мг/л средняя длина микропобегов у исследуемых форм морошки в культуре in vitro уменьшалась в 2,0–3,2 раза.
Суммарная длина микропобегов морошки in vitro имела наибольшие значения на культуральной среде МС: у формы Ленинградская она достигала в среднем 5,5 см, у формы Кондинская – 7,0 см, в то время как на среде МС ½ она была меньше в среднем в 2,1–2,3 раза, на среде МС ¼ – в 4,6–6,4 раза (табл. 3).
Таблица 3
Суммарная длина микропобегов in vitro морошки приземистой
в зависимости от состава культуральной среды и концентрации 2-iP, см
|
Форма |
Концентрация 2-iP, мг/л |
Состав культуральной среды |
Среднее |
||
|
МС |
МС ½ |
МС ¼ |
|||
|
Ленинградская |
0,5 |
8,3 |
4,0 |
1,7 |
4,7 |
|
1,0 |
2,6 |
1,3 |
0,7 |
1,5 |
|
|
Среднее |
5,5 |
2,6 |
1,2 |
– |
|
|
НСР05: А = 0,75; Б = 0,84; АБ = 0,97 |
|||||
|
Кондинская |
0,5 |
10,3 |
4,5 |
1,5 |
5,4 |
|
1,0 |
3,7 |
1,5 |
0,6 |
1,9 |
|
|
Среднее |
7,0 |
3,0 |
1,1 |
– |
|
|
НСР05: А = 0,65; Б = 0,80; АБ = 0,94 |
|||||
С увеличением концентрации цитокинина
2-iP от 0,5 до 1,0 мг/л суммарная длина микропобегов in vitro у растений морошки существенно уменьшалась у формы Ленинградская в среднем в 3,1 раза, у формы Кондинская – в 2,8 раза.
Заключение. Таким образом, при микроклональном размножении форм морошки приземистой, отобранных в Ленинградской области и Ханты-Мансийском АО – Югре, при использовании культуральной среды МС число, средняя и суммарная длина микропобегов растений в культуре in vitro были значительно больше, чем на средах МС ½ и МС ¼. При повышении концентрации цитокинина 2-iP от 0,5 до 1,0 мг/л в составе культуральной среды отмечено существенное увеличение числа микропобегов морошки и уменьшение их суммарной и средней длины. Полученные результаты могут быть использованы для разработки технологии ускоренного получения оздоровленного посадочного материала морошки.
1. Kosicyn V.N. Moroshka: biologiya, resursnyj potencial, vvedenie v kul'turu: monografiya. M.: VNIILM, 2001. 140 s.
2. Sharoglazova L.P., Rygalova E.A., Velichko N.A. Obosnovanie srokov hraneniya i tovaroved¬naya ocenka sokosoderzhaschego napitka na osnove yagod roda Rubus // Vestnik KrasGAU. 2020. № 3 (156). S. 129–134. DOI:https://doi.org/10.36718/1819-4036-2020-3-129-134.
3. Berries as Chemopreventive Dietary Consti-tuents – a Mechanistic Approach with the ApcMin/+ Mouse / M. Mutanen [et al.] // Asia Pac J Clin Nutr. 2008. Vol. 17. Suppl. 1. P. 123–125.
4. Alaskan Wild Berry Resources and Human Health under the Cloud of Climate Change / J. Kellogg [et al.]. // J Agric Food Chem. 2010. Vol. 58. № 7. P. 3884-3900. DOI: 10.1021/ jf902693r.
5. Ellagitannin-rich Cloudberry Inhibits Hepatocyte Growth Factor Induced Cell Migration and Phosphatidylinositol 3-kinase/AKT Activation in Colon Carcinoma Cells and Tumors in Min Mice / A.M. Pajari [et al.]. // Oncotarget. 2016. Vol. 7. № 28. P. 43907–43923. DOI:https://doi.org/10.18632/oncotarget.9724.
6. Sanguiin H-6 Fractionated from Cloudberry (Rubus chamaemorus) Seeds Can Prevent the Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus / J.J. Aguilera-Correa [et al.] // Biofilm Development during Wound Infection. Antibio-tics (Basel). 2021. Vol. 10. № 12. Art. 1481. DOI:https://doi.org/10.3390/antibiotics10121481.
7. Strah Ya.L., Ignatovec O.S. Himicheskij sostav i biologicheskaya aktivnost' metabolitov Rubus chamaemorus L. // Izvestiya Nacional'noj aka¬demii nauk Belarusi. Seriya biologicheskih nauk. 2022. T. 67, № 3. S. 321–331.
8. Cloudberry (Rubus chamaemorus L.) Supplementation Attenuates the Development of Metabolic Inflammation in a High-Fat Diet Mouse Model of Obesity / T. Pemmari [et al.] // Nutrients. 2022. Vol. 14. № 18. P. 38–46. DOI:https://doi.org/10.3390/nu14183846.
9. Comprehensive Characterization of Secondary Metabolites in Fruits and Leaves of Cloudberry (Rubus chamaemorus L.) / A.V. Faleva [et al.] // Metabolites. 2023. Vol. 13. № 5. Art. 598. DOI:https://doi.org/10.3390/metabo13050598.
10. Genetic Differentiation of Rubus chamaemo¬rus Populations in the Czech Republic and Norway after the Last Glacial Period / L. Leišová-Svobodová [et al.] // Ecol Evol. 2018. Vol. 8. № 11. P. 5701–5711. DOI:https://doi.org/10.1002/ece3.4101.
11. Phylogeny of the Diploid Species of Rubus (Rosaceae) / X.F. Gao [et al.] // Genes (Basel). 2023. Vol. 14. № 6. Art. 1152. DOI:https://doi.org/10.3390/genes14061152.
12. Thiem B. Micropropagation of Cloudberry (Rubus chamaemorus L.) by Initiation of Axillary Shoots // Acta Soc. Bot. Pol. 2001. Vol. 70. P. 11–16.
13. In Vitro Propagation of Cloudberry (Rubus chamaemorus) / I. Martinussen [et al.] // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2004. Vol. 78. № 1. P. 43–49. DOI:https://doi.org/10.1023/B:TICU.00000 20392.85854.28.
14. Debnath S.C. A Two-step Procedure for In Vitro Multiplication of Cloudberry (Rubus chamaemorus L.) Shoots Using Bioreactor // Plant Cell Tissue and Organ Cult. 2007. Vol. 88. № 2. P. 185–191. DOI: 10.1007/ s11240-006-9188-x.
15. Cloudberry (Rubus chamaemorus) Cell Culture with Bioactive Substances: Establishment and Mass Propagation for Industrial Use / L. Nohynek [et al.] // Engineering in Life Scien-ce. 2014. Vol. 14. Iss. 6. P. 667–675. DOI:https://doi.org/10.1002/elsc.201400069.
16. Zontikov D.N., Zontikova S.A., Malahova K.V. Vliyanie sostava pitatel'nyh sred i regulyatorov rosta pri klonal'nom mikrorazmnozhenii neko-toryh hozyajstvenno cennyh predstavitelej roda Rubus L. // Agrohimiya. 2021. № 6. S. 36–42. DOI:https://doi.org/10.31857/S0002188121060144.
17. Sel'skohozyajstvennaya biotehnologiya i bioin-zheneriya: uchebnik / V.S. Sheveluha [i dr.]. M.: URSS, 2015. 715 s.
18. Biotehnologiya v sadovodstve. Vyraschivanie plodovyh i redkih yagodnyh rastenij v kul'ture in vitro: laboratornyj praktikum: ucheb. posobie / S.S. Makarov [i dr.]. SPb.: Lan', 2023. 128 s.
19. Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures // Phisiol. Plantarum. 1962. Vol. 3. № 15. P. 473–497.
20. Dospehov B.A. Metodika polevogo opyta (s osnovami statisticheskoj obrabotki rezul'ta-tov issledovanij): uchebnik. Izd. 6-e. M.: Al'yans, 2011. 350 s.
