Krasnoobsk, Novosibirsk, Russian Federation
The purpose of research is a metabolomic study of glycoalkaloids by tandem mass spectrometry in eight varieties of colored potatoes. In this work, extracts of colored potatoes, the breeding samples of which were obtained from the Siberian Federal Scientific Center for Agrobiotechnologies of the Russian Academy of Sciences, are studied for the presence of a variety of glycoalkaloids. Eight varieties were used: Tuleevskij, Kuznechanka, Pamyati Antoshkinoj, Tomichka, Gibrid 15/F-2-13, Gibrid 22103-10, Hy-brid 17-5/6-11, Sinilga. Glycoalkaloids are plant metabolites containing an oligosaccharide, a C27 steroid, and a heterocyclic nitrogen component. Initial screening by HPLC-MS showed that among the hundreds of compounds found in tubers, the composition of glycoalkaloids was particularly diverse. Potato glycoal-kaloids can be divided into two main classes: solanidane or spirosolan aglycones. It is believed that sola-nine and chaconine make up more than 90 % of the total glycoalkaloids of domesticated potatoes, with chaconine often more than solanine. Using tandem mass spectrometry (high-performance liquid extraction and BRUKER DALTONIKS ion trap), extracts of these varieties were analyzed for the presence of com-pounds from the glycoalkaloids family. The results of the study showed the presence of 22 glycoalkaloids in the proposed varieties, some of the identified glycoalkaloids have not yet been described in the world scientific literature.
Solanum tuberosum, HPLC-MS/MS, tandem mass spectrometry, potato, glycoalkaloids
Введение. Зародышевая плазма картофеля характеризуется обширным генетическим разнообразием, включающим около 200 диких видов, обитающих в чрезвычайно разнообразных местообитаниях по всей Америке [1]. Однако лишь небольшая часть этого генетического разнообразия была включена в выведение современных сортов картофеля, что привело к очень узкому генетическому коридору. Следовательно, дикие виды представляют собой в значительной степени неиспользованный ресурс, который, вероятно, содержит много новых генов, полезных для улучшения свойств одомашненного картофеля. Относительно мало известно о степени разнообразия метаболитов, присутствующих в зародышевой плазме картофеля. Методы метаболомного исследования дают возможность понять изобилие и разнообразие полифенольного состава и соединений других классов в растениях. Было показано, что методы метаболомного исследования нескольких сортов картофеля с помощью ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС являются эффективным инструментом исследования [2, 3].
Предварительный анализ семи генотипов в исследовании [4] показал, что гликоалкалоиды являются большим источником разнообразия метаболитов. Гликоалкалоиды представляют собой растительные метаболиты, содержащие олигосахарид, стероид С27 и гетероциклический компонент азота. Считается, что соланин и чаконин составляют более 90 % от общего количества гликоалкалоидов одомашненного картофеля, при этом чаконина часто больше, чем соланина.
Пути биосинтеза гликоалкалоидов не полностью очерчены, даже для основных гликоалкалоидов картофеля, соланина и чаконина. Гликоалкалоиды, полученные из мевалонатного пути через холестерин, встречаются по всему клубню, но в основном синтезируются в феллодерме [5]. На удивление мало известно о генах и энзимологии, участвующих в превращении холестерина в различные гликоалкалоиды. Идентификация генов биосинтеза гликоалкалоидов позволила использовать трансгенные подходы к снижению содержания гликоалкалоидов в картофеле, поскольку гликоалкалоиды обычно считаются антипитательными соединениями [6]. Картофель со сверхэкспрессией стеролметилтрансферазы сои показал снижение количества как холестерина, так и гликоалкалоидов [7].
Первоначальный скрининг методом ВЭЖХ-МС показал, что среди сотен соединений, обнаруженных в клубнях, состав гликоалкалоидов был особенно разнообразным. Картофельные гликоалкалоиды можно разделить на два основных класса: соланидановые или спиросолановые агликоны, в связи с этим исследование [8] было сосредоточено на соланидиновых или соланиданоподобных гликоалкалоидах.
В данном исследовании был использован метод тандемной масс-спектрометрии для определения метаболомного профиля присутствующих гликоалкалоидов в восьми сортах цветного картофеля, выращенного Сибирским федеральным научным центром агробиотехнологий (Краснообск Новосибирской области) Российской академии наук. Внешний вид сортов цветного картофеля Гибрид 15/F-2-13 и Синильга из Сибирского федерального научного центра агробиотехнологий представлен на рисунке 1.
А B
Рис.1. Внешний вид сортов цветного картофеля: A – Гибрид 15/F-2-13; B – Синильга
Цель исследования – метаболомное исследование гликоалкалоидов методом тандемной масс-спектрометрии в восьми сортах цветного картофеля Solanum Tuberosum L.
Объекты и методы. Объектом исследования являлись восемь сортов сибирского цветного картофеля S. tuberosum, полученные методом селекционного отбора из Сибирского федерального научного центра агробиотехнологий Российской академии наук. Это сорта: Тулеевский, Кузнечанка, Памяти Антошкиной, Томичка, Гибрид 15/F-2-13, Гибрид 22103-10, Гибрид 17-5/6-11, Синильга. Картофель был собран на полях Сибирского федерального научного центра агробиотехнологий РАН в конце сентября 2020 г.
Для получения высококонцентрированных экстрактов применяли фракционную мацерацию. При этом общее количество экстрагента (спирт метиловый ХЧ) делили на 3 части и последовательно настаивали на картофеле первую часть, затем вторую и третью. Время настаивания каждой части экстрагента составило 7 сут.
Для выполнения разделения многокомпонентных смесей использовался жидкостный хроматограф высокого давления Shimadzu LC-20 Prominence HPLC (Shimadzu, Япония), оборудованный UV-детектором и обратнофазной колонкой Shodex ODP-40 4E. Программа элюции градиента следующая: 0,0 – 4 мин, 100 % CH3CN; 4 – 60 мин, 100 % – 25 % CH3CN; 60 – 75 мин, 25 % – 0 % CH3CN; контрольная промывка 75–120 мин 0 % CH3CN. Весь ВЭЖХ-анализ сделан с UV-VIS-детектором SPD-20A (Kanda-Nishikicho 1-chrome, Shimadzu, Chiyoda-ku, Токио, Япония) при длинах волн 230
и 330
температура 17 °С. Объем впрыска составлял 1 мл.
Масс-спектрометрические данные получены с помощью ионной ловушки amaZon SL (производство фирмы «BRUKER DALTONIKS», Германия), оснащенной источником ионизации электрораспылением ESI в режимах отрицательных и положительных ионов. Оптимизированные параметры получены следующим образом: температура источника ионизации – 70 °С, поток газа – 4 л/мин, газ-небилайзер (распылитель) – 7,3 psi; капиллярное напряжение – 4500 V; напряжение на изгибе торцевой пластины – 1500 V; фрагментатор – 280 V; энергия столкновения – 60 eV. Масс-спектрометр использовался в диапазоне сканирования m/z 100 – 1,700 для MС и МС/МС.
Результаты и их обсуждение. Для экспериментальных исследований были отобраны восемь наиболее эффективных сортов, полученных методом селекционного отбора из Сибирского федерального научного центра агробиотехнологий Российской академии наук. Это сорта: Тулеевский, Кузнечанка, Памяти Антошкиной, Томичка, Гибрид 15/F-2-13, Гибрид 22103-10, Гибрид 17-5/6-11, Синильга. Картофель был собран на полях в конце сентября 2020 г.
Данные масс-спектрометрии высокой точности регистрировали на ионной ловушке amaZon SL BRUKER DALTONIKS, оснащенной источником ESI в режиме отрицательных и положительных ионов. Реализован четырехступенчатый режим разделения ионов (режим МС/МС). Все химические профили образцов были получены методом ВЭЖХ – ESI – MS/MS. Сочетание обоих режимов ионизации (положительного и отрицательного) в режиме полного сканирования МС дает дополнительную достоверность определения молекулярной массы (рис. 2.). Данное сочетание режимов ионизации обеспечивает самую высокую чувствительность и приводит к ограниченной фрагментации, что делает этот метод наиболее подходящим для определения молекулярной массы разделяемых гликоалкалоидов, особенно в случаях, когда концентрация низкая. Идентификация производилась путем сравнения значений m/z, RT и моделей фрагментации со спектральными данными MS2, взятыми из научной литературы, или путем поиска в базах данных (MS2T, MassBank, HMDB).
Полученные масс-спектрометрические данные позволяют составить подробную таблицу присутствия и относительной скорости ионизации идентифицированных соединений у разных сортов сибирского картофеля S. tuberosum (табл.). Примененный в жидкостной хроматографии градиент замещения ацетонитрила водой позволил расщепить все стероидные алкалоиды-гликозиды за достаточно короткое время.
|
85 |
Присутствие и относительная скорость ионизации гликоалкалоидов в экстрактах восьми сортов картофеля S. tuberosum
|
Класс соединения |
Химическая формула |
Тулеевский |
Памяти Антошкиной |
Кузнечанка |
Синильга |
Гибрид 15/F-2-13 |
Гибрид 22103-10 |
Гибрид 17-5/6-11 |
Томичка |
|
Solanidine |
C27H43NO |
17096740 |
795053 |
115080056 |
7042635 |
5311000 |
6035235 |
||
|
Tomatidinol |
C27H43NO2 |
823000 |
|||||||
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C32H33NO8 |
4743783 |
156799776 |
367534112 |
|||||
|
Beta-chaconine |
C39H63NO10 |
21305856 |
609200 |
20585252 |
2710060 |
21622096 |
8149021 |
183508960 |
|
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C39H63NO11 |
6155471 |
|||||||
|
Dehydrochaconine |
C45H71NO14 |
6702001 |
89178 |
4086531 |
4452084 |
||||
|
Alpha-chaconine |
C45H73NO14 |
421975456 |
39029 |
65948552 |
553120512 |
984176256 |
334465696 |
483301952 |
2707656448 |
|
Solanidadienol chacotriose |
C45H71NO15 |
386528 |
|||||||
|
Solanidadiene solatriose |
C45H71NO15 |
3091057 |
1518641 |
||||||
|
Solanidenone chacotriose |
C45H71NO15 |
3091057 |
|||||||
|
Alpha-solanine |
C45H73NO15 |
164941056 |
172020928 |
258771296 |
472516576 |
144006848 |
112939576 |
409770592 |
|
|
Leptinine I |
C45H73NO15 |
332765 |
258771296 |
112939576 |
|||||
|
Solanidenol chacotriose |
C45H73NO15 |
164941056 |
110534 |
172020928 |
258771296 |
144006848 |
112939576 |
||
|
Solanidadiene solatriose |
C45H73NO15 |
472516576 |
144006848 |
112939576 |
|||||
|
Solanidadienol solatriose |
C45H71NO16 |
237438 |
|||||||
|
Leptinine II |
C45H73NO16 |
3832333 |
5262421 |
540000 |
593110 |
||||
|
Solanidenol solatriose |
C45H73NO16 |
520382 |
|||||||
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C45H75NO16 |
117000 |
112000 |
118629 |
109000 |
||||
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C45H77NO16 |
40241 |
70493 |
1609522 |
|||||
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C46H75NO16 |
87000 |
|||||||
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C45H76NO17 |
260306 |
193927 |
46531 |
72000 |
||||
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C49H79NO18 |
91000 |
94401 |
Разрешение отдельных пиков стероидных алкалоидных гликозидов в применяемом градиенте жидкостной хроматографии было удовлетворительным, и идентификация соединений на основе зарегистрированных масс-спектров была однозначной. В экстрактах в качестве основных гликоалкалоидных компонентов идентифицированы a-чаконин и a-соланин, их пики легко распознавались в суммарном ионном токе (рис. 2, 3).
Рис. 2. Масс-спектр a-соланина из экстракта S. Tuberosum (сорт Тулеевский), m/z 868.41
Рис. 3. Масс-спектр a-чаконина из экстракта of S. Tuberosum (сорт Тулеевский), m/z 852.41
Заключение. Научные исследования, представленные в данной работе, показали присутствие большой разновариантности гликоалкалоидов в сортах сибирского цветного картофеля S. tuberosum L. Это сорта: Тулеевский, Кузнечанка, Памяти Антошкиной, Томичка, Гибрид 15/F-2-13, Гибрид 22103-10, Гибрид 17-5/6-11, Синильга. Все селекционные образцы получены в Сибирском федеральном научном центре агробиотехнологий Российской академии наук. Для идентифицирования целевых аналитов из экстрактов картофеля была использована тандемная масс-спектрометрия (высокоэффективная жидкостная экстракция в соединении с ионной ловушкой BRUKER DALTONIKS). Данный метод позволил идентифицировать 22 соединения, относящихся к группе гликоалкалоидов.
1. Spooner D.M., Hijmans R.J. Potato systematics and germplasm collecting, 1989–2000 // Am. J. Po-tato Res. 2001. T. 78. P. 237–268.
2. Roessner U., Willmitzer L., Fernie A.R. High-resolution metabolic phenotyping of genetically and environmentally diverse potato tuber systems. Identification of phenocopies // Plant Physiol. 2001. T. 127. P. 749–764.
3. Monitoring changes in anthocyanin and steroid alkaloid glycoside content in lines of transgenic pota-to plants using liquid chromatography/mass spectrometry / M. Stobiecki [et al.] // Phytochem. 2003. T. 62. P. 959–969.
4. Griffiths D.W., Bain H., Dale M.F.B. The effect of low-temperature storage on the glycoalkaloid con-tent of potato (Solanum tuberosum) tubers // J. Sci. Food Agric. 1997. T. 74. P. 301–307.
5. Krits P., Fogelman E., Ginzberg I. Potato steroidal glycoalkaloid levels and the expression of key isoprenoid metabolic genes // Planta. 2007. T. 227. P. 143–150.
6. Shakya R., Navarre D.A. LC-MS Analysis of Solanidane Glycoalkaloid Diversity among Tubers of Four Wild Potato Species and Three Cultivars (Solanum tuberosum) // J. Agric. Food Chem. 2008. T. 56. P. 6949–6958.
7. Reduction of cholesterol and glycoalkaloid levels in transgenic potato plants by overexpression of a type 1 sterol methyltransferase cDNA / L. Arnqvist [et al.] // Plant Physiol. 2003. T. 131. P. 1792–1799.
8. Friedman M., McDonald G.M. Potato glycoalkaloids: chemistry, analysis, safety, and plant physiolo-gy. Crit. ReV // Plant Sci. 1997. T. 16. P. 55–132.
