Краснообск, Новосибирская область, Россия
Цель – метаболомное исследование гликоалкалоидов методом тандемной масс-спектрометрии в восьми сортах цветного картофеля. В данной работе исследуются экстрак-ты цветного картофеля, селекционные образцы которого получены из Сибирского федерально-го научного центра агробиотехнологий РАН, на предмет присутствия разнообразия гликоалка-лоидов. Использовано восемь сортообразцов: Тулеевский, Кузнечанка, Памяти Антошкиной, То-мичка, Гибрид 15/F-2-13, Гибрид 22103-10, Гибрид 17-5/6-11, Синильга. Гликоалкалоиды представ-ляют собой растительные метаболиты, содержащие олигосахарид, стероид С27 и гетероцик-лический компонент азота. Первоначальный скрининг методом ВЭЖХ-МС показал, что среди сотен соединений, обнаруженных в клубнях, состав гликоалкалоидов был особенно разнообраз-ным. Картофельные гликоалкалоиды можно разделить на два основных класса: соланидановые или спиросолановые агликоны. Считается, что соланин и чаконин составляют более 90 % от общего количества гликоалкалоидов одомашненного картофеля, при этом чаконина часто больше, чем соланина. Методом тандемной масс-спектрометрии (высокоэффективная жид-костная экстракция и ионная ловушка BRUKER DALTONIKS) проанализированы экстракты дан-ных сортообразцов на присутствие в них соединений из семейства гликоалкалоидов. Резуль-таты исследования показали присутствие 22 гликоалкалоидов в предложенных сортообразцах, некоторые из выявленных гликоалкалоидов пока не описаны в мировой научной литературе.
Solanum tuberosum, ВЭЖХ-MС/MС, тандемная масс-спектрометрия, картофель, гликоалкалоиды
Введение. Зародышевая плазма картофеля характеризуется обширным генетическим разнообразием, включающим около 200 диких видов, обитающих в чрезвычайно разнообразных местообитаниях по всей Америке [1]. Однако лишь небольшая часть этого генетического разнообразия была включена в выведение современных сортов картофеля, что привело к очень узкому генетическому коридору. Следовательно, дикие виды представляют собой в значительной степени неиспользованный ресурс, который, вероятно, содержит много новых генов, полезных для улучшения свойств одомашненного картофеля. Относительно мало известно о степени разнообразия метаболитов, присутствующих в зародышевой плазме картофеля. Методы метаболомного исследования дают возможность понять изобилие и разнообразие полифенольного состава и соединений других классов в растениях. Было показано, что методы метаболомного исследования нескольких сортов картофеля с помощью ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС являются эффективным инструментом исследования [2, 3].
Предварительный анализ семи генотипов в исследовании [4] показал, что гликоалкалоиды являются большим источником разнообразия метаболитов. Гликоалкалоиды представляют собой растительные метаболиты, содержащие олигосахарид, стероид С27 и гетероциклический компонент азота. Считается, что соланин и чаконин составляют более 90 % от общего количества гликоалкалоидов одомашненного картофеля, при этом чаконина часто больше, чем соланина.
Пути биосинтеза гликоалкалоидов не полностью очерчены, даже для основных гликоалкалоидов картофеля, соланина и чаконина. Гликоалкалоиды, полученные из мевалонатного пути через холестерин, встречаются по всему клубню, но в основном синтезируются в феллодерме [5]. На удивление мало известно о генах и энзимологии, участвующих в превращении холестерина в различные гликоалкалоиды. Идентификация генов биосинтеза гликоалкалоидов позволила использовать трансгенные подходы к снижению содержания гликоалкалоидов в картофеле, поскольку гликоалкалоиды обычно считаются антипитательными соединениями [6]. Картофель со сверхэкспрессией стеролметилтрансферазы сои показал снижение количества как холестерина, так и гликоалкалоидов [7].
Первоначальный скрининг методом ВЭЖХ-МС показал, что среди сотен соединений, обнаруженных в клубнях, состав гликоалкалоидов был особенно разнообразным. Картофельные гликоалкалоиды можно разделить на два основных класса: соланидановые или спиросолановые агликоны, в связи с этим исследование [8] было сосредоточено на соланидиновых или соланиданоподобных гликоалкалоидах.
В данном исследовании был использован метод тандемной масс-спектрометрии для определения метаболомного профиля присутствующих гликоалкалоидов в восьми сортах цветного картофеля, выращенного Сибирским федеральным научным центром агробиотехнологий (Краснообск Новосибирской области) Российской академии наук. Внешний вид сортов цветного картофеля Гибрид 15/F-2-13 и Синильга из Сибирского федерального научного центра агробиотехнологий представлен на рисунке 1.
А B
Рис.1. Внешний вид сортов цветного картофеля: A – Гибрид 15/F-2-13; B – Синильга
Цель исследования – метаболомное исследование гликоалкалоидов методом тандемной масс-спектрометрии в восьми сортах цветного картофеля Solanum Tuberosum L.
Объекты и методы. Объектом исследования являлись восемь сортов сибирского цветного картофеля S. tuberosum, полученные методом селекционного отбора из Сибирского федерального научного центра агробиотехнологий Российской академии наук. Это сорта: Тулеевский, Кузнечанка, Памяти Антошкиной, Томичка, Гибрид 15/F-2-13, Гибрид 22103-10, Гибрид 17-5/6-11, Синильга. Картофель был собран на полях Сибирского федерального научного центра агробиотехнологий РАН в конце сентября 2020 г.
Для получения высококонцентрированных экстрактов применяли фракционную мацерацию. При этом общее количество экстрагента (спирт метиловый ХЧ) делили на 3 части и последовательно настаивали на картофеле первую часть, затем вторую и третью. Время настаивания каждой части экстрагента составило 7 сут.
Для выполнения разделения многокомпонентных смесей использовался жидкостный хроматограф высокого давления Shimadzu LC-20 Prominence HPLC (Shimadzu, Япония), оборудованный UV-детектором и обратнофазной колонкой Shodex ODP-40 4E. Программа элюции градиента следующая: 0,0 – 4 мин, 100 % CH3CN; 4 – 60 мин, 100 % – 25 % CH3CN; 60 – 75 мин, 25 % – 0 % CH3CN; контрольная промывка 75–120 мин 0 % CH3CN. Весь ВЭЖХ-анализ сделан с UV-VIS-детектором SPD-20A (Kanda-Nishikicho 1-chrome, Shimadzu, Chiyoda-ku, Токио, Япония) при длинах волн 230
и 330
температура 17 °С. Объем впрыска составлял 1 мл.
Масс-спектрометрические данные получены с помощью ионной ловушки amaZon SL (производство фирмы «BRUKER DALTONIKS», Германия), оснащенной источником ионизации электрораспылением ESI в режимах отрицательных и положительных ионов. Оптимизированные параметры получены следующим образом: температура источника ионизации – 70 °С, поток газа – 4 л/мин, газ-небилайзер (распылитель) – 7,3 psi; капиллярное напряжение – 4500 V; напряжение на изгибе торцевой пластины – 1500 V; фрагментатор – 280 V; энергия столкновения – 60 eV. Масс-спектрометр использовался в диапазоне сканирования m/z 100 – 1,700 для MС и МС/МС.
Результаты и их обсуждение. Для экспериментальных исследований были отобраны восемь наиболее эффективных сортов, полученных методом селекционного отбора из Сибирского федерального научного центра агробиотехнологий Российской академии наук. Это сорта: Тулеевский, Кузнечанка, Памяти Антошкиной, Томичка, Гибрид 15/F-2-13, Гибрид 22103-10, Гибрид 17-5/6-11, Синильга. Картофель был собран на полях в конце сентября 2020 г.
Данные масс-спектрометрии высокой точности регистрировали на ионной ловушке amaZon SL BRUKER DALTONIKS, оснащенной источником ESI в режиме отрицательных и положительных ионов. Реализован четырехступенчатый режим разделения ионов (режим МС/МС). Все химические профили образцов были получены методом ВЭЖХ – ESI – MS/MS. Сочетание обоих режимов ионизации (положительного и отрицательного) в режиме полного сканирования МС дает дополнительную достоверность определения молекулярной массы (рис. 2.). Данное сочетание режимов ионизации обеспечивает самую высокую чувствительность и приводит к ограниченной фрагментации, что делает этот метод наиболее подходящим для определения молекулярной массы разделяемых гликоалкалоидов, особенно в случаях, когда концентрация низкая. Идентификация производилась путем сравнения значений m/z, RT и моделей фрагментации со спектральными данными MS2, взятыми из научной литературы, или путем поиска в базах данных (MS2T, MassBank, HMDB).
Полученные масс-спектрометрические данные позволяют составить подробную таблицу присутствия и относительной скорости ионизации идентифицированных соединений у разных сортов сибирского картофеля S. tuberosum (табл.). Примененный в жидкостной хроматографии градиент замещения ацетонитрила водой позволил расщепить все стероидные алкалоиды-гликозиды за достаточно короткое время.
|
85 |
Присутствие и относительная скорость ионизации гликоалкалоидов в экстрактах восьми сортов картофеля S. tuberosum
|
Класс соединения |
Химическая формула |
Тулеевский |
Памяти Антошкиной |
Кузнечанка |
Синильга |
Гибрид 15/F-2-13 |
Гибрид 22103-10 |
Гибрид 17-5/6-11 |
Томичка |
|
Solanidine |
C27H43NO |
17096740 |
795053 |
115080056 |
7042635 |
5311000 |
6035235 |
||
|
Tomatidinol |
C27H43NO2 |
823000 |
|||||||
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C32H33NO8 |
4743783 |
156799776 |
367534112 |
|||||
|
Beta-chaconine |
C39H63NO10 |
21305856 |
609200 |
20585252 |
2710060 |
21622096 |
8149021 |
183508960 |
|
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C39H63NO11 |
6155471 |
|||||||
|
Dehydrochaconine |
C45H71NO14 |
6702001 |
89178 |
4086531 |
4452084 |
||||
|
Alpha-chaconine |
C45H73NO14 |
421975456 |
39029 |
65948552 |
553120512 |
984176256 |
334465696 |
483301952 |
2707656448 |
|
Solanidadienol chacotriose |
C45H71NO15 |
386528 |
|||||||
|
Solanidadiene solatriose |
C45H71NO15 |
3091057 |
1518641 |
||||||
|
Solanidenone chacotriose |
C45H71NO15 |
3091057 |
|||||||
|
Alpha-solanine |
C45H73NO15 |
164941056 |
172020928 |
258771296 |
472516576 |
144006848 |
112939576 |
409770592 |
|
|
Leptinine I |
C45H73NO15 |
332765 |
258771296 |
112939576 |
|||||
|
Solanidenol chacotriose |
C45H73NO15 |
164941056 |
110534 |
172020928 |
258771296 |
144006848 |
112939576 |
||
|
Solanidadiene solatriose |
C45H73NO15 |
472516576 |
144006848 |
112939576 |
|||||
|
Solanidadienol solatriose |
C45H71NO16 |
237438 |
|||||||
|
Leptinine II |
C45H73NO16 |
3832333 |
5262421 |
540000 |
593110 |
||||
|
Solanidenol solatriose |
C45H73NO16 |
520382 |
|||||||
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C45H75NO16 |
117000 |
112000 |
118629 |
109000 |
||||
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C45H77NO16 |
40241 |
70493 |
1609522 |
|||||
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C46H75NO16 |
87000 |
|||||||
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C45H76NO17 |
260306 |
193927 |
46531 |
72000 |
||||
|
Неизвестный гликоалкалоид |
C49H79NO18 |
91000 |
94401 |
Разрешение отдельных пиков стероидных алкалоидных гликозидов в применяемом градиенте жидкостной хроматографии было удовлетворительным, и идентификация соединений на основе зарегистрированных масс-спектров была однозначной. В экстрактах в качестве основных гликоалкалоидных компонентов идентифицированы a-чаконин и a-соланин, их пики легко распознавались в суммарном ионном токе (рис. 2, 3).
Рис. 2. Масс-спектр a-соланина из экстракта S. Tuberosum (сорт Тулеевский), m/z 868.41
Рис. 3. Масс-спектр a-чаконина из экстракта of S. Tuberosum (сорт Тулеевский), m/z 852.41
Заключение. Научные исследования, представленные в данной работе, показали присутствие большой разновариантности гликоалкалоидов в сортах сибирского цветного картофеля S. tuberosum L. Это сорта: Тулеевский, Кузнечанка, Памяти Антошкиной, Томичка, Гибрид 15/F-2-13, Гибрид 22103-10, Гибрид 17-5/6-11, Синильга. Все селекционные образцы получены в Сибирском федеральном научном центре агробиотехнологий Российской академии наук. Для идентифицирования целевых аналитов из экстрактов картофеля была использована тандемная масс-спектрометрия (высокоэффективная жидкостная экстракция в соединении с ионной ловушкой BRUKER DALTONIKS). Данный метод позволил идентифицировать 22 соединения, относящихся к группе гликоалкалоидов.
1. Spooner D.M., Hijmans R.J. Potato systematics and germplasm collecting, 1989–2000 // Am. J. Po-tato Res. 2001. T. 78. P. 237–268.
2. Roessner U., Willmitzer L., Fernie A.R. High-resolution metabolic phenotyping of genetically and environmentally diverse potato tuber systems. Identification of phenocopies // Plant Physiol. 2001. T. 127. P. 749–764.
3. Monitoring changes in anthocyanin and steroid alkaloid glycoside content in lines of transgenic pota-to plants using liquid chromatography/mass spectrometry / M. Stobiecki [et al.] // Phytochem. 2003. T. 62. P. 959–969.
4. Griffiths D.W., Bain H., Dale M.F.B. The effect of low-temperature storage on the glycoalkaloid con-tent of potato (Solanum tuberosum) tubers // J. Sci. Food Agric. 1997. T. 74. P. 301–307.
5. Krits P., Fogelman E., Ginzberg I. Potato steroidal glycoalkaloid levels and the expression of key isoprenoid metabolic genes // Planta. 2007. T. 227. P. 143–150.
6. Shakya R., Navarre D.A. LC-MS Analysis of Solanidane Glycoalkaloid Diversity among Tubers of Four Wild Potato Species and Three Cultivars (Solanum tuberosum) // J. Agric. Food Chem. 2008. T. 56. P. 6949–6958.
7. Reduction of cholesterol and glycoalkaloid levels in transgenic potato plants by overexpression of a type 1 sterol methyltransferase cDNA / L. Arnqvist [et al.] // Plant Physiol. 2003. T. 131. P. 1792–1799.
8. Friedman M., McDonald G.M. Potato glycoalkaloids: chemistry, analysis, safety, and plant physiolo-gy. Crit. ReV // Plant Sci. 1997. T. 16. P. 55–132.
