Vladivostok, Vladivostok, Russian Federation
The purpose of the study is to obtain stress-resistant plants – buckwheat regenerants on selective media in vitro culture and to select samples with improved breeding characteristics in the field. The object of the study is the varieties Kitawasesoba (Japan), Izumrud (Russia), the hybrid Izumrud × Kitawasesoba. A study on the production of regenerated plants of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) was carried out on the basis of the laboratory of agricultural biotechnology of the Federal Scientific Center for Agricultural Biotechnology of the Far East named after I.I. A.K. Chaika. Microcuttings and callus of buckwheat were cultivated for 25 days on selective media with a mineral base according to Murashige and Skoog (MS) without the addition of hormones, supplemented, depending on the variant of the experiment: zinc sulfate – 202, 404, 606 mg/l or copper sulfate – 23, 46, 69, 161, 184 mg/l. Control – hormone-free MS medium containing 0.025 mg/l copper sulfate and 8.6 mg/l zinc sulfate. Microcuttings of Izumrud buckwheat plants were passaged on media containing salicylic acid (SA) in an in vitro culture of 6.9; 13.8; 20.7; 27.6 mg/l for 24 hours, 48 hours and 24 days. The accumulation of rutin increased by 33.6 % compared with the control after cultivation of buckwheat microshoots of the Izumrud variety under in vitro conditions on a medium with a high content of copper sulfate (161 mg/l). In subsequent generations, in plants grown in a breeding nursery, the increased biosynthesis of rutin was preserved. Short-term exposure for 2 days to salicylic acid (6.9 and 13.8 mg/l) on microshoot tissues contributed to an increase in the content of rutin in regenerated plants by 91.8 and 69.2 %, respectively. The field study of the breeding nursery of seed progeny of 11 regenerative lines tolerant to copper and zinc ions made it possible to select 5 promising lines distinguished by a complex of valuable traits (productivity, coarse grain, stress resistance, genetic flexibility).
common buckwheat, in vitro breeding, selective medium, copper sulfate, zinc sulfate, salicylic acid, regenerated plants, rutin, breeding nursery
Введение. В связи с глобальным ухудшением климата планеты, которое происходит в последние десятилетия, важнейшей проблемой современного растениеводства и селекции является повышение устойчивости растений к абиотическим и биотическим стрессам [1]. Создание сортов, устойчивых к экологическим факторам среды, лимитирующим формирование потенциально возможной продуктивности, особенно актуально для Приморского края, как региона с муссонным климатом.
Для получения форм растений с повышенным уровнем стрессоустойчивости успешно используют новые биотехнологические подходы. Система in vitro является комплексным фактором, влияющим на генетическую программу растений. Получение клеточных культур из различных частей растения с использованием летальных доз ионов тяжелых металлов, манипуляции с ними могут служить базисом для последующего отбора вариантов с качественно новыми показателями [2, 3].
В ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки работа с применением в качестве селективного фактора тяжелых металлов при культивировании гречихи in vitro проводится с 2006 г. За это время получено более 60 образцов гречихи, толерантных к тяжелым металлам. В 2021 г. новый сорт гречихи Уссурочка, созданный при использовании в селекционном процессе толерантной к меди регенерантной линии, включен в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию по Дальневосточному региону [4].
Цель исследования – получение на селективных средах в культуре in vitro стрессоустойчивых растений-регенерантов гречихи и отбор в полевых условиях образцов с улучшенными селекционными характеристиками.
Объекты и методы. Исследование по получению растений-регенерантов гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Moench) проведено на базе лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки по ранее описанной методике [5, 6]. Объектом исследования служили сорта: Китавасесоба (Япония), Изумруд (Россия), гибрид Изумруд × Китавасесоба. Микрочеренки и каллус гречихи культивировали в течение 25 дней на селективных средах с минеральной основой по Мурасиге и Скугу (МС) без добавления гормонов, дополненных (в зависимости от варианта опыта): сульфатом цинка – 101, 404, 606 мг/л или сульфатом меди – 23, 46, 69, 161, 184 мг/л. Контроль – безгормональная среда МС, содержащая 0,025 мг/л сернокислой меди и 8,6 мг/л сернокислого цинка. Микрочеренки растений гречихи сорта Изумруд пассировали на среды с содержанием салициловой кислоты (СК) в культуре in vitro 6,9; 13,8; 20,7; 27,6 мг/л в течение 24 ч, 48 ч и 24 сут.
Пробирочные растения выращивали в контролируемых условиях световой комнаты при 16-часовом дне, температуре 23 °С, освещенности 4 тыс. лк. Растения-регенеранты (R0) высаживали в почву, размноженное семенное потомство регенерантов (R1 и далее) изучали в полевых условиях селекционного питомника (СП). Содержание рутина в растительных пробах определяли по М.Н. Запрометову [7] в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН. Адаптивные свойства селекционных образцов, толерантных к ионам тяжелых металлов, по признаку семенной продуктивности оценивали по параметрам стрессоустойчивости, генетической гибкости [8]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по методике Б.А. Доспехова [9].
Результаты и их обсуждение. В настоящее время в мировой и российской селекции гречихи актуальным направлением является выведение сортов с повышенным содержанием рутина [10–12]. Способность к повышенному синтезу фенольных соединений может служить критерием высокой устойчивости растений к действию стрессовых факторов [11, 13]. Отбор форм гречихи с повышенным содержанием флавоноидов способствует выведению адаптивных сортов, устойчивых к разнообразным стрессовым факторам внешней среды. В процессе эксперимента выявлен определенный токсический эффект солей меди и цинка в повышенных концентрациях, который привел к снижению регенерационной способности растений гречихи в культуре in vitro. Салициловая кислота индуцировала ранний переход растений-регенерантов к цветению. Все это затрудняло микроклональное размножение и дальнейшее изучение полученного опытного материала в полном объеме.
Биохимический анализ показал, что в контрольных растениях сорта Изумруд в культуре in vitro содержание рутина составляло 1,46 %, значение данного показателя в микрорастениях после обработки салициловой кислотой (СК) варьировало от 1,14 до 2,8 % (табл. 1).
Таблица 1
Содержание рутина в растительных образцах растений-регенерантов гречихи
сорта Изумруд, полученных в результате воздействия различных селективных агентов
в культуре in vitro
|
Селективный агент |
Содержание селективного агента в культуральной среде, мг/л |
Период культивирования |
Содержание рутина, % |
|
|
сут |
ч |
|||
|
Контроль |
0 |
25 |
– |
1,46 ± 0,1 |
|
ZnS04 · 7H2O |
404,0 |
25 |
– |
1,52 ± 0,1 |
|
606,0 |
25 |
– |
1,69 ± 0,1 |
|
|
CuS04 · 5H2O |
161,0 |
25 |
– |
1,95 ± 0,1* |
|
184,0 |
25 |
– |
1,14 ± 0,0 |
|
|
Салициловая кислота |
6,9 |
24 |
– |
2,21± 0,1* |
|
20,7 |
24 |
– |
1, 23 ± 0,0 |
|
|
13,8 |
– |
24 |
2,10 ± 0,2* |
|
|
27,6 |
– |
24 |
1,69 ± 0,1 |
|
|
20,7 |
– |
48 |
1,55 ± 0,1 |
|
|
6,9 |
– |
48 |
2,8 ± 0,1** |
|
|
13,8 |
– |
48 |
2,47 ± 0,1** |
|
|
|
|
|
|
1,82 ± 0,14 |
|
НСР05 |
|
|
|
0,42 |
Здесь и далее: 
– среднее значение параметра; S
– ошибка среднего значения параметра; (*) – различия достоверны в сравнении с контролем; (**) – различия достоверны со средней по опыту и контролем при Р < 0,05.
Максимальное содержание рутина (2,8 %) отмечено у растений сорта Изумруд, микропобеги которых культивировали в течение 2 сут на среде с содержанием СК 6,9 мг/л. При увеличении концентрации СК до 13,8 мг/л накопление рутина в растениях in vitro уменьшилось и составило 2,47 %. Длительная обработка в течение 24 сут и высокая концентрация СК в питательной среде (20,7 мг/л) отрицательно повлияли на биосинтезе рутина: происходило снижение его в растительных тканях до 1,23 %, что ниже, чем в контрольных растениях.
При воздействии сульфата меди в дозе 161 мг/л на микропобеги сорта Изумруд в условиях in vitro отмечено максимальное содержание рутина (1,95 %), на 33,6 % больше, чем в контроле. В полевых условиях наибольшее содержание рутина также наблюдалось в растениях гречихи сорта Изумруд, полученных при воздействии высоких концентраций сульфата меди (184 и 161 мг/л) – 3,93 и 3,84 % соответственно, при содержании в контроле – 3,19 %.
В полевых условиях селекционного питомника в течение трех лет (2019–2021 гг.) оценивали семенное потомство 11 регенерантных линий, полученных в результате регенерации из каллуса и микропобегов на средах с высоким содержанием ионов меди и цинка (табл. 2). Превышение показателя продуктивность семян по сравнению с исходными формами и сортом стандартом Изумруд отмечено у растений семи линий, толерантных к меди (№ 3–9) и двух к цинку – № 11, № 13. Регенерантные линии гречихи характеризовались крупнозерностью, масса 1000 зерен составляла 32,0–39,1 г при низкой вариабельности данного показателя (V = 6,2 %). Исходную форму по данному признаку превысили три линии, полученные на селективной среде с ионами меди (№ 3–5) и одна – с ионами цинка (№ 13).
Таблица 2
Селекционные показатели образцов гречихи, полученных при воздействии
высоких концентраций меди и цинка в питательной среде в культуре in vitro
(СП, 2019–2021 гг.)
|
Номер линии |
Сорт, регенерантная линия
|
Концентрация сульфата меди (цинка), мг/л |
Продуктивность семян с 1-го растения, г |
Стрессоустойчивость У2 – У1 |
Генетическая гибкость (У2+У1)/2 |
Масса 1000 зерен, г |
||
|
|
У2 (min) |
У1 (max) |
||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
1 |
Изумруд (стандарт) |
0 |
4,8±0,9 |
3,1 |
6,2 |
–3,1 |
4,7 |
35,8±1,1 |
|
2 |
Китавасесоба (исходный сорт) |
0 |
5,3±0,6 |
4,1 |
6,2 |
–2,1 |
5,2 |
33,1±1,1 |
|
3 |
Изумруд × Китавасесоба 1 Сu+2 (МП) |
11,5 |
6,1±1,0** |
4,1 |
7,7 |
–3,6 |
5,9 |
39,1±1,5** |
|
4 |
Изумруд × Китавасесоба 10 Сu+2 (МП) |
115,0 |
5,4±0,9* |
4,0 |
6,9 |
–2,9 |
5,5 |
35,4±1,4** |
|
5 |
Изумруд × Китавасесоба 14 Сu+2 (МП) |
161,0 |
5,8±1,0* |
4,4 |
7,9 |
–3,5 |
6,2 |
35,8±1,2** |
|
6 |
Изумруд × Китавасесоба 16 Сu+2 (МП) |
184,0 |
6,2±1,2** |
3,8 |
7,9 |
–4,1 |
5,9 |
34,07±1,9 |
Окончание табл. 2
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
7 |
Китавасесоба 4 Сu+2 + колхицин 48 ч (МП) |
46,0 |
5,9±0,3** |
5,6 |
6,6 |
–1,0 |
6,1 |
33,2±1,8 |
|
8 |
Китавасесоба R 29 Сu+2 (К) |
69,0 |
5,8±1,0* |
3,7 |
7,1 |
–3,4 |
5,4 |
32,0±2,3 |
|
9 |
Китавасесоба R 30 Сu+2 (К) |
69,0 |
7,1±0,7** |
6,5 |
7,8 |
–1,3 |
7,2 |
34,8±2,4 |
|
10 |
Китавасесоба R 62 Сu+2 (К) |
69,0 |
5,3±1,0 |
3,5 |
7,0 |
–3,5 |
5,3 |
31,9±2,3 |
|
11 |
Китавасесоба 1 Zn+2 (МП) |
101,0 |
5,6±0,5* |
4,9 |
6,6 |
–1,7 |
5,8 |
34,9±2,2 |
|
12 |
Китавасесоба 4 Zn+2 (МП) |
404,0 |
4,8±0,9 |
3,9 |
5,7 |
–1,8 |
4,8 |
36,5±4,9 |
|
13 |
Китавасесоба 6 Zn+2 (МП) |
606,0 |
5,6±1,3* |
3,1 |
7,5 |
–4,4 |
5,3 |
38,2±2,1** |
|
V, % |
|
10,8 |
|
|
|
|
6,2 |
|
|
НСР05 |
|
0,52 |
|
|
|
|
1,87 |
|
Примечание: (*) – различия достоверны со стандартом, (**) с исходной формой при Р < 0,05; МП – образец получен в результате регенерации из микропобега, К – каллуса.
Уровень устойчивости к стрессам является генетически контролируемым и наследуемым признаком, который проявляется, когда растения оказываются под действием экстремального фактора [14]. Высокую устойчивость к стрессу показали линии № 7, 9. Средняя урожайность сортов в контрастных (стрессовых и нестрессовых) условиях (У1 +У2 /2) характеризует их генетическую гибкость. Максимальные соотношения между генотипом и факторами среды отмечены у регенерантов № 9 (7,2 г), № 5 (6,2 г), № 7 (6,1 г), а также № 3, 6 (5,9 г).
Заключение. В результате исследования установлено, что культивирование микропобегов in vitro на среде с салициловой кислотой в концентрации 6,9; 13,8 мг/л в течение 48 ч и сульфата меди в концентрации 161, 184 мг/л способствует повышенному накоплению рутина в надземной части растений гречихи. Для дальнейшей селекции отобрано семь перспективных регенерантных линий, выделившиеся по комплексу показателей (продуктивность, крупнозерность, стрессоустойчивость, генетическая гибкость), в т. ч. толерантных к меди (№ 3, 5, 6, 7, 9) и к цинку (№ 11, 13).
1. Snakin V.V. Global'noe izmenenie klimata: prognozy i real'nost' // Zhizn' Zemli. 2019. № 2 (41). S. 148–164. DOI: 10.29003/ m649.0514-7468.2019_41_2/121-246.
2. Sergeeva L.E., Bronnikova L.I. Iony tyazhelyh metallov in vitro: novye ideologii dlya polucheniya geneticheski izmenennyh form rasteniy // Vestnik zaschity rasteniy. 2016. № 3 (89). S. 152–153.
3. Rout G.R., Das P. Effect of metal toxicity on plant growth and metabolism: I. Zinc. // Agronomie. 2003. Vol. 23. P. 3–11.
4. Gosudarstvennyy reestr selekcionnyh dostizheniy, dopuschennyh k ispol'zovaniyu. T. 1. Sorta rasteniy. M.: Rosinformagroteh, 2021. 719 s.
5. Barsukova E.N., Klykov A.G., Chaykina E.L. Ispol'zovanie metoda kul'tury tkani dlya sozdaniya novyh form Fagopyrum esculentum Moench // Rossiyskaya sel'skohozyaystvennaya nauka. 2019. № 5. S. 3–6. DOI:https://doi.org/10.31857/S2500-2627201953-6.
6. Ispol'zovanie metodov biotehnologii v selekcii grechihi na Dal'nem Vostoke / E.N. Barsukova [i dr.] // Vestnik DVO RAN. 2020. № 4. S. 58–66. DOI:https://doi.org/10.37102/0869 7698.2020.212.4.010.
7. Zaprometov M.N. Fenol'nye soedineniya: rasprostranenie, metabolizm i funkcii v rasteniyah. M.: Nauka, 1993. 272 s.
8. Goncharenko A.A. Ob adaptivnosti i ekologicheskoy ustoychivosti sortov zernovyh kul'tur // Vestnik Rossel'hozakademii. 2005. № 6. S. 49–53.
9. Dospehov B.A. Metodika polevogo opyta (s osnovami statisticheskoy obrabotki rezul'tatov issledovaniy). 5-e izd., pererab. i dop. M.: Al'yans, 2014. 351 s.
10. Klykov A.G., Barsukova E.N. Biotehnologiya i selekciya grechihi na Dal'nem Vostoke Rossii. Vladivostok: Dal'nauka, 2021. 351 s.
11. Perspektivy i rezul'taty selekcii Fagopyrum esculentum Moench na povyshennoe soderzhanie flavonoidov / A.G. Klykov [i dr.] // Vestnik DVO RAN. 2019. № 3. S. 5–16. DOI:https://doi.org/10.25808/08697698.2019.205.3.001.
12. Breeding Buckwheat for Increased Levels of Rutin, Quercetin and Other Bioactive Compounds with Potential Antiviral Effects / Z. Luthar [et al.] // Plants. 2020.9(12):1638. DOI:https://doi.org/10.3390/plants9121638.
13. Osobennosti obrazovaniya fenol'nyh soedineniy v prorostkah grechihi (Fagopyrum esculentum Moench) razlichnyh sortov / V.V. Kazanceva [i dr.] // Sel'skohozyaystvennaya biologiya. 2015. T. 50, № 5. S. 611–619. DOI:https://doi.org/10.15389/agrobiology.2015.5.611rus.
14. Diagnostika ustoychivosti rasteniy k stressovym vozdeystviyam: metod. rukovodstvo. L.: VIR, 1988. 226 s.
