Владивосток, Приморский край, Россия
Цель исследования – получение на селективных средах в культуре in vitro стрессоустойчивых растений-регенерантов гречихи и отбор в полевых условиях образцов с улучшенными селекционными характеристиками. Объект исследования – сорта Китавасесоба (Япония), Изумруд (Россия), гибрид Изумруд × Китавасесоба. Исследование по получению растений-регенерантов гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Moench) проведено на базе лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки. Микрочеренки и каллус гречихи культивировали в течение 25 дней на селективных средах с минеральной основой по Мурасиге и Скугу (МС) без добавления гормонов, дополненных, в зависимости от варианта опыта: сульфатом цинка – 202, 404, 606 мг/л или сульфатом меди – 23, 46, 69, 161, 184 мг/л. Контроль – безгормональная среда МС, содержащая 0,025 мг/л сернокислой меди и 8,6 мг/л сернокислого цинка. Микрочеренки растений гречихи сорта Изумруд пассировали на среды с содержанием салициловой кислоты (СК) в культуре in vitro 6,9; 13,8; 20,7; 27,6 мг/л в течение 24 ч, 48 ч и 24 сут. Накопление рутина возросло на 33,6 % по сравнению с контролем после культивирования микропобегов гречихи сорта Изумруд в условиях in vitro на среде с повышенным содержанием сульфата меди (161 мг/л). В последующих поколениях у растений, выращиваемых в селекционном питомнике, повышенный биосинтез рутина сохранился. Кратковременное воздействие в течение 2 сут салициловой кислотой (6,9 и 13,8 мг/л) на ткани микропобегов способствовало увеличению содержания рутина в растениях-регенерантах на 91,8 и 69,2 % соответственно. Изучение в полевых условиях селекционного питомника семенного потомства 11 регенерантных линий, толерантных к ионам меди и цинка, позволило отобрать 5 перспективных линий, выделившихся по комплексу ценных признаков (продуктивность, крупнозерность, стрессоустойчивость, генетическая гибкость).
гречиха посевная, селекция in vitro, селективная среда, сульфат меди, сульфат цинка, салициловая кислота, растения-регенеранты, рутин, селекционный питомник
Введение. В связи с глобальным ухудшением климата планеты, которое происходит в последние десятилетия, важнейшей проблемой современного растениеводства и селекции является повышение устойчивости растений к абиотическим и биотическим стрессам [1]. Создание сортов, устойчивых к экологическим факторам среды, лимитирующим формирование потенциально возможной продуктивности, особенно актуально для Приморского края, как региона с муссонным климатом.
Для получения форм растений с повышенным уровнем стрессоустойчивости успешно используют новые биотехнологические подходы. Система in vitro является комплексным фактором, влияющим на генетическую программу растений. Получение клеточных культур из различных частей растения с использованием летальных доз ионов тяжелых металлов, манипуляции с ними могут служить базисом для последующего отбора вариантов с качественно новыми показателями [2, 3].
В ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки работа с применением в качестве селективного фактора тяжелых металлов при культивировании гречихи in vitro проводится с 2006 г. За это время получено более 60 образцов гречихи, толерантных к тяжелым металлам. В 2021 г. новый сорт гречихи Уссурочка, созданный при использовании в селекционном процессе толерантной к меди регенерантной линии, включен в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию по Дальневосточному региону [4].
Цель исследования – получение на селективных средах в культуре in vitro стрессоустойчивых растений-регенерантов гречихи и отбор в полевых условиях образцов с улучшенными селекционными характеристиками.
Объекты и методы. Исследование по получению растений-регенерантов гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Moench) проведено на базе лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки по ранее описанной методике [5, 6]. Объектом исследования служили сорта: Китавасесоба (Япония), Изумруд (Россия), гибрид Изумруд × Китавасесоба. Микрочеренки и каллус гречихи культивировали в течение 25 дней на селективных средах с минеральной основой по Мурасиге и Скугу (МС) без добавления гормонов, дополненных (в зависимости от варианта опыта): сульфатом цинка – 101, 404, 606 мг/л или сульфатом меди – 23, 46, 69, 161, 184 мг/л. Контроль – безгормональная среда МС, содержащая 0,025 мг/л сернокислой меди и 8,6 мг/л сернокислого цинка. Микрочеренки растений гречихи сорта Изумруд пассировали на среды с содержанием салициловой кислоты (СК) в культуре in vitro 6,9; 13,8; 20,7; 27,6 мг/л в течение 24 ч, 48 ч и 24 сут.
Пробирочные растения выращивали в контролируемых условиях световой комнаты при 16-часовом дне, температуре 23 °С, освещенности 4 тыс. лк. Растения-регенеранты (R0) высаживали в почву, размноженное семенное потомство регенерантов (R1 и далее) изучали в полевых условиях селекционного питомника (СП). Содержание рутина в растительных пробах определяли по М.Н. Запрометову [7] в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН. Адаптивные свойства селекционных образцов, толерантных к ионам тяжелых металлов, по признаку семенной продуктивности оценивали по параметрам стрессоустойчивости, генетической гибкости [8]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по методике Б.А. Доспехова [9].
Результаты и их обсуждение. В настоящее время в мировой и российской селекции гречихи актуальным направлением является выведение сортов с повышенным содержанием рутина [10–12]. Способность к повышенному синтезу фенольных соединений может служить критерием высокой устойчивости растений к действию стрессовых факторов [11, 13]. Отбор форм гречихи с повышенным содержанием флавоноидов способствует выведению адаптивных сортов, устойчивых к разнообразным стрессовым факторам внешней среды. В процессе эксперимента выявлен определенный токсический эффект солей меди и цинка в повышенных концентрациях, который привел к снижению регенерационной способности растений гречихи в культуре in vitro. Салициловая кислота индуцировала ранний переход растений-регенерантов к цветению. Все это затрудняло микроклональное размножение и дальнейшее изучение полученного опытного материала в полном объеме.
Биохимический анализ показал, что в контрольных растениях сорта Изумруд в культуре in vitro содержание рутина составляло 1,46 %, значение данного показателя в микрорастениях после обработки салициловой кислотой (СК) варьировало от 1,14 до 2,8 % (табл. 1).
Таблица 1
Содержание рутина в растительных образцах растений-регенерантов гречихи
сорта Изумруд, полученных в результате воздействия различных селективных агентов
в культуре in vitro
|
Селективный агент |
Содержание селективного агента в культуральной среде, мг/л |
Период культивирования |
Содержание рутина, % |
|
|
сут |
ч |
|||
|
Контроль |
0 |
25 |
– |
1,46 ± 0,1 |
|
ZnS04 · 7H2O |
404,0 |
25 |
– |
1,52 ± 0,1 |
|
606,0 |
25 |
– |
1,69 ± 0,1 |
|
|
CuS04 · 5H2O |
161,0 |
25 |
– |
1,95 ± 0,1* |
|
184,0 |
25 |
– |
1,14 ± 0,0 |
|
|
Салициловая кислота |
6,9 |
24 |
– |
2,21± 0,1* |
|
20,7 |
24 |
– |
1, 23 ± 0,0 |
|
|
13,8 |
– |
24 |
2,10 ± 0,2* |
|
|
27,6 |
– |
24 |
1,69 ± 0,1 |
|
|
20,7 |
– |
48 |
1,55 ± 0,1 |
|
|
6,9 |
– |
48 |
2,8 ± 0,1** |
|
|
13,8 |
– |
48 |
2,47 ± 0,1** |
|
|
|
|
|
|
1,82 ± 0,14 |
|
НСР05 |
|
|
|
0,42 |
Здесь и далее: 
– среднее значение параметра; S
– ошибка среднего значения параметра; (*) – различия достоверны в сравнении с контролем; (**) – различия достоверны со средней по опыту и контролем при Р < 0,05.
Максимальное содержание рутина (2,8 %) отмечено у растений сорта Изумруд, микропобеги которых культивировали в течение 2 сут на среде с содержанием СК 6,9 мг/л. При увеличении концентрации СК до 13,8 мг/л накопление рутина в растениях in vitro уменьшилось и составило 2,47 %. Длительная обработка в течение 24 сут и высокая концентрация СК в питательной среде (20,7 мг/л) отрицательно повлияли на биосинтезе рутина: происходило снижение его в растительных тканях до 1,23 %, что ниже, чем в контрольных растениях.
При воздействии сульфата меди в дозе 161 мг/л на микропобеги сорта Изумруд в условиях in vitro отмечено максимальное содержание рутина (1,95 %), на 33,6 % больше, чем в контроле. В полевых условиях наибольшее содержание рутина также наблюдалось в растениях гречихи сорта Изумруд, полученных при воздействии высоких концентраций сульфата меди (184 и 161 мг/л) – 3,93 и 3,84 % соответственно, при содержании в контроле – 3,19 %.
В полевых условиях селекционного питомника в течение трех лет (2019–2021 гг.) оценивали семенное потомство 11 регенерантных линий, полученных в результате регенерации из каллуса и микропобегов на средах с высоким содержанием ионов меди и цинка (табл. 2). Превышение показателя продуктивность семян по сравнению с исходными формами и сортом стандартом Изумруд отмечено у растений семи линий, толерантных к меди (№ 3–9) и двух к цинку – № 11, № 13. Регенерантные линии гречихи характеризовались крупнозерностью, масса 1000 зерен составляла 32,0–39,1 г при низкой вариабельности данного показателя (V = 6,2 %). Исходную форму по данному признаку превысили три линии, полученные на селективной среде с ионами меди (№ 3–5) и одна – с ионами цинка (№ 13).
Таблица 2
Селекционные показатели образцов гречихи, полученных при воздействии
высоких концентраций меди и цинка в питательной среде в культуре in vitro
(СП, 2019–2021 гг.)
|
Номер линии |
Сорт, регенерантная линия
|
Концентрация сульфата меди (цинка), мг/л |
Продуктивность семян с 1-го растения, г |
Стрессоустойчивость У2 – У1 |
Генетическая гибкость (У2+У1)/2 |
Масса 1000 зерен, г |
||
|
|
У2 (min) |
У1 (max) |
||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
1 |
Изумруд (стандарт) |
0 |
4,8±0,9 |
3,1 |
6,2 |
–3,1 |
4,7 |
35,8±1,1 |
|
2 |
Китавасесоба (исходный сорт) |
0 |
5,3±0,6 |
4,1 |
6,2 |
–2,1 |
5,2 |
33,1±1,1 |
|
3 |
Изумруд × Китавасесоба 1 Сu+2 (МП) |
11,5 |
6,1±1,0** |
4,1 |
7,7 |
–3,6 |
5,9 |
39,1±1,5** |
|
4 |
Изумруд × Китавасесоба 10 Сu+2 (МП) |
115,0 |
5,4±0,9* |
4,0 |
6,9 |
–2,9 |
5,5 |
35,4±1,4** |
|
5 |
Изумруд × Китавасесоба 14 Сu+2 (МП) |
161,0 |
5,8±1,0* |
4,4 |
7,9 |
–3,5 |
6,2 |
35,8±1,2** |
|
6 |
Изумруд × Китавасесоба 16 Сu+2 (МП) |
184,0 |
6,2±1,2** |
3,8 |
7,9 |
–4,1 |
5,9 |
34,07±1,9 |
Окончание табл. 2
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
7 |
Китавасесоба 4 Сu+2 + колхицин 48 ч (МП) |
46,0 |
5,9±0,3** |
5,6 |
6,6 |
–1,0 |
6,1 |
33,2±1,8 |
|
8 |
Китавасесоба R 29 Сu+2 (К) |
69,0 |
5,8±1,0* |
3,7 |
7,1 |
–3,4 |
5,4 |
32,0±2,3 |
|
9 |
Китавасесоба R 30 Сu+2 (К) |
69,0 |
7,1±0,7** |
6,5 |
7,8 |
–1,3 |
7,2 |
34,8±2,4 |
|
10 |
Китавасесоба R 62 Сu+2 (К) |
69,0 |
5,3±1,0 |
3,5 |
7,0 |
–3,5 |
5,3 |
31,9±2,3 |
|
11 |
Китавасесоба 1 Zn+2 (МП) |
101,0 |
5,6±0,5* |
4,9 |
6,6 |
–1,7 |
5,8 |
34,9±2,2 |
|
12 |
Китавасесоба 4 Zn+2 (МП) |
404,0 |
4,8±0,9 |
3,9 |
5,7 |
–1,8 |
4,8 |
36,5±4,9 |
|
13 |
Китавасесоба 6 Zn+2 (МП) |
606,0 |
5,6±1,3* |
3,1 |
7,5 |
–4,4 |
5,3 |
38,2±2,1** |
|
V, % |
|
10,8 |
|
|
|
|
6,2 |
|
|
НСР05 |
|
0,52 |
|
|
|
|
1,87 |
|
Примечание: (*) – различия достоверны со стандартом, (**) с исходной формой при Р < 0,05; МП – образец получен в результате регенерации из микропобега, К – каллуса.
Уровень устойчивости к стрессам является генетически контролируемым и наследуемым признаком, который проявляется, когда растения оказываются под действием экстремального фактора [14]. Высокую устойчивость к стрессу показали линии № 7, 9. Средняя урожайность сортов в контрастных (стрессовых и нестрессовых) условиях (У1 +У2 /2) характеризует их генетическую гибкость. Максимальные соотношения между генотипом и факторами среды отмечены у регенерантов № 9 (7,2 г), № 5 (6,2 г), № 7 (6,1 г), а также № 3, 6 (5,9 г).
Заключение. В результате исследования установлено, что культивирование микропобегов in vitro на среде с салициловой кислотой в концентрации 6,9; 13,8 мг/л в течение 48 ч и сульфата меди в концентрации 161, 184 мг/л способствует повышенному накоплению рутина в надземной части растений гречихи. Для дальнейшей селекции отобрано семь перспективных регенерантных линий, выделившиеся по комплексу показателей (продуктивность, крупнозерность, стрессоустойчивость, генетическая гибкость), в т. ч. толерантных к меди (№ 3, 5, 6, 7, 9) и к цинку (№ 11, 13).
1. Снакин В.В. Глобальное изменение климата: прогнозы и реальность // Жизнь Земли. 2019. № 2 (41). С. 148–164. DOI: 10.29003/ m649.0514-7468.2019_41_2/121-246.
2. Сергеева Л.Е., Бронникова Л.И. Ионы тяжелых металлов in vitro: новые идеологии для получения генетически измененных форм растений // Вестник защиты растений. 2016. № 3 (89). С. 152–153.
3. Rout G.R., Das P. Effect of metal toxicity on plant growth and metabolism: I. Zinc. // Agronomie. 2003. Vol. 23. P. 3–11.
4. Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию. Т. 1. Сорта растений. М.: Росинформагротех, 2021. 719 с.
5. Барсукова Е.Н., Клыков А.Г., Чайкина Е.Л. Использование метода культуры ткани для создания новых форм Fagopyrum esculentum Moench // Российская сельскохозяйственная наука. 2019. № 5. С. 3–6. DOI:https://doi.org/10.31857/S2500-2627201953-6.
6. Использование методов биотехнологии в селекции гречихи на Дальнем Востоке / Е.Н. Барсукова [и др.] // Вестник ДВО РАН. 2020. № 4. С. 58–66. DOI:https://doi.org/10.37102/0869 7698.2020.212.4.010.
7. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993. 272 с.
8. Гончаренко А.А. Об адаптивности и экологической устойчивости сортов зерновых культур // Вестник Россельхозакадемии. 2005. № 6. С. 49–53.
9. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). 5-е изд., перераб. и доп. М.: Альянс, 2014. 351 с.
10. Клыков А.Г., Барсукова Е.Н. Биотехнология и селекция гречихи на Дальнем Востоке России. Владивосток: Дальнаука, 2021. 351 с.
11. Перспективы и результаты селекции Fagopyrum esculentum Moench на повышенное содержание флавоноидов / А.Г. Клыков [и др.] // Вестник ДВО РАН. 2019. № 3. С. 5–16. DOI:https://doi.org/10.25808/08697698.2019.205.3.001.
12. Breeding Buckwheat for Increased Levels of Rutin, Quercetin and Other Bioactive Compounds with Potential Antiviral Effects / Z. Luthar [et al.] // Plants. 2020.9(12):1638. DOI:https://doi.org/10.3390/plants9121638.
13. Особенности образования фенольных соединений в проростках гречихи (Fagopyrum esculentum Moench) различных сортов / В.В. Казанцева [и др.] // Сельскохозяйственная биология. 2015. Т. 50, № 5. С. 611–619. DOI:https://doi.org/10.15389/agrobiology.2015.5.611rus.
14. Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям: метод. руководство. Л.: ВИР, 1988. 226 с.
