Russian Federation
The purpose of research is to study the effect of a biologically active composition of microbial origin (BACMO) “Symbion-D” on the microbial composition of the intestine and the immunity of calves with dyspepsia. The studies were carried out on calves of the Holstein breed of the neonatal period, belonging to the Federal State Unitary Enterprise Omskoye. The criteria for inclusion in the experimental group of animals was the clinical sign "diarrhea". The calves of the experimental group were fed BACMO “Symbion-D” daily for 5–7 days individually, depending on the weight of the calf and the severity of the disease. To study the microbial composition of the intestines, fecal samples were taken from three animals, and the immune status was taken from five animals randomly from each experimental group. It was established that BACMO “Symbion-D” contributes to the reduction of microorganisms of the genus Staphylococcus epidermidis from 1×105 to 1×103 CFU/g and the genus Proteus spp. up to 103 CFU/g. The content of microorganisms of the genus Lactobacillus spp. increased from ×105 to ×108 CFU/g. When assessing the immune status of sick calves against the background of the use of BACMO “Symbion-D”, a significant increase in the number of lymphocytes by 15 % (p≤0.05) compared with the background values and T-lymphocytes by 52 % was recorded, which indicates the activation of immune cells, as well as a decrease in the number of cytotoxic T-lymphocytes in the blood by 20 % relative to background indicators. In addition, “Symbion-D” activated the functional activity of leukocytes, as evidenced by an increase in the level of lysosomal cationic proteins by 7 %. A significant trend towards a decrease in spontaneous NBT activity and an increase in the functional reserve of neutrophils indicates a decrease in the antigenic load on the body of calves.
probiotic, prebiotic, symbiotic, calves, dyspepsia, immunity, microbiome
Введение. Известно, что из всех биотопов животного наиболее представительна микробиота желудочно-кишечного тракта, важная роль которой состоит в поддержании высокого физиологического и иммунного статуса [1]. Будучи стерильным внутриутробно [2, 3], рубец новорожденного теленка подвергается быстрой колонизации микроорганизмами во время родов и после рождения от матери [4] и источников окружающей среды [5]. После первоначальной колонизации в недоразвитом рубце телят уже на третий день жизни регистрируют группы микроорганизмов, критически важных для ферментации поступающего корма. С возрастом, по мере увеличения потребления твердых кормов, микробиота рубца у молодых жвачных приобретает состав, свойственный взрослому животному [6].
В физиологическом формировании микробиоценоза кишечника новорожденного теленка определяющую роль играет молозиво. Это единственный источник иммуноглобулинов у новорожденных телят, следовательно, их иммунной защиты [7]. Иммунитет коров-матерей, передающийся потомству с антителами через молозиво, имеет тенденцию к быстрому снижению, что приводит к высокой заболеваемости телят различными болезнями при нарушении зоогигиенических условий их содержания [8]. Интенсивный характер современных технологий выращивания сельскохозяйственных животных и птицы зачастую оказывает негативное влияние на микроэкологию желудочно-кишечного тракта, обусловленную различными этиологическими агентами [9]. Традиционно желудочно-кишечные болезни относят к незаразной патологии. Однако, по данным ряда исследований последних лет, убедительно доказывается доминирующая роль инфекционных агентов в этиологии и патогенезе кишечных заболеваний телят, среди которых энтеропатогенные штаммы кишечной палочки, протей, сальмонелла, пастерелла, ротавирус, коронавирус и другие возбудители [10–12]. Сегодня стратегия лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта телят с применением только антибактериальных препаратов признана малоэффективной и небезопасной. В связи с этим одним из современных подходов к решению проблемы является разработка и изучение новых эффективных и экологически безопасных препаратов природного происхождения [13].
Цель исследований – изучение влияния биологически активной композиции микробного происхождения (БАКМП) «Симбион-Д» на микробный состав кишечника и иммунитет телят при диспепсии.
Задачи: определить микробный состав кишечника новорожденных телят до и после применения БАКМП «Симбион-Д»; оценить иммунный статус новорожденных телят до и после применения БАКМП «Симбион-Д».
Объекты и методы. Объекты исследований: телята возраста до 14 дней, венозная кровь, фекалии, экспериментальный образец БАКМП «Симбион-Д».
Исследования проведены на базе кафедры болезней продуктивных животных (кафедра на производстве) на телятах периода новорожденности голштинской породы до 14 сут, рожденных в осенний период времени и принадлежащих ФГУП «Омское». После рождения телят помещают в телятник в клетки группами по 10 голов на глубокую соломенную подстилку. Молозиво выпаивают в течение часа после рождения в объеме от 0,5 до 4 л из ведра для поения с соской и клапаном. Регистрировали случаи задержки выпаивания молозива телятам более трех часов с момента их рождения. Со второго дня жизни телятам выпаивают пастеризованное молоко согласно норме потребления. Начиная только с 3–4-й недели жизни в кормушки телятам добавляют концентраты и сено. Водопой осуществляется водопроводной водой из корыт.
В контрольную группу животных были отобраны телята без признаков диареи (n = 5), находящиеся под ежедневным клиническим наблюдением. Критерием включения в опытную группу телят был клинический признак «диарея» (n=60). Телятам опытной группы ежедневно, в течение 5–7 дней, выпаивали БАКМП «Симбион-Д» в дозе 20–30 мл на голову индивидуально в зависимости от массы теленка и тяжести заболевания. БАКМП «Симбион-Д» является продуктом метаболизма уксуснокислых бактерий и дрожжей в комплексе с полисахаридом и представляет собой опалесцирующую жидкость светло-коричневого цвета, от слабовязкой до вязкой консистенции, кисло-сладкого вкуса, для внутреннего применения.
Для изучения кишечной микробиоты животных пробы отбирали из прямой кишки от трех голов, а иммунного статуса – от пяти голов из каждой экспериментальной группы. Пробы были получены в начале эксперимента (фон) и после курса применения БАКМП «Симбион-Д» (через 7 сут). Исследования микробного состава кишечника проводили в БУ «Омская областная ветеринарная лаборатория». В пробах определяли качественный и количественный состав микрофлоры методом разведения и посевом на элективные питательные среды. Идентификацию выделенных культур микроорганизмов проводили, используя определитель зоопатогенных микроорганизмов [14].
Оценку неспецифической резистентности молодняка крупного рогатого скота проводили с помощью методов оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов в отделе ветеринарии Омского аграрного научного центра. С этой целью определяли в периферической крови телят концентрацию Т-, В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) – методом осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 6 000 по Ю. А. Гриневич и А.Н. Алферову [15]. Лизосомально-катионные белки (ЛКБ) – по методу М. Г. Шубича с бромфеноловым синим, активность миелопероксидазы – по методу Грэхем-Кнолля с использованием бензидина. Также оценивали кислородпродуцирующую активность нейтрофилов в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) в спонтанном (НСТсп) и стимулированном (НСТст) вариантах с фотометрической оценкой результата. Дополнительно рассчитывали коэффициент стимуляции (КС=НСТсп/НСТст). Количество лейкоцитов и лейкограмму определяли общепринятыми методами анализа [16].
Для статистической обработки полученных результатов использовали пакет программы STATISTICA 10,0. Для оценки различий между двумя независимыми выборками использовали U-критерий Манна-Уитни, достоверной считали разницу при р < 0,05. Для оценки различий между двумя зависимыми выборками использовали критерий Вилкоксона, достоверной считали разницу при р < 0,05.
Результаты и их обсуждение. Фоновые показатели микробиоты желудочно-кишечного тракта телят представлены в таблице 1.
Таблица 1
Состав микроорганизмов в 1 г фекалий телят до введения «Симбион-Д» (фон)
|
микроорганизма |
Количество микроорганизмов, КОЕ/г |
||||||
|
Контроль |
Опыт |
Норма |
|||||
|
Номер теленка |
|||||||
|
181 |
193 |
199 |
5400 |
5408 |
5410 |
||
|
Escherichia coli |
1,3·106 |
4,8·104 |
5,7·106 |
9·105 |
1,4·108 |
1·105 |
106–107 |
|
Staphylococcus epidermidis |
> 1·105 |
1·103 |
1·103 |
1·103 |
>1·105 |
>1·105 |
До 103 |
|
Proteus spp. |
– |
1·107 |
– |
1·105 |
– |
1·105 |
До 103 |
|
Candida albicans |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
До 103 |
|
Bifidobacterium spp. |
1010 |
109 |
109 |
1010 |
1010 |
109 |
107–109 |
|
108 |
< 105 |
< 105 |
< 105 |
< 105 |
< 105 |
106–107 |
|
|
Итого показателей отклонения от нормы |
6 |
9 |
– |
||||
Здесь и далее: «–» – отсутствие роста.
Анализ результатов свидетельствует о том, что у пяти телят обеих экспериментальных групп отмечали низкое содержание молочнокислых микроорганизмов рода Lactobacillus spp. Только у одного теленка контрольной группы количество микроорганизмов было на уровне нормальных разведений. При этом количество микроорганизмов рода Bifidobacterium spp. у здоровых и больных телят было на уровне физиологических показателей. У двух больных телят из трех были выделены микроорганизмы рода Proteus spp. выше допустимых значений. В контрольной группе были выделены микроорганизмы рода Proteus spp. в разведении 1·107 КОЕ/г только у одного теленка. У всех телят опытной и контрольной групп отмечали увеличение количества условно-патогенной микрофлоры, а именно Staphylococcus epidermidis от 1·103 КОЕ/г и более 1·105 КОЕ/г. Однако увеличение количества микроорганизмов рода Escherichia coli регистрировали только у одного теленка опытной группы.
Таким образом, у здоровых телят отклонение от физиологической нормы наблюдали по девяти микробиологическим показателям.
Результаты исследования кишечного микробиома телят через 7 сут представлены в таблице 2.
Таблица 2
Состав микроорганизмов в 1 г фекалий телят после введения «Симбион-Д» (через 7 сут)
|
Выделенная культура |
Количество микроорганизмов, КОЕ/г |
||||||
|
Контроль |
Опыт |
Норма |
|||||
|
Номер теленка |
|||||||
|
181 |
193 |
199 |
5400 |
5408 |
5410 |
||
|
Escherichia coli |
7,2·102 |
2·108 |
1·105 |
1,3·106 |
1,6·108 |
2,2·106 |
106–107 |
|
Staphylococcus epidermidis |
1·103 |
1·103 |
< 1·103 |
1·103 |
< 1·103 |
1·103 |
До 103 |
|
Proteus spp. |
– |
– |
– |
– |
– |
1·105 |
До 103 |
|
Candida albicans |
1·103 |
1·103 |
– |
– |
1·103 |
– |
До 103 |
|
Bifidobacterium spp. |
1010 |
109 |
109 |
1010 |
109 |
1010 |
107–109 |
|
Lactobacillus spp. |
108 |
< 105 |
< 105 |
< 105 |
< 105 |
108 |
106–107 |
|
Итого показателей отклонения от нормы |
7 |
7 |
– |
||||
Анализ результатов микробиологических исследований телят опытной и контрольной групп показал, что через 7 сут количество молочнокислых бактерий рода Lactobacillus spp. преимущественно не изменяется. Только у одного теленка опытной группы регистрировали увеличение количества микроорганизмов до ×108 КОЕ/г. Содержание Bifidobacterium spp. в контрольной и опытной группах осталось без изменений. Следует подчеркнуть, что у двух телят контрольной группы из трех были зарегистрированы микроорганизмы Candida albicans (1·103 КОЕ/г). На фоне применения испытуемого симбиотика дрожжеподобные грибы были обнаружены только у одного теленка. У одного теленка опытной группы количество микроорганизмов рода Proteus spp. уменьшилось, а у одного осталось на прежнем уровне (1·105 КОЕ/г). В контрольной и опытной группах были зарегистрированы случаи снижения количества Staphylococcus epidermidis с 1·105 до 1·103 КОЕ/г. У одного теленка контрольной группы отмечали увеличение содержания Escherichia coli до 2·108 КОЕ/г. Пероральное применение БАКМП «Симбион-Д» в течение семи дней больным телятам не оказывало влияния на содержание Escherichia coli.
Таким образом, через неделю после начала эксперимента у здоровых телят регистрировали увеличение числа показателей отклонения от нормальных значений до семи. Ежедневное применение БАКМП «Симбион-Д» в дозе 20–30 мл/гол. больным диспепсией телятам способствовало снижению числа микробиологических показателей отклонений от физиологической нормы с 9 до 7.
Результаты иммунологических исследований крови телят экспериментальных групп представлены в таблице 3 в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего значения (М ± sem).
Таблица 3
Анализ показателей естественной резистентности организма телят
при применении БАКМП «Симбион-Д»
|
Показатель |
Фон |
Через 7 дней |
Фон |
Через 7 дней |
|
Группа |
Контроль |
Опыт |
||
|
Лейкоциты, тыс/мкл |
8,8±0,85 |
8,18±0,64** |
7,6±2,03 |
7,08±1,4 |
|
Лимфоциты, % |
56,6±13,45 |
55,2±10,99 |
39,6±14,19 |
48,4±6,84 |
|
Лимфоциты, тыс/мкл |
4,94±1,15 |
4,47±0,65 |
2,94±0,96* |
3,37±0,42 |
|
Нейтрофилы, % |
41,6±13,81 |
43,8±10,73 |
59,6±14,54 |
50,2±7,98 |
|
Т-лимфоциты, % |
15,6±1,95 |
14,4±2,7 |
23,0±7,52* |
29,4±1,95* |
|
Т-лимфоциты, тыс/мкл |
0,78±0,23 |
0,65±0,2** |
0,7±0,36 |
0,99±0,15* |
|
В-лимфоциты, % |
33,4±6,91 |
26,6±4,56** |
41,2±7,29 |
29,8±4,76 |
|
В-лимфоциты, тыс/мкл |
1,65±0,55 |
1,17±0,17** |
1,24±0,51 |
1,0±0,21 |
|
Цитотоксические Т-лимфоциты, % |
31,8±7,01 |
26,6±6,58 |
47,6±6,58* |
38,0±2,92*** |
|
Цитотоксические Т-лимфоциты, тыс/мкл |
1,59±0,6 |
1,18±0,31 |
1,36±0,35 |
1,29±0,24 |
|
ЛКБ-тест, у.е. |
2,01±0,24 |
1,95±0,06 |
2,09±0,36 |
2,24±0,1** |
|
Спонтанный НСТ-тест ,у.е.оп.пл |
0,18±0,09 |
0,24±0,07 |
0,13±0,06 |
0,12±0,02* |
|
А/ген НСТ-тест ,у.е.оп.пл |
0,16±0,05 |
0,29±0,11 |
0,11±0,01* |
0,4±0,16** |
|
К ст. НСТ |
0,92±0,17 |
1,3±0,52 |
0,91±0,28 |
3,44±1,47*** |
|
ЦИК, у.е. |
25,0±8,06 |
22,8±4,92 |
20,8±4,87 |
25,0±4,18 |
Примечание: * – уровень значимости по отношению к группе контроля; ** – уровень значимости в сравнении с фоновыми показателями; *** – уровень значимости по отношению к фоновым показателям и показателям контрольной группы
У телят контрольной группы (здоровые телята) среднее количество лейкоцитов в крови было выше на 16 %, чем у телят опытной группы. При этом курсовое введение симбиотика не оказывало влияния на их содержание через 7 сут. Абсолютное число лимфоцитов у телят опытной группы перед началом лечения было достоверно снижено на 40 % (р ≤ 0,05) по сравнению с аналогичным показателем крови телят контрольной группы. Через 7 сут ежедневного применения БАКМП «Симбион-Д» отмечали тенденцию к повышению абсолютного количества лимфоцитов на 15 % по сравнению с фоновыми показателями. Аналогичную закономерность отмечали при анализе относительного содержания лимфоцитов у телят опытной группы. У телят контрольной группы через 7 сут после начала эксперимента отмечали снижение числа Т-лимфоцитов на 17 %.
У телят опытной группы, наоборот, регистрировали достоверное повышение данного показателя на 52 % (р ≤ 0,05) по сравнению с группой контроля. Фоновое относительное количество цитотоксических Т-лимфоцитов у телят опытной группы было достоверно выше на 50 % (р ≤ 0,05) по сравнению с показателем группы контроля. Пероральное применение БАКМП «Симбион-Д» в течение семи дней способствовало достоверному снижению данного показателя на 20 % (р≤0,05) по сравнению с фоном. Абсолютные значения концентрации цитотоксических Т-лимфоцитов не имели статистически значимой разницы между экспериментальными группами. Подобную закономерность регистрировали при анализе содержания абсолютного количества В-лимфоцитов в крови телят обеих экспериментальных групп. Относительное количество В-лимфоцитов в течение экспериментального периода имело тенденцию к понижению у телят контрольной группы на 20 % и телят опытной группы на 28 %. Относительное количество нейтрофилов у телят экспериментальных групп не имело статистически значимой разницы.
При анализе показателя ЛКБ-теста у телят контрольной группы достоверно значимой разницы между показателями фона и через семь дней после начала эксперимента установлено не было. Пероральное введение исследуемого симбиотика в течение семи дней способствовало повышению данного показателя на 7 % по сравнению с фоновыми показателями и на 14 % по сравнению с группой контроля. У больных телят отмечали снижение показателя спонтанного НСТ-теста на 28 % по сравнению с аналогичным показателем группы контроля. Показатель антигенной стимуляции нейтрофилов у телят на фоне введения БАКМП «Симбион-Д» достоверно повышается более чем в 2 раза (р ≤ 0,05). Уровень циркулирующих иммунных комплексов не имел достоверно значимой разницы между группами.
Заключение. Таким образом, ежедневное пероральное введение в течение 7 сут БАКМП «Симбион-Д» в дозе 20–30 мл на голову телятам при токсической форме диспепсии способствует нормализации кишечного микробиома, стимуляции Т-клеточного иммунитета и активации показателей неспецифической резистентности.
1. Bovkun G.F., Malik N.I. Harakteristika mikrobiocenoza kishechnika pri dispepsiyah u telyat // Probiotiki, prebiotiki, sinbiotiki i funkcional'nye produkty pitaniya. Fundamental'nye i klinicheskie aspekty: mat-ly mezhdunar. kongressa. SPb., 2007. 23 s.
2. Malmuthuge N., Griebel P.J. Fetal environment and fetal intestine are sterile during the third trimester of pregnancy // Vet. Immunol. Immunopathol. 2018. 204, 59–64. DOI: 10.1016/ j.vetimm.2018.09.005.
3. The composition of the microbiota in the full-term fetal gut and amniotic fluid: A bovine cesarean section study / A. Husso [et al.] // Front. Microbiol. 2021. 12:626421. DOI:https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.626421.
4. Biogeographical differences in the influence of maternal microbial sources on the early successional development of the bovine neonatal gastrointestinal tract / C.J. Yeoman [et al.] // Sci. Rep. 2018. 8, 1–14. DOI: 10.1038/ s41598-018-21440-8.
5. Curtis T.P., Sloan W.T. Prokaryotic diversity and its limits: microbial community structure in nature and implications for microbial ecology // Curr. Opin. Microbiol. 2004. 7, 221–226. DOI:https://doi.org/10.1016/j.mib.2004.04.010.
6. Changes in metabolically active bacterial community during rumen development, and their alteration by rhubarb root powder revealed by 16S rRNA amplicon sequencing / Z. Wang [et al.] // Front Microbiol. 2017. 8:159. DOI:https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00159.
7. Malashko V.V. Molozivo. Immunoglobuliny moloziva. Kachestvo i normy skarmlivaniya moloziva novorozhdennym telyatam: nauchno-prakticheskie i metodicheskie rekomendacii dlya slushateley FPK, studentov fakul'teta veterinarnoy mediciny ochnoy i zaochnoy form obucheniya i NISPO. Grodno: Grodnenskiy GAU, 2010. 98 s.
8. Andreeva A.V., Kadyrova D.V. Immunnyy status, estestvennyy mikrobiocenoz kishechnika novorozhdennyh telyat i metody ih korrekcii: monografiya. Ufa: Bashkirskiy GAU, 2012. 152 s.
9. Ekobiotehnologicheskie preparaty dlya agropromyshlennogo kompleksa Rossii / E.E. Shkol'nikov [i dr.] // Vestnik Kazanskogo tehnologicheskogo universiteta. 2014. T. 17, № 13. S. 255–263.
10. Antonova G.N., Lenchenko E.M. Izuchenie vidovogo sostava i chuvstvitel'nosti k antibiotikam bakteriy, vydelennyh pri disbakteriozah kishechnika molodnyaka sel'skohozyaystvennyh zhivotnyh // Razrabotka innovacionnyh instrumental'nyh metodov issledovaniya vnutrennih bolezney zhivotnyh. M.: MGUPP, 2015. S. 19–23.
11. Konischeva A.S., V.I. Pleshakova, Lescheva N.A. Mikrobiom kishechnika telyat pri disbakterioze // Vestnik Omskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2021. № 3 (43). S. 70–77.
12. Arbuzova A.A. Etiologicheskie aspekty vozniknoveniya zheludochno-kishechnyh zabolevaniy telyat rannego postnatal'nogo perioda // Uchenye zapiski Kazanskoy gosudarstvennoy akademii veterinarnoy mediciny im. N.E. Baumana. 2010. № 200. S. 11–17.
13. Sovremennyy podhod k regulyacii bezopasnosti probiotikov / A.N. Panin [i dr.] // Veterinariya. 2011. № 1. S. 41–43.
14. Sidorov M.A., Skorodumov D.I., Fedotov V.B. Opredelitel' zoopatogennyh mikroorganizmov. M.: Kolos, 1995.
15. Grinevich Yu.A., Alferov A.N. Opredelenie immunnyh kompleksov v krovi onkologicheski bol'nyh // Laboratornoe delo. 1981. № 8. S. 493–496.
16. Ocenka immunnogo statusa u krupnogo rogatogo skota pri leykoze: metod. rekomendacii / V.S. Vlasenko [i dr.]. Omsk: VNIIBTZh Rossel'hozakademii, 2010. 30 s.
