Россия
Цель исследования – изучить влияние биологически активной композиции микробного происхождения (БАКМП) «Симбион-Д» на микробный состав кишечника и иммунитет телят при диспепсии. Исследования проведены на телятах голштинской породы периода новорожденности, принадлежащих ФГУП «Омское». Критериями включения в опытную группу животных был клинический признак «диарея». Телятам опытной группы ежедневно, в течение 5–7 дней, выпаивали БАКМП «Симбион-Д» индивидуально, в зависимости от массы теленка и тяжести заболевания. Для изучения микробного состава кишечника пробы фекалий отбирали от трех голов, а иммунного статуса – от пяти голов случайным образом из каждой экспериментальной группы. Установлено, что БАКМП «Симбион-Д» способствует уменьшению микроорганизмов рода Staphylococcus epidermidis с 1×105 до 1×103 КОЕ/г и рода Proteus spp. до 103 КОЕ/г. Содержание микроорганизмов рода Lactobacillus spp. повысилось с ×105 до ×108 КОЕ/г. При оценке иммунного статуса больных телят на фоне применения БАКМП «Симбион-Д» регистрировали достоверное повышение количества лимфоцитов на 15 % (р≤0,05) по сравнению с фоновыми показателями и Т-лимфоцитов на 52 %, что указывает на активацию иммунных клеток, а также снижение в крови числа цитотоксических Т-лимфоцитов на 20 % относительно фоновых показателей. Помимо этого, «Симбион-Д» активизировал функциональную активность лейкоцитов, о чем свидетельствовало увеличение уровня лизосомальных катионных белков на 7 %. Достоверная тенденция к снижению спонтанной НСТ-активности и увеличению функционального резерва нейтрофилов свидетельствует об уменьшении антигенной нагрузки на организм телят.
пробиотик, пребиотик, симбиотик, телята, диспепсия, иммунитет, микробиом
Введение. Известно, что из всех биотопов животного наиболее представительна микробиота желудочно-кишечного тракта, важная роль которой состоит в поддержании высокого физиологического и иммунного статуса [1]. Будучи стерильным внутриутробно [2, 3], рубец новорожденного теленка подвергается быстрой колонизации микроорганизмами во время родов и после рождения от матери [4] и источников окружающей среды [5]. После первоначальной колонизации в недоразвитом рубце телят уже на третий день жизни регистрируют группы микроорганизмов, критически важных для ферментации поступающего корма. С возрастом, по мере увеличения потребления твердых кормов, микробиота рубца у молодых жвачных приобретает состав, свойственный взрослому животному [6].
В физиологическом формировании микробиоценоза кишечника новорожденного теленка определяющую роль играет молозиво. Это единственный источник иммуноглобулинов у новорожденных телят, следовательно, их иммунной защиты [7]. Иммунитет коров-матерей, передающийся потомству с антителами через молозиво, имеет тенденцию к быстрому снижению, что приводит к высокой заболеваемости телят различными болезнями при нарушении зоогигиенических условий их содержания [8]. Интенсивный характер современных технологий выращивания сельскохозяйственных животных и птицы зачастую оказывает негативное влияние на микроэкологию желудочно-кишечного тракта, обусловленную различными этиологическими агентами [9]. Традиционно желудочно-кишечные болезни относят к незаразной патологии. Однако, по данным ряда исследований последних лет, убедительно доказывается доминирующая роль инфекционных агентов в этиологии и патогенезе кишечных заболеваний телят, среди которых энтеропатогенные штаммы кишечной палочки, протей, сальмонелла, пастерелла, ротавирус, коронавирус и другие возбудители [10–12]. Сегодня стратегия лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта телят с применением только антибактериальных препаратов признана малоэффективной и небезопасной. В связи с этим одним из современных подходов к решению проблемы является разработка и изучение новых эффективных и экологически безопасных препаратов природного происхождения [13].
Цель исследований – изучение влияния биологически активной композиции микробного происхождения (БАКМП) «Симбион-Д» на микробный состав кишечника и иммунитет телят при диспепсии.
Задачи: определить микробный состав кишечника новорожденных телят до и после применения БАКМП «Симбион-Д»; оценить иммунный статус новорожденных телят до и после применения БАКМП «Симбион-Д».
Объекты и методы. Объекты исследований: телята возраста до 14 дней, венозная кровь, фекалии, экспериментальный образец БАКМП «Симбион-Д».
Исследования проведены на базе кафедры болезней продуктивных животных (кафедра на производстве) на телятах периода новорожденности голштинской породы до 14 сут, рожденных в осенний период времени и принадлежащих ФГУП «Омское». После рождения телят помещают в телятник в клетки группами по 10 голов на глубокую соломенную подстилку. Молозиво выпаивают в течение часа после рождения в объеме от 0,5 до 4 л из ведра для поения с соской и клапаном. Регистрировали случаи задержки выпаивания молозива телятам более трех часов с момента их рождения. Со второго дня жизни телятам выпаивают пастеризованное молоко согласно норме потребления. Начиная только с 3–4-й недели жизни в кормушки телятам добавляют концентраты и сено. Водопой осуществляется водопроводной водой из корыт.
В контрольную группу животных были отобраны телята без признаков диареи (n = 5), находящиеся под ежедневным клиническим наблюдением. Критерием включения в опытную группу телят был клинический признак «диарея» (n=60). Телятам опытной группы ежедневно, в течение 5–7 дней, выпаивали БАКМП «Симбион-Д» в дозе 20–30 мл на голову индивидуально в зависимости от массы теленка и тяжести заболевания. БАКМП «Симбион-Д» является продуктом метаболизма уксуснокислых бактерий и дрожжей в комплексе с полисахаридом и представляет собой опалесцирующую жидкость светло-коричневого цвета, от слабовязкой до вязкой консистенции, кисло-сладкого вкуса, для внутреннего применения.
Для изучения кишечной микробиоты животных пробы отбирали из прямой кишки от трех голов, а иммунного статуса – от пяти голов из каждой экспериментальной группы. Пробы были получены в начале эксперимента (фон) и после курса применения БАКМП «Симбион-Д» (через 7 сут). Исследования микробного состава кишечника проводили в БУ «Омская областная ветеринарная лаборатория». В пробах определяли качественный и количественный состав микрофлоры методом разведения и посевом на элективные питательные среды. Идентификацию выделенных культур микроорганизмов проводили, используя определитель зоопатогенных микроорганизмов [14].
Оценку неспецифической резистентности молодняка крупного рогатого скота проводили с помощью методов оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов в отделе ветеринарии Омского аграрного научного центра. С этой целью определяли в периферической крови телят концентрацию Т-, В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) – методом осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 6 000 по Ю. А. Гриневич и А.Н. Алферову [15]. Лизосомально-катионные белки (ЛКБ) – по методу М. Г. Шубича с бромфеноловым синим, активность миелопероксидазы – по методу Грэхем-Кнолля с использованием бензидина. Также оценивали кислородпродуцирующую активность нейтрофилов в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) в спонтанном (НСТсп) и стимулированном (НСТст) вариантах с фотометрической оценкой результата. Дополнительно рассчитывали коэффициент стимуляции (КС=НСТсп/НСТст). Количество лейкоцитов и лейкограмму определяли общепринятыми методами анализа [16].
Для статистической обработки полученных результатов использовали пакет программы STATISTICA 10,0. Для оценки различий между двумя независимыми выборками использовали U-критерий Манна-Уитни, достоверной считали разницу при р < 0,05. Для оценки различий между двумя зависимыми выборками использовали критерий Вилкоксона, достоверной считали разницу при р < 0,05.
Результаты и их обсуждение. Фоновые показатели микробиоты желудочно-кишечного тракта телят представлены в таблице 1.
Таблица 1
Состав микроорганизмов в 1 г фекалий телят до введения «Симбион-Д» (фон)
|
микроорганизма |
Количество микроорганизмов, КОЕ/г |
||||||
|
Контроль |
Опыт |
Норма |
|||||
|
Номер теленка |
|||||||
|
181 |
193 |
199 |
5400 |
5408 |
5410 |
||
|
Escherichia coli |
1,3·106 |
4,8·104 |
5,7·106 |
9·105 |
1,4·108 |
1·105 |
106–107 |
|
Staphylococcus epidermidis |
> 1·105 |
1·103 |
1·103 |
1·103 |
>1·105 |
>1·105 |
До 103 |
|
Proteus spp. |
– |
1·107 |
– |
1·105 |
– |
1·105 |
До 103 |
|
Candida albicans |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
До 103 |
|
Bifidobacterium spp. |
1010 |
109 |
109 |
1010 |
1010 |
109 |
107–109 |
|
108 |
< 105 |
< 105 |
< 105 |
< 105 |
< 105 |
106–107 |
|
|
Итого показателей отклонения от нормы |
6 |
9 |
– |
||||
Здесь и далее: «–» – отсутствие роста.
Анализ результатов свидетельствует о том, что у пяти телят обеих экспериментальных групп отмечали низкое содержание молочнокислых микроорганизмов рода Lactobacillus spp. Только у одного теленка контрольной группы количество микроорганизмов было на уровне нормальных разведений. При этом количество микроорганизмов рода Bifidobacterium spp. у здоровых и больных телят было на уровне физиологических показателей. У двух больных телят из трех были выделены микроорганизмы рода Proteus spp. выше допустимых значений. В контрольной группе были выделены микроорганизмы рода Proteus spp. в разведении 1·107 КОЕ/г только у одного теленка. У всех телят опытной и контрольной групп отмечали увеличение количества условно-патогенной микрофлоры, а именно Staphylococcus epidermidis от 1·103 КОЕ/г и более 1·105 КОЕ/г. Однако увеличение количества микроорганизмов рода Escherichia coli регистрировали только у одного теленка опытной группы.
Таким образом, у здоровых телят отклонение от физиологической нормы наблюдали по девяти микробиологическим показателям.
Результаты исследования кишечного микробиома телят через 7 сут представлены в таблице 2.
Таблица 2
Состав микроорганизмов в 1 г фекалий телят после введения «Симбион-Д» (через 7 сут)
|
Выделенная культура |
Количество микроорганизмов, КОЕ/г |
||||||
|
Контроль |
Опыт |
Норма |
|||||
|
Номер теленка |
|||||||
|
181 |
193 |
199 |
5400 |
5408 |
5410 |
||
|
Escherichia coli |
7,2·102 |
2·108 |
1·105 |
1,3·106 |
1,6·108 |
2,2·106 |
106–107 |
|
Staphylococcus epidermidis |
1·103 |
1·103 |
< 1·103 |
1·103 |
< 1·103 |
1·103 |
До 103 |
|
Proteus spp. |
– |
– |
– |
– |
– |
1·105 |
До 103 |
|
Candida albicans |
1·103 |
1·103 |
– |
– |
1·103 |
– |
До 103 |
|
Bifidobacterium spp. |
1010 |
109 |
109 |
1010 |
109 |
1010 |
107–109 |
|
Lactobacillus spp. |
108 |
< 105 |
< 105 |
< 105 |
< 105 |
108 |
106–107 |
|
Итого показателей отклонения от нормы |
7 |
7 |
– |
||||
Анализ результатов микробиологических исследований телят опытной и контрольной групп показал, что через 7 сут количество молочнокислых бактерий рода Lactobacillus spp. преимущественно не изменяется. Только у одного теленка опытной группы регистрировали увеличение количества микроорганизмов до ×108 КОЕ/г. Содержание Bifidobacterium spp. в контрольной и опытной группах осталось без изменений. Следует подчеркнуть, что у двух телят контрольной группы из трех были зарегистрированы микроорганизмы Candida albicans (1·103 КОЕ/г). На фоне применения испытуемого симбиотика дрожжеподобные грибы были обнаружены только у одного теленка. У одного теленка опытной группы количество микроорганизмов рода Proteus spp. уменьшилось, а у одного осталось на прежнем уровне (1·105 КОЕ/г). В контрольной и опытной группах были зарегистрированы случаи снижения количества Staphylococcus epidermidis с 1·105 до 1·103 КОЕ/г. У одного теленка контрольной группы отмечали увеличение содержания Escherichia coli до 2·108 КОЕ/г. Пероральное применение БАКМП «Симбион-Д» в течение семи дней больным телятам не оказывало влияния на содержание Escherichia coli.
Таким образом, через неделю после начала эксперимента у здоровых телят регистрировали увеличение числа показателей отклонения от нормальных значений до семи. Ежедневное применение БАКМП «Симбион-Д» в дозе 20–30 мл/гол. больным диспепсией телятам способствовало снижению числа микробиологических показателей отклонений от физиологической нормы с 9 до 7.
Результаты иммунологических исследований крови телят экспериментальных групп представлены в таблице 3 в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего значения (М ± sem).
Таблица 3
Анализ показателей естественной резистентности организма телят
при применении БАКМП «Симбион-Д»
|
Показатель |
Фон |
Через 7 дней |
Фон |
Через 7 дней |
|
Группа |
Контроль |
Опыт |
||
|
Лейкоциты, тыс/мкл |
8,8±0,85 |
8,18±0,64** |
7,6±2,03 |
7,08±1,4 |
|
Лимфоциты, % |
56,6±13,45 |
55,2±10,99 |
39,6±14,19 |
48,4±6,84 |
|
Лимфоциты, тыс/мкл |
4,94±1,15 |
4,47±0,65 |
2,94±0,96* |
3,37±0,42 |
|
Нейтрофилы, % |
41,6±13,81 |
43,8±10,73 |
59,6±14,54 |
50,2±7,98 |
|
Т-лимфоциты, % |
15,6±1,95 |
14,4±2,7 |
23,0±7,52* |
29,4±1,95* |
|
Т-лимфоциты, тыс/мкл |
0,78±0,23 |
0,65±0,2** |
0,7±0,36 |
0,99±0,15* |
|
В-лимфоциты, % |
33,4±6,91 |
26,6±4,56** |
41,2±7,29 |
29,8±4,76 |
|
В-лимфоциты, тыс/мкл |
1,65±0,55 |
1,17±0,17** |
1,24±0,51 |
1,0±0,21 |
|
Цитотоксические Т-лимфоциты, % |
31,8±7,01 |
26,6±6,58 |
47,6±6,58* |
38,0±2,92*** |
|
Цитотоксические Т-лимфоциты, тыс/мкл |
1,59±0,6 |
1,18±0,31 |
1,36±0,35 |
1,29±0,24 |
|
ЛКБ-тест, у.е. |
2,01±0,24 |
1,95±0,06 |
2,09±0,36 |
2,24±0,1** |
|
Спонтанный НСТ-тест ,у.е.оп.пл |
0,18±0,09 |
0,24±0,07 |
0,13±0,06 |
0,12±0,02* |
|
А/ген НСТ-тест ,у.е.оп.пл |
0,16±0,05 |
0,29±0,11 |
0,11±0,01* |
0,4±0,16** |
|
К ст. НСТ |
0,92±0,17 |
1,3±0,52 |
0,91±0,28 |
3,44±1,47*** |
|
ЦИК, у.е. |
25,0±8,06 |
22,8±4,92 |
20,8±4,87 |
25,0±4,18 |
Примечание: * – уровень значимости по отношению к группе контроля; ** – уровень значимости в сравнении с фоновыми показателями; *** – уровень значимости по отношению к фоновым показателям и показателям контрольной группы
У телят контрольной группы (здоровые телята) среднее количество лейкоцитов в крови было выше на 16 %, чем у телят опытной группы. При этом курсовое введение симбиотика не оказывало влияния на их содержание через 7 сут. Абсолютное число лимфоцитов у телят опытной группы перед началом лечения было достоверно снижено на 40 % (р ≤ 0,05) по сравнению с аналогичным показателем крови телят контрольной группы. Через 7 сут ежедневного применения БАКМП «Симбион-Д» отмечали тенденцию к повышению абсолютного количества лимфоцитов на 15 % по сравнению с фоновыми показателями. Аналогичную закономерность отмечали при анализе относительного содержания лимфоцитов у телят опытной группы. У телят контрольной группы через 7 сут после начала эксперимента отмечали снижение числа Т-лимфоцитов на 17 %.
У телят опытной группы, наоборот, регистрировали достоверное повышение данного показателя на 52 % (р ≤ 0,05) по сравнению с группой контроля. Фоновое относительное количество цитотоксических Т-лимфоцитов у телят опытной группы было достоверно выше на 50 % (р ≤ 0,05) по сравнению с показателем группы контроля. Пероральное применение БАКМП «Симбион-Д» в течение семи дней способствовало достоверному снижению данного показателя на 20 % (р≤0,05) по сравнению с фоном. Абсолютные значения концентрации цитотоксических Т-лимфоцитов не имели статистически значимой разницы между экспериментальными группами. Подобную закономерность регистрировали при анализе содержания абсолютного количества В-лимфоцитов в крови телят обеих экспериментальных групп. Относительное количество В-лимфоцитов в течение экспериментального периода имело тенденцию к понижению у телят контрольной группы на 20 % и телят опытной группы на 28 %. Относительное количество нейтрофилов у телят экспериментальных групп не имело статистически значимой разницы.
При анализе показателя ЛКБ-теста у телят контрольной группы достоверно значимой разницы между показателями фона и через семь дней после начала эксперимента установлено не было. Пероральное введение исследуемого симбиотика в течение семи дней способствовало повышению данного показателя на 7 % по сравнению с фоновыми показателями и на 14 % по сравнению с группой контроля. У больных телят отмечали снижение показателя спонтанного НСТ-теста на 28 % по сравнению с аналогичным показателем группы контроля. Показатель антигенной стимуляции нейтрофилов у телят на фоне введения БАКМП «Симбион-Д» достоверно повышается более чем в 2 раза (р ≤ 0,05). Уровень циркулирующих иммунных комплексов не имел достоверно значимой разницы между группами.
Заключение. Таким образом, ежедневное пероральное введение в течение 7 сут БАКМП «Симбион-Д» в дозе 20–30 мл на голову телятам при токсической форме диспепсии способствует нормализации кишечного микробиома, стимуляции Т-клеточного иммунитета и активации показателей неспецифической резистентности.
1. Бовкун Г.Ф., Малик Н.И. Характеристика микробиоценоза кишечника при диспепсиях у телят // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты: мат-лы междунар. конгресса. СПб., 2007. 23 с.
2. Malmuthuge N., Griebel P.J. Fetal environment and fetal intestine are sterile during the third trimester of pregnancy // Vet. Immunol. Immunopathol. 2018. 204, 59–64. DOI: 10.1016/ j.vetimm.2018.09.005.
3. The composition of the microbiota in the full-term fetal gut and amniotic fluid: A bovine cesarean section study / A. Husso [et al.] // Front. Microbiol. 2021. 12:626421. DOI:https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.626421.
4. Biogeographical differences in the influence of maternal microbial sources on the early successional development of the bovine neonatal gastrointestinal tract / C.J. Yeoman [et al.] // Sci. Rep. 2018. 8, 1–14. DOI: 10.1038/ s41598-018-21440-8.
5. Curtis T.P., Sloan W.T. Prokaryotic diversity and its limits: microbial community structure in nature and implications for microbial ecology // Curr. Opin. Microbiol. 2004. 7, 221–226. DOI:https://doi.org/10.1016/j.mib.2004.04.010.
6. Changes in metabolically active bacterial community during rumen development, and their alteration by rhubarb root powder revealed by 16S rRNA amplicon sequencing / Z. Wang [et al.] // Front Microbiol. 2017. 8:159. DOI:https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00159.
7. Малашко В.В. Молозиво. Иммуноглобулины молозива. Качество и нормы скармливания молозива новорожденным телятам: научно-практические и методические рекомендации для слушателей ФПК, студентов факультета ветеринарной медицины очной и заочной форм обучения и НИСПО. Гродно: Гродненский ГАУ, 2010. 98 с.
8. Андреева А.В., Кадырова Д.В. Иммунный статус, естественный микробиоценоз кишечника новорожденных телят и методы их коррекции: монография. Уфа: Башкирский ГАУ, 2012. 152 с.
9. Экобиотехнологические препараты для агропромышленного комплекса России / Е.Э. Школьников [и др.] // Вестник Казанского технологического университета. 2014. Т. 17, № 13. С. 255–263.
10. Антонова Г.Н., Ленченко Е.М. Изучение видового состава и чувствительности к антибиотикам бактерий, выделенных при дисбактериозах кишечника молодняка сельскохозяйственных животных // Разработка инновационных инструментальных методов исследования внутренних болезней животных. М.: МГУПП, 2015. С. 19–23.
11. Конищева А.С., В.И. Плешакова, Лещева Н.А. Микробиом кишечника телят при дисбактериозе // Вестник Омского государственного аграрного университета. 2021. № 3 (43). С. 70–77.
12. Арбузова А.А. Этиологические аспекты возникновения желудочно-кишечных заболеваний телят раннего постнатального периода // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2010. № 200. С. 11–17.
13. Современный подход к регуляции безопасности пробиотиков / А.Н. Панин [и др.] // Ветеринария. 2011. № 1. С. 41–43.
14. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. М.: Колос, 1995.
15. Гриневич Ю.А., Алферов А.Н. Определение иммунных комплексов в крови онкологически больных // Лабораторное дело. 1981. № 8. С. 493–496.
16. Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе: метод. рекомендации / В.С. Власенко [и др.]. Омск: ВНИИБТЖ Россельхозакадемии, 2010. 30 с.
